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문제 정의
- 본 연구에서는 국내 젖소로부터 분리된 B. abortus 5주와 표준균주를 공시하여 HSPs 중 면역원으로 중요한 GroES와 GroEL을 암호하는 groE 유전자에 대해 PCR을 수행하고 groE 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 비교 분석하고, 아울러 이 유전자를 E. coli에서 발현하여 얻어진 단백의 면역원성을 규명하기 위한 일련의 실험을 수행하였다.
- 본 연구에서는 국내에서 분리된 B. abortus균으로 GroE를 암호하는 groE 유전자를 PCR로 증폭하고, 염기 서열과 아미노산 서열을 규명하여 얻어진 결과를 Brucella 표준균주와 비교 분석하였으며, 아울러 이 유전자를 E. coli에 클론닝하고 GroE 단백을 발현하여 GroES 및 GroEL를 작제할 수 있는 기초를 확립하였다. BGroE primer는 groES와 groEL를 함께 증폭시킬 수 있도록 작제하였으며, BGroE(R) primer에는 NcoI 인식 부위를 만들어 pET-29a plasmid vector에 groE를 효과적으로 재조합할 수 있도록 하였다.
가설 설정
- a) The mice were immunized with the lysate of E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE mixed with incomplete Freund’s adjuvants.
- c) Dilution rates of the pooled sera of 10 mice. The experiments were triplicated.
제안 방법
- (2) 국내 분리균주의 gmES 및 groEL 유전자의 염기서열을 밝히고, 분리균주와 B. abortus S19 및 B. abortus lambda-2001와 비교 분석하였다. 그 결과 GroES는 염기 서열과 아미노산 서열이 100% 일치하였으며, GroEL은 염기서열이 99.
- B. abortus균의 방어면역에 작용하는 heat shock protein의 일종인 GroE를 암호하는 groE(gorEL/groES) 유전자를 PCR법으로 증폭하고, 염기서열과 아미노산 서열을 규명하여 Brucella 표준균주와 국내 분리주 간의 상동성을 비교 분석하였다. 또한 groE를 E.
- coli에 클론닝하고 GroE 단백을 발현하여 GroES 및 GroEL를 작제할 수 있는 기초를 확립하였다. BGroE primer는 groES와 groEL를 함께 증폭시킬 수 있도록 작제하였으며, BGroE(R) primer에는 NcoI 인식 부위를 만들어 pET-29a plasmid vector에 groE를 효과적으로 재조합할 수 있도록 하였다. PCR 시험에서 표준균주와 분리균주 모두 2,077 bp의 특이 DNA 절편이 증폭됨을 확인할 수 있었다.
- (Korea)에 위탁하여 수행하였다. Clone Manager 6, version 6.00(Scientific & Educational Software, USA)를 이용하여 핵염기서열로부터 아미노산 서열을 결정하였으며, GenBank에서 얻어진 자료와 multialign에 의해 B. abortus 분리주의 groES와 groEL 유전자 염기서열을 B. abortus S19(Accession# M82975), B. abortus lambda-2001(Accession# M83930) 및 E. coli(Accession# X07850)와 비교 분석하였다.
- Insert DNA는 BGroE(F)와 BGroE(R) primers를 이용하여 증폭한 후 정제한 KB4 주의 PCR 증폭 DNA를 사용하였다. Cloning vector로는 pET-29a plasmid vector(Novagen, USA) 를 공시하였으며, groE 유전자를 클론닝하기 위해 NcoI (TaKaRa, Japan)으로 처리하여 linear vector로 만들고 자가융합을 억제시키기 위하여 56ºC에서 1시간 calf intestine alkaline phosphatase (TaKaRa, Japan)로 처리하였다 [12, 20].
- E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE를 면역시킨 마우스 항혈청과 비특이항체를 제거한 GroE 특이항체를 공시하여 Western blot을 실시하였다. 흡수처리 안된 혈청으로 반응시킨 경우 E.
- E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE의 GroES와 GroEL 단백 발현 상태를 규명하기 위해 IPTG 유도 후 0, 0.5, 1 및 2시간에 E. coli를 수확하여 SDS-PAGE 법으로 분석하였다. 그 결과 유도 후 0.
- pGEM-T vector에 PCR 증폭 DNA를 융합시키기 위하여 Promega protocol을 이용하였으며, 얻어진 재조합 plasmid를 pET29a-GroE라 하였다. E. coli JM109 cell (Promega, USA)과 E. coli BL21(DE3) cell(Novagen, USA)을 융합된 pGEM-T vector와 pET29a-GroE로 형질 전환하기 위해 각각 공시하였다 [12, 20]. pET29a-GroE로 형질전환된 균을 E.
- 2 ml씩 마우스(BALB/c) 피하에 접종하였고, 그 후 8일 간격으로 2회 추가 접종하였으며, 마지막 접종 후 10일째에 채혈, 혈청 분리하여 -20ºC에 보관하였다. E. coli 관련 항체 및 비특이 항체를 제거하기 위해 E. coli BL21(DE3)/pET-29a를 위와 같은 방법으로 배양하여 세포용출물을 제조하였다. 마우스 혈청(1 vol.
- Gor와 Mayfield [9] 그리고 Lin 등 [15]과 GenBank를 참고하여 groE에 대한 BGroE primer(product size: 2077 bp); BGroE(F) 5'-TAACACCA AGGGTTAACCATGGCTGA-3', BGroE(R) 5'-TTTAGTCCATGGGCG A G CTTTATGGAC-3'를 제조하였으며, BGroE(R)에는 NcoI 인식부위를 만들기 위해 T를 C로 대치하였다. 핵산증폭은 genomic DNA 2 ul에 10XEx Taq reaction buffer 5 ul, 25 mM MgCl2 10 ul, 2.
- Automated thermal cycler로 94 ºC에서 5분간 반응시킨 후, 94ºC에서 1분, 64ºC에서 1분, 72ºC에서 4분 동안 반응하는 일련의 과정을 30회 반복하였으며, 마지막으로 72ºC에서 7분간 반응시켰다 [7, 13]. PCR 증폭 DNA는 1% ethidium bromide agarose gel을 이용하여 전기영동하였고 Image analyzer(Pharmacia, Sweden)로 판독하였다 [20].
- PCR로 증폭된 DNA를 pGEM-T plasmid vector에 subcloning하고 NcoI 제한효소 처리에 의해 얻어진 2.0kb의 DNA를 pET-29a plasmid vector에 삽입하여 pET29a-GroE plasmid를 작제하였다. pET-29a plasmid vector는 강력한 T7 lac promoter를 가지고 있으며 목적 유전자를 하류에 삽입하며 E.
- abortus에서 2,077 bp 크기의 DNA 가 증폭되었다. PCR에 의해 증폭된 2,077 bp의 DNA 를 재조합한 pET29a-GroE plasmid를 작출하였고, 삽입 된 groE 유전자를 Ncol과 EcoRI 처리와 염기서열 분석 을 통해 확인하였으며, 형질전환된 E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE를 작제하였다.
- Sambrook 와 Russell [20]의 방법을 응용하여 수행하였으며, Subcloning vector로는 pGEM-T vector(Promega, USA)를 사용하였다. Insert DNA는 BGroE(F)와 BGroE(R) primers를 이용하여 증폭한 후 정제한 KB4 주의 PCR 증폭 DNA를 사용하였다.
- abortus(biovar 1를 참조균으로 공시하였다. 공시균은 Brucella broth(Difco, USA)와 Brucella agar(Difco, USA)를 이용하여 10% CO2 배양기(ºC]에서 3~5일 배양하였다.
- 0)로 1 회 세척하고 재부유시킨 균액을 -20ºC에서 18시간 정치하였다. 균액을 4, 000g에서 3분간 원침한 후 침전물을 300 ul의 Single-detergent lysis buffer [50 mM Tris-Cl(pH8.0), 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, 1% Triton X 100 또는 1% NP-40]에 부유한 다음 37ºC에서 10분간 반응하였으며, 10% SDS 용액 150 ul를 첨가하여 실온에서 10분간 처리하였다. Phenol/chloroform/isoamyl alcohol(P/C/I)를 동량 가하여 상층액을 취하고 100% 에탄올과 1/10배의 3M NaOAC(pH 5.
- 05%(v/v) Tween 20] 로 5 분간 3 회 세척하였다. 그 다음 준비된 특이항체로 37ºC 에서 1시간 반응시킨 후 위와 같은 방법으로 세척하고, goat anti mouse IgG HRP conjugate(Sigma, USA)를 1시간 반응시켰다. 그리고 다시 세척한 후 DAB substrate (5 ml)와 1분간 반응한 후 멸균증류수를 이용하여 세척하였다.
- coli BL2(DE3)를 카나마이신(50 µg/ml)이 첨가된 LB agar에 도말 접종하여 2〜3 mm의 집락을 1개 선택하여 카나마이신(50 ug/ml)이 첨가된 LB broth 1 ml에 접종한 후 37ºC에서 하룻밤 배양하였다. 다시 카나마이신이 첨가된 LB broth 10ml에 배양된 균액 50 µl를 접종하고 37ºC에서 교반(200〜250 rpm) 배양하면서 UV-분광광도계(흡광도 600nm)에서 OD 0.6이 되면 배양액 1ml를 1.5 ml 시험관에 채취하여 4ºC에 보관하였고, 남은 배양액에 IPTG 1.0mM이 되도록 첨가하여 37ºC에서 교반 배양하면서 0.5시간, 1시간 및 2시간 간격으로 1 ml의 배양액을 각각 채취하여 4ºC에 보관하였다.
- coli BL21(DE3) 염색체에 도입되어 있고 lacUV5 promoter의 하류에 위치하고 있 어서 IPTG의 첨가에 의한 유도로 발현을 조절할 수 있 도록 설계되어 있다. 또한 multicloning site의 NcoI 인식 부위가 methionine을 암호하는 개시 codon과 일치하기 때 문에 불필요한 아미노산이 발현되지 않는 장점을 가지 고 있으므로 본 시험에 이용하였다. 또한 groES와 groEL은 90 bp 정도의 거리를 두고 있으며 각각 개시 codon과 종말 codon을 가지고 있다 [9, 15].
- 본 시험에서 297bp의 groES와 1,641 bp 크기의 groEL의 염기서열을 밝히고, 분리균주와 B. abortus S19 및 B. abortus lambda-2001와 비교 분석하였다. 그 결과 strain간 GroES와 GroEL의 염기 및 아미노산 서열은 높은 상동성과 유전적 보존성이 확인되었다(Figs.
- Tris-glycine electrophoresis buffer를 사용하여 80 V에서 30분간 전처리 한 후 시료를 넣고 150 V에서 2시간 정도 전기영동 하였다. 분자량을 측정하기 위해 pre-stained protein ladder (10 kDa - 190 kDa, Invitrogen, USA)를 사용하였고 전기영동이 완료된 겔을 때어내 염색액 [Coomassie brilliant blue R-250 0.25 g, methanol 50 ml, H2O 40 ml, acetic acid 10 ml]에 1시간 염색한 후 탈염색액 [methanol 30%, H2O 60%, acetic acid 10%]으로 탈색시켜 관찰하였다 [20].
- 이를 멸균식염수로 3회 세척한 후 초음파분쇄기 (Sonics, USA)에서 60% 동력으로 10분간 처리를 하여 세포용출물을 작제하였다. 세포용출물과 incomplete Freund's adjuvant(Sigma, USA)를 1:1의 비율로 혼합한 것을 0.2 ml씩 마우스(BALB/c) 피하에 접종하였고, 그 후 8일 간격으로 2회 추가 접종하였으며, 마지막 접종 후 10일째에 채혈, 혈청 분리하여 -20ºC에 보관하였다. E.
- 2 um syringe filter로 여과하였다. 얻어진 특이항혈청은 Western blot 시험에 공시하였으며, 또한 이 혈청에 대해 B. abortus 시험관 응집반응 진단액(국립수의과학검역원)을 이용한 항체검사와 Western blot 시험으로 발현된 GroE 단백의 면역 원성을 측정하였다.
- coli BL21(DE3)/pET29a-GroE를 카나마이신(50 µg/ml)이 첨가된 LB broth(5 ml)에서 진탕 배양한 후 IPTG를 1 mM이 되도록 첨가하고 37ºC 에서 2시간 진탕 배양하였다. 이를 멸균식염수로 3회 세척한 후 초음파분쇄기 (Sonics, USA)에서 60% 동력으로 10분간 처리를 하여 세포용출물을 작제하였다. 세포용출물과 incomplete Freund's adjuvant(Sigma, USA)를 1:1의 비율로 혼합한 것을 0.
- 채취된 배양액을 실온에서 12,000 g로 1분간 원심 침전하고 상층액을 제거한 후 1XSDS gel-loading buffer [50 mM Tris-Cl(pH 6.8), 100 mM dithiothreitol, 2%(w/v) SDS, 0.1% bromophenol blue, 10%(v/v) glycerol] 100 ul를 첨가하여 100ºC 에서 3 분간 끓인 후 12, 000 g로 10분간 원심분리하여 얻은 상층액을 시험하였다. Tris-glycine electrophoresis buffer를 사용하여 80 V에서 30분간 전처리 한 후 시료를 넣고 150 V에서 2시간 정도 전기영동 하였다.
- Gor와 Mayfield [9] 그리고 Lin 등 [15]과 GenBank를 참고하여 groE에 대한 BGroE primer(product size: 2077 bp); BGroE(F) 5'-TAACACCA AGGGTTAACCATGGCTGA-3', BGroE(R) 5'-TTTAGTCCATGGGCG A G CTTTATGGAC-3'를 제조하였으며, BGroE(R)에는 NcoI 인식부위를 만들기 위해 T를 C로 대치하였다. 핵산증폭은 genomic DNA 2 ul에 10XEx Taq reaction buffer 5 ul, 25 mM MgCl2 10 ul, 2.5 mM dNTPs 4ul, BGroE(F)와 BGroE(R) primer 각각 1 ul(100 pmol/ul)와 멸균증류수 26 ul를 첨가하고 Ex Taq polymerase(TaKaRa, Japan) 1 ul (1.25 unit/ul)를 가하여 총 50 ul가 되도록 한 후 잘 혼합하였다. Automated thermal cycler로 94 ºC에서 5분간 반응시킨 후, 94ºC에서 1분, 64ºC에서 1분, 72ºC에서 4분 동안 반응하는 일련의 과정을 30회 반복하였으며, 마지막으로 72ºC에서 7분간 반응시켰다 [7, 13].
대상 데이터
- Roop 등 [19]의 방법을 응용하여 수행하였다. E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE를 카나마이신(50 µg/ml)이 첨가된 LB broth(5 ml)에서 진탕 배양한 후 IPTG를 1 mM이 되도록 첨가하고 37ºC 에서 2시간 진탕 배양하였다. 이를 멸균식염수로 3회 세척한 후 초음파분쇄기 (Sonics, USA)에서 60% 동력으로 10분간 처리를 하여 세포용출물을 작제하였다.
- Sambrook 와 Russell [20]의 방법을 응용하여 수행하였으며, Subcloning vector로는 pGEM-T vector(Promega, USA)를 사용하였다. Insert DNA는 BGroE(F)와 BGroE(R) primers를 이용하여 증폭한 후 정제한 KB4 주의 PCR 증폭 DNA를 사용하였다. Cloning vector로는 pET-29a plasmid vector(Novagen, USA) 를 공시하였으며, groE 유전자를 클론닝하기 위해 NcoI (TaKaRa, Japan)으로 처리하여 linear vector로 만들고 자가융합을 억제시키기 위하여 56ºC에서 1시간 calf intestine alkaline phosphatase (TaKaRa, Japan)로 처리하였다 [12, 20].
- XCell II Blot Module(Invitrogen, USA)과 DAB substrate kit(Vector, USA)를 이용하였다. SDS-PAGE가 완료된 겔과 니트로셀루로즈막(Osmonics, USA)과 블로팅 판을 설치하고 25 V로 3시간 블로팅한 후, 니트로 셀루로즈막을 꺼내어 blocking solution [10mM Tris-Cl(pH 8.
- pGEM-T vector를 이용하여 groE 유전자를 클론닝한 plasmid DNA를 사용하였으며 Complement sequence를 위해 primers는 M13(F), M13(R)와 Clone Manager 6, version 6.00(Scientific & Educational Software, USA)를 이용하여 합성한 GroEseqF1, GroEseqR1, GroEseqF2, GroEseqR2, GroEseqF3, GroEseqR3를 사용하였다 (Table 1). 염기서열 분석은 Macrogen Ltd.
- 국내에서 부루셀라 항체 양성으로 판정되어 살처분된 젖소의 유방상 림프절 및 우유로부터 분리되어 biovar 1으로 동정된 5주의 B. abortus KB4, KB5, KB6, KB7 및 KB8 주와 [13], 미국(National Animal Disease Center, NADC로부터 분양 받은 B. abortus(biovar 1를 참조균으로 공시하였다. 공시균은 Brucella broth(Difco, USA)와 Brucella agar(Difco, USA)를 이용하여 10% CO2 배양기(ºC]에서 3~5일 배양하였다.
이론/모형
- pGEM-T vector에 PCR 증폭 DNA를 융합시키기 위하여 Promega protocol을 이용하였으며, 얻어진 재조합 plasmid를 pET29a-GroE라 하였다. E.
성능/효과
- (1) BGroE primers를 이용하여 PCR을 수행한 바, 공 시한 참조균주 B. abortus(biovar 1)와 B. abortus RB51 그리고 5주의 국내분리 B. abortus에서 2,077 bp 크기의 DNA 가 증폭되었다. PCR에 의해 증폭된 2,077 bp의 DNA 를 재조합한 pET29a-GroE plasmid를 작출하였고, 삽입 된 groE 유전자를 Ncol과 EcoRI 처리와 염기서열 분석 을 통해 확인하였으며, 형질전환된 E.
- (3) SDS-PAGE와 Western blot법으로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE에서 GroES와 GroEL 단백 으로 인정되는 약 10 kDa과 60 kDa의 밴드가 확인되었 으며, 발현도는 IPTG로 유도한 후 1~2시간째에 가장 높 았다. E.
- BGroE primer를 이용하여 B. abortus(biotype 1) 및 5주의 국내분리 B. abortus균 그리고 B. abortus RB51 주의 DNA 추출물에 대해 PCR을 실시하였던 바, 참조균주 및 분리주 모두 2,077 bp 의 특이 밴드가 관찰되었다 (Fig. 1).
- 2). GroEL은 국내분리균주와 B. abortus S19 및 B. abortus lambda-2001와 비교에서 98.0〜100%의 높은 상동성을 나타냈다. 또한 E.
- GroE를 구성하는 groES(297 bp)와 groEL(1,641 bp)의 염기서열을 국내분리균 5주와 B. abortus S19 및 B. abortus lambda-2001를 비교하였던 바, groES 염기서열은 7주 모두 완전 일치(100%)하였고 E. coli와는 59.9%의 상동성을 나타내었다. grog 국내분리균 5주와 B.
- BGroE primer는 groES와 groEL를 함께 증폭시킬 수 있도록 작제하였으며, BGroE(R) primer에는 NcoI 인식 부위를 만들어 pET-29a plasmid vector에 groE를 효과적으로 재조합할 수 있도록 하였다. PCR 시험에서 표준균주와 분리균주 모두 2,077 bp의 특이 DNA 절편이 증폭됨을 확인할 수 있었다.
- 1%의 상동성을 나타내었다 (Table 2). groES와 groEL의 염기서열을 기초로 하여 10kDa GroES를 구성하는 98개의 아미노산 서열과 60 kDa GroEL을 구성하는 546개의 아미노산 서열을 결정하여 비교하였던 바(Fig. 2 및 3), GroES는 B. abortus S19, B. abortus lambda-2001 및 분리균주 모두 100% 일치하였다(Fig. 2). GroEL은 국내분리균주와 B.
- pET29a-GroE plasmid로 형질전환된 E. coli BL21 (DE3)/pET29a-GroE를 배양하고 IPTG로 유도한 후 얻어 진 세포배양액에 대해 SDS-PAGE와 Western blot를 수 행하여, GroES 와 GroEL이 강하게 발현되는 것을 확인 할 수 있었고, IPTG 유도 후 1~2시간이 적정 발현시간으로 판단되었다. SDS-PAGE에서 10kDa 인 GroES가 13 kDa 정도로 약간 크게 나타난 것은 plasmid vector에 있는 S.
- pET29a-GroE plasmid를 NcoI과 EcoRI 제한효소로 처리하여 1% agarose gel에 전기영동하여 2.0 kb와 1.7 kb 크기의 증폭된 DNA 밴드가 관찰되어 groE 유전자의 조합 상태를 확인하였으며, T7 promoter primer (5'- TAATACGACTCACTATAGG-3')를 이용하여 염기서열 분석 결과 NcoI 인식부위에 정확히 삽입된 것이 검증되었다
- abortus lambda-2001와 비교 분석하였다. 그 결과 GroES는 염기 서열과 아미노산 서열이 100% 일치하였으며, GroEL은 염기서열이 99.0-99.9%, 아미노산 서열이 98.0~100%로 높은 상동성을 나타내었다.
- abortus lambda-2001와 비교 분석하였다. 그 결과 strain간 GroES와 GroEL의 염기 및 아미노산 서열은 높은 상동성과 유전적 보존성이 확인되었다(Figs. 2, 3 및 Table2). 또한 E.
- coli를 수확하여 SDS-PAGE 법으로 분석하였다. 그 결과 유도 후 0.5, 1 및 2시간 배양한 모든 E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE에서 GroES와 GroEL 단백으로 추정되는 13 kDa과 60 kDa 크기의 밴드가 각각 관찰되었다. 대조군으로 공시한 E.
- 5 및 6). 또한 마우스에 E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE를 접종하여 얻어진 혈청에서 높은 수준의 GroES와 GroEL 항체가 Western blot에서 확인되어 E. coli BL21(DE3)/pET29a-GroE가 효과적으로 GroE 단백을 발 현한다는 사실을 확인할 수 있었다. 그러나 소부루셀라증 시험관응집반응용 항원에 대해서는 항체가가 전혀 인정되지 않았다(Table 3).
후속연구
- abortus lipopolysaccharides의 O side chain 항원에서 유발되는 응집항체 문제와 백신과 야외감염에 기인된 항체를 감별 할 수 있는 가능한 대안적 항원이라고 제시한 선행 연 구들과 관련성이 있다고 생각된다 [2, 18, 19, 22]. GroE 단백을 보다 효과적으로 발현하고 정제할 수 있는 시스템을 구축하고, GroE의 항원성과 면역방어기전에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- pBR322 또는 pUC plasmid에서 파생된 expression vector에서는 하나의 origin으로 GroES와 GroEL과 같은 chaperon을 동시에 발현시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며, pET-29a plasmid vector도 GroES와 GroEL을 동시에 발현시킬 수 있다[10]. 그러나 추후 정제 및 발현의 효능을 높이기 위해 pMal vector를 이용하거나 [14], 진핵세포 [1, 14]를 이용 한 GroEL 의 발현에 대한 연구를 수행해야 한다고 생각 된다.
- Tag 과 fusion protein 이 발현되었기 때문이라 생 각되었다. 이들 S.Tag 과 fusion protein은 발현된 단백을 정제하거나 Western blot으로 검색할 경우 반응성을 높 이는데 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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