[논문]SRY와 Amelogenin gene의 증폭에 의한 말의 성(sex) 결정 예

조길재; 이선영; 양영진

SRY와 Amelogenin gene의 증폭에 의한 말의 성(sex) 결정 예
A case of sex determination by amplification of SRY and Amelogenin gene in horse 원문보기

大韓獸醫學會誌 = Korean journal of veterinary research, v.45 no.1 = no.118, 2005년, pp.127 - 130

조길재 (한국마사회 유전자검사실) , 이선영 (한국마사회 유전자검사실) , 양영진 (한국마사회 유전자검사실)

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The objective of present study was to ascertain sex determination for individual identification, parentage control, and sex chromosome anomalies in horse. PCR amplification products of the equine sex determining region of the Y chromosome gene (SRY) and amelogenin gene (AMEL) were detected by using agarose gel electrophoresis. A normal sire and foal II showed 1 SRY band (430 bp) and 3 AMEL (AMELX, AMELY, and AMELX/Y) band, 175 bp, 160 bp, 190 bp, respectively, and a normal dam and foal I showed a single AMELX band (175 bp). These results enables a quick diagnosis for sex determination prior to cytogenetic analysis.

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문제 정의

국내산 말의 혈통등록을 위한 친자감정의 효율을 높 임과 동시에 친자감정시 문제시 되는 marker의 분석에 유용한 기초자료를 확보하고자 더러브렛 말을 대상으로 microsatellite marker LEX3의 분석 및 Y염색체 성결정 영역유전자와 Amelogenin 유전자를 이용하여 말의 성결 정에 관한 결과를 보고하는 바이다.

제안 방법

Micro satellite LEX3 marker를 이용한 국내산 더러브렛의 친자감정에서 문제시 된 6두의 말을 대상으로 성(sex)을 결정하고자 SRY와 Amelogenin gene을 증폭하여 얻은 결론은 다음과 같다.
실험에 이용한 primer의 염기서열은 Table 1에 나타내었다. PCRe GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 행하였다. 먼저 microsatellite marker LEX3은 12.
5 (Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 대립유전자를 분석한 후 친자감정을 실시하였다 [1]. SRY와 Amelogenin 유전자의 분석을 위한 PCRe 30 ng의 template DNA와 각각의 primer 30 pm이을 12.5 ul의 premix PCR buffer (ABgene, USA)에 혼합하여 total volume을 50ul로 조정한 후 먼저 94oC 에서 5분간 가열하여 변성을 유도하고 94oC 에서 60초간 denaturation, 68oC에서 30초간의 annealing 과 extension의 2단계로 35회 반복하였으며 PCR 후 DNA product는 4% agarose gel에 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다 [8].
PCRe GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 행하였다. 먼저 microsatellite marker LEX3은 12.5 ul의 premix PCR bufier (ABgene, USA)와 50 ng의 template DNA를 혼합하여 total volume 25 ul로 조정한 후 95oC에서 10분간 가열 하여 변성을 유도하고 95oC에서 30초간 denaturation, 60oC에서 1분간의 annealing 그리고 72oC에서 1분간의 extension의 3단계로 30회 반복하였고 72oC에서 60 분간 extension을 실시하였다. 증폭된 DNA는 유전자형자동분석기 (Perkin-Elmer ABI Prism 310 Genetic Analyzer, USA)에 의해 전기영동하고 검출된 각 유전자좌의 대립 유전자는 GeneScan Vr.
5 ul의 premix PCR bufier (ABgene, USA)와 50 ng의 template DNA를 혼합하여 total volume 25 ul로 조정한 후 95oC에서 10분간 가열 하여 변성을 유도하고 95oC에서 30초간 denaturation, 60oC에서 1분간의 annealing 그리고 72oC에서 1분간의 extension의 3단계로 30회 반복하였고 72oC에서 60 분간 extension을 실시하였다. 증폭된 DNA는 유전자형자동분석기 (Perkin-Elmer ABI Prism 310 Genetic Analyzer, USA)에 의해 전기영동하고 검출된 각 유전자좌의 대립 유전자는 GeneScan Vr.2.1 (Perkin-Elmer)과 Genotyper Ver.2.5 (Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 대립유전자를 분석한 후 친자감정을 실시하였다 [1]. SRY와 Amelogenin 유전자의 분석을 위한 PCRe 30 ng의 template DNA와 각각의 primer 30 pm이을 12.

대상 데이터

국내에서 사육중인 더러브렛 말 6두의 갈기나 꼬리로 부터 채취한 모근을 이용하여 DNA를 추출 정제하여 공 시재료로 이용하였다. Genomic DNA의 추출은 Tozaki 등의 방법 [12]을 응용하였다.

이론/모형

국내에서 사육중인 더러브렛 말 6두의 갈기나 꼬리로 부터 채취한 모근을 이용하여 DNA를 추출 정제하여 공 시재료로 이용하였다. Genomic DNA의 추출은 Tozaki 등의 방법 [12]을 응용하였다. 5개의 hair roots와 lysis buffer 200 ul, protenase K (20mg/ml) 1.

성능/효과

SRY gene 과 Amelogenin gene을 증폭하여 분석한 결과 망아지 I의 성(sex)은 암(female)말, 망아지 Ⅱ는 숫 (male) 말로 확인되었다
SRY gene과 Amelogenin gene과 증폭하여 분석한 결과 망아지 I의 성(sex)은 암(female)말, 망아지 Ⅱ는 숫(male)말로 확인되었다.
또, Abe 등 [3] 이 씨수말에서 band(214bp) 1개를 검출하였으나 씨암말과 XY씨암말에서는 SRY gene의 band가 검출되지 않았다고 보고한 성적과 본 연구의 결과는 유사함이 확 인되었다. SRY gene과 Amelogenin gene을 증폭하여 분석한 본 연구의 결과 망아지 I의 성(sex)은 암(female) 말, 망아지 Ⅱ는 숫(male)말로 확인되어 LEX3 marker는 X염색체와 link된 것으로 추정되며 추가마커에 대한 검사 결과 멘델의 유전법칙에 부합되어 친자감정에도 아무런 문제가 없는 것으로 사료된다.
말의 개체식별이나 친자감정시 문제될 수 있는 LEX3 marker는 멘델의 유전법칙에 어긋날 경우 실제로 생산자나 등록기관에 문의하여 성(sex)을 알고 있어야만 친자감 정시 오류를 최소화할 수 있을 것이다. 국내산 망아지의 친자감정에서 나타난 LEX3 marker의 문제점을 해결하고자 그 말을 대상으로 SRY gene 과 Amelogenin gene 의 증폭에 의한 성(sex)을 분석한 결과 SRY gene은 씨암 말과 망아지 I에서는 아무것도 관찰되지 않았으나 씨수 말과 망아지 II에서 430bp(Y염색체) band 1개가 관찰 되었다.

후속연구

국내에서 번식말로 활용되고 있는 더러브렛에서 염색체의 이상에 관한 보고는 아직 없으나 앞으로 염색체와 관련된 연구와 더 러브렛을 포함한 제주말의 개체식별이나 친자감정시에 본 연구결과를 활용하면 좋을 것으로 사료된다.

참고문헌 (12)

조길재. Microsatellite DNA형 분석을 이용한 더러브렛 말의 친자감정. 한국동물자원과학회지 2004, 46, 129-136

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조길재, 김봉환, 더러브렛 말의 혈액형에 관한 연구. 대한수의학회지 2000, 40, 683-689

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Abe S, Miyake YI, Kageyama SI, Watanabe G, Taya K, Kawakura K. Deletion of the Sry region on the Y chromosome detected in a case of equine gonadal hypoplasia (XY female) with abnormal hormonal profiles. Equine Vet J 1999, 31, 336-338

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Dimsoski P. Development of a 17-plex microsatellite polymerase chain reaction kit for genetyping horses. Croat Med J 2003, 44, 332-335
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Tozaki T. Characterization of equine microsatellites and repetitive elements, and validation of paternity testing for Thoroughbreds. A. Ph. D. Dissertation. Showa University, Japan, 2001
Tozaki T, Kakoi H, Mashima S, Hirota KI, Hasegawa T, Ishida N, Miura N, Choi-Miura NH, Tomita M. Population study and validation of paternity testing for Thoroughbred horses by 15 microsatellite loci. J Vet Med Sci 2001, 63, 1191-1197

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