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문제 정의
- 본 연구에서는 식중독 유발세균에 대한 항균 활성이 우수한 천연 항균성 물질을 검색하기 위해 예로부터 민간과 한방에서 널리 이용되어 온 선학초를 각종 유기용매로 추출하여 식중독 유발세균에 대한 항균 활성을 조사해 보았다. 선학초를 methanol로 추출한 후, petroleum ether, chloroform, ethyl acetate를 이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통분획하고, 수용성 추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발 세균 (Staphylococcus Aureus, Bacillus Cereus, Salmonella En- teritidis, Shigella Flexneri, Escherichia Coli, Salmonella Typhimurium, Shigella Dysenteriae, Pseudomonas Ar- uginosa, Shigella Sonnei) 에 대하여 항균 효과를 조사하였다.
- 'a 또한 한약재 추출물, 이나 기타 향 신료 추출물劫을 이용한 항균력 검증 결과 등 도 발표된 바 있다. 본 연구에서는 우리나라에서 오래전부터 널리 한약 재료로 사용되어 온 선학 초 추출물을 사용하여 이들이 식중독 유발세균의 증식에 미치는 영향을 검증해보고자 하였다.
제안 방법
- 선학초의 petroleum ether추출물을 membrane filter (0.2 "m, pore size. Toyoroshi kaisha.Ltd.Japan) 로 제균시키고, 액체 배지에 각 추출물을 1,000 ppm, 2,000 ppm, 및 4, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.
- 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료수에 맞게 올리고 밀착시킨 훅선학초의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 수용성추출물을 70% ethanol에 각각 250 ppm, 500 ppm 및 1,000 ppm 농도로 희석하여 20 “1씩 천천히 흡수시켰다. Control로 선 학초 추출물이 들어있지 않은 70% eth- anol을 실험군과 동일한 방법으로 점적하였다. 준비된 모든 plate는 37t: 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone (mm)의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
- 건조시킨 선학 초 500 g에 대해선학초 중량의 2배 분량인 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, meth- anol을 사용하여 항균성 물질을 추출하였다. 추 출관에 마쇄시킨 선학초를 넣고 1 1의 methanol을 넣은 후 실온에서 6시간 방치한 훅, Whatman No.
- Japan)를 사용하여 45 ℃ 에서 감압. 농축하였으며 농축한 methanol 추출물은 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate 및methanol을 각각 사용하여 용매 계통분획 하였다. 이때 methanol 추출물과 각종 유기용매를 분별 깔대기에 넣고 5분간 수작업으로 흔들어 혼합한 후, 15분간 실온에 방치시킨 후 분리하였다.
- 본 연구에서는 식중독 유발세균에 대한 항균 활성이 우수한 천연 항균성 물질을 검색하기 위해 예로부터 민간과 한방에서 널리 이용되어 온 선학초를 각종 유기용매로 추출하여 식중독 유발세균에 대한 항균 활성을 조사해 보았다. 선학초를 methanol로 추출한 후, petroleum ether, chloroform, ethyl acetate를 이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통분획하고, 수용성 추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발 세균 (Staphylococcus Aureus, Bacillus Cereus, Salmonella En- teritidis, Shigella Flexneri, Escherichia Coli, Salmonella Typhimurium, Shigella Dysenteriae, Pseudomonas Ar- uginosa, Shigella Sonnei) 에 대하여 항균 효과를 조사하였다.선학초 추출물의 농도별 항균 활성검색에서는 선학초 의 petroleum ehter 추출물이 가장 큰 항균효과를 보였으며 Pseudomonas Aruginosa가 가장 민감하게 반응하는 균주였다.
- 선학초의 petroleum ether 추출물을 농도별로 (0, 1,000, 2,000 및 4, 000 ppm) TSB배지에 첨가하고, Gram 양성균인 Bacillus Cereus와 Gram 음성균인 Salmonella En- teritidis에 각각 접종시켜 72시간 배양하면서 일정 시간 간격으로 균주의 성장 정도를 측정해본 바, Fig. 2 및 Fig. 3와 같은 증식 곡선을 얻을 수 있었다. Bacillus Cer- eus의 경우, 선학초의 petroleum ehter 추출물을 첨가하지 않은 대조구의 경우 배양 후 12시간 후부터 급속한 균의 증식을 볼 수 있었고, 4, 000 ppm 농도를 첨가하였을 경우 균의 증식이 완만하게 이루어져 균의 성장이 24시간까지 억제됨을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 이때 methanol 추출물과 각종 유기용매를 분별 깔대기에 넣고 5분간 수작업으로 흔들어 혼합한 후, 15분간 실온에 방치시킨 후 분리하였다. 선학초의 수용성 추출물은 유기용매로 추출하고 남은 잔사에 1차 증류수를 넣고 103C에서 30분간 끓인 후 동일한 방법으로 여과하였다. 여과된 용액은 감압농축기(EYELA, N-N.
- Japan) 로 제균시키고, 액체 배지에 각 추출물을 1,000 ppm, 2,000 ppm, 및 4, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.D. 값을 0.4로 맞춘 세균 배양액을 109배로 희석하고 무균적으로 접종하여 37℃에서 72시간 배양한 후, 12시간마다 세균 배 양액의 증식 정도를 620 nm , spectrophotometer에서 측정하였다.的
- 4로 흡광도를 조절하고, 각 균주 150 “1를 petri dish에 붓고 여기에 멸균된 Tryptic Soy Agar (TSA) 배지 8 ml를 분주하여 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 굳혔다. 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료수에 맞게 올리고 밀착시킨 훅선학초의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 수용성추출물을 70% ethanol에 각각 250 ppm, 500 ppm 및 1,000 ppm 농도로 희석하여 20 “1씩 천천히 흡수시켰다. Control로 선 학초 추출물이 들어있지 않은 70% eth- anol을 실험군과 동일한 방법으로 점적하였다.
- Control로 선 학초 추출물이 들어있지 않은 70% eth- anol을 실험군과 동일한 방법으로 점적하였다. 준비된 모든 plate는 37t: 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone (mm)의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
- 항균성 물질을 검색하기 위해 본 실험에서는 paper disc 방법을 사용하였다尸> Tryptic Soy Broth (TSB) 배지에 배양한 세균을 spectrophotometer (Nontron instruments Italy) 620 run에서 O.D. 값 0.4로 흡광도를 조절하고, 각 균주 150 “1를 petri dish에 붓고 여기에 멸균된 Tryptic Soy Agar (TSA) 배지 8 ml를 분주하여 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 굳혔다. 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료수에 맞게 올리고 밀착시킨 훅선학초의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 수용성추출물을 70% ethanol에 각각 250 ppm, 500 ppm 및 1,000 ppm 농도로 희석하여 20 “1씩 천천히 흡수시켰다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 선학초 (仙鶴草, Agrimonia pilosa Ledeb.)는 한국산으로, 대구광역시 중국 남성로 약령시장에서 2002년 7월에 건조상태의 것을 구입하여 불순물을 제거하기 위해 가볍게 2번수세하여 실온에서 건조시킨 후, 막자사발에서 유리봉으로 미세하게 마쇄한 후 추출용 시료로 사용하였다.
- 선학 초 추출물의 항균실험에 사용한 균주는 국내에서 식중독을 유발하는 것으로 널리 알려준 미생물 가운데 Gram (+)세균 2종과 Gram (-)세균 7종을 선택하여, 총 9종을 한국과학기술연구원 생명공학연구소에서 분양받아 사용하였다 (Table 1). 균의 생육 배지로는 모든 균주에 대하여 Tryptic Soy Broth (Difco, USA)를 사용하여 370, inc- ubator에서 18~24시간 배양하였다.
- 균의 생육 배지로는 모든 균주에 대하여 Tryptic Soy Broth (Difco, USA)를 사용하여 370, inc- ubator에서 18~24시간 배양하였다. 항균성 실험에 사용한 고체 배지는 Tryptic Soy Agar (Difco, USA) 였다.
성능/효과
- 건조시킨 선학 초에서 추출한 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 및 수용성 추출물은 Table 2와 같이 나타났다. 600 g의 선학 초에 대하여 3.62 g의 petroleum ether 추출물을 얻어 수율은 0.6%이었으며 ch- loroform, ethyl acetate, methanol 및 수용성 추출분획물 의 추출수율은 각각 0.5%, 0.6%, 3.1% 및 2.6%를 얻어 chloroform의 추출 수율이 가장 낮았으며, methanol 추출물의 수율이 가장 높게 나타났다.
- 3와 같은 증식 곡선을 얻을 수 있었다. Bacillus Cer- eus의 경우, 선학초의 petroleum ehter 추출물을 첨가하지 않은 대조구의 경우 배양 후 12시간 후부터 급속한 균의 증식을 볼 수 있었고, 4, 000 ppm 농도를 첨가하였을 경우 균의 증식이 완만하게 이루어져 균의 성장이 24시간까지 억제됨을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 선 학초의 petroleum ether 추출물이 Salmonella Enteritidis에 대해 미치는 생육 저해 정도를 동일한 방법으로 72시간 동안 살펴본 바 Fig.
- Paper disc 방법으로 선학초의 각종 유기용매분획물 및 수용성 추출물을 각종 식품부패균 및 식중독균에 적용시켜 항균 활성을 실험해본 바다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Gram 양성균에 대한 선학초의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 수용성추출 물의 항균활성은 Table 3와 같이 나타나 disc에 점적한선 학 초의 각종 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성이 크게 나타났다. 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 선학초의 chloroform 추출물의 경우 Bacillus Cereus에 대해 1,000 ppm 농도에서 14 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다.
- Paper disc 방법으로 선학초의 각종 유기용매분획물 및 수용성 추출물을 각종 식품부패균 및 식중독균에 적용시켜 항균 활성을 실험해본 바다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Gram 양성균에 대한 선학초의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 추출물 및 수용성추출 물의 항균활성은 Table 3와 같이 나타나 disc에 점적한선 학 초의 각종 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성이 크게 나타났다.
- 선학초의 petroleum ether 추출물과 methanol 추출물은 Bacillus Cereus에 대해 250 ppm에서는 항균성을 나타내지 않았고 500 ppm에서부터 항균력을 나타내기 시작하였다. 또 선학초의 chloroform 추출물과 ethyl acetate 추출물, 수용성 추출물은 고농도인 1,000 ppm에서만 항균 활성을 나타내었다. 예로부터 한방에서 주요한약재로 사용되고 있는 목재 수종의 대부분은 활엽수로서 이들이 포함하고 있는 추출 성분은 침엽수의 성분과 비교해볼 때, 그 종류가 다양하고 복잡하여 많은 약용 성분을 포함하고 있다.
- Shigella Dysenteriae 균에 대해서는 선학초의 petroleum ether 추출물과 chloroform 추출물 및 ethyl acetate 추출물이 1,000 ppm에서 항균 활성을 나타내었다. 또한 Salmonella Enteritidis균에 대한 항균력도 농도에 비례하여 증가함을 관찰할 수 있었다. 한편 본 실험에 사용한 선학 초 추출물의 농도가 100 ppm이 하인 경우에는 항균효과를 검증할 수 없었고, 선학초의 수용성추출물의 경우도 모든 균주에 대해 그다지 큰 항균 활 성을 나타내지 않았다.
- 선학초의 petroleum ehter 추출물과자소엽의 methanol 추출물을 혼합하여 항균력을 측정해본 결과 두 추출물을 섞어 첨가했을 경우가 단독으로 사용했을 때보다 상승효과를 나타내었다. 또한 선학초의 petroleum ehter 추출물이식중독 유발세균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Bacillus Cereus와 Salmonella Enteritidis 배양액에 선 학초의 petroleum ehter 추출물을 각각 4, 000 ppm 농도로 첨가했을 때, Bacillus Cereus의 생육이 24시간 이 상까지 억제됨을 관찰할 수 있었고, Salmonella Enteritidis 의 생육도 36시간까지 지연시킬 수 있었다. 이상의 결과 선학초의 petroleum ehter추출물은 Bacillus Cereus와 Sal- paella Enteritidis의 성장을 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 예로부터 한방에서 주요한약재로 사용되고 있는 목재 수종의 대부분은 활엽수로서 이들이 포함하고 있는 추출 성분은 침엽수의 성분과 비교해볼 때, 그 종류가 다양하고 복잡하여 많은 약용 성분을 포함하고 있다. 본 실험에 사용한 선학 초 추출물의 Gram 음성균에 대한 항균력 검색 결과는 Table 4과 같이 나타나, Pseudomonas Aerugi- nosa균에 대해선학초의 petroleum ether 추출물은 1,000 ppm 농도에서 높은 항균 활성을 나타내었다 (Fig. 1) Salmonella Enteritidis 균에 대해서도 선학초의 주출물은 모두 항균 활성을 나타내었고, petroleum ether 추출물은 높은 항균력을 보여 각 농도별로 큰 inhibition zone을 나타내었다 Shigella Sonnei 균에 대해서는 선학초의 chloroform 추출물과 ethyl acetate 추출물 및 methanol 추출물이 500 ppm에서부터 항균 활성을 나타내었다. 선학초의 methanol 추출물은 Shigella Sonnei 균에 대해 1,000 ppm에서 가장 큰 항균 효과를 나타내었다.
- 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 선학초의 chloroform 추출물의 경우 Bacillus Cereus에 대해 1,000 ppm 농도에서 14 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다. 선학 초 추출물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균 활성을 나타내, 선학 초의 petroleum ether 추출물은 Bacillus Cereus 대 해 저 농도인 250 ppm에서는 항균성을 나타내지 않았고 500 ppm에서부터 항균력을 나타내기 시작하였으며, 1,000 ppm의 고농도에서는 Staphylococcus Aureus와 Shigella Flexneri에 대해 상대적으로 큰 활성도를 나타내었다. 선학초의 petroleum ether 추출물과 methanol 추출물은 Bacillus Cereus에 대해 250 ppm에서는 항균성을 나타내지 않았고 500 ppm에서부터 항균력을 나타내기 시작하였다.
- 선학초를 methanol로 추출한 후, petroleum ether, chloroform, ethyl acetate를 이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통분획하고, 수용성 추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발 세균 (Staphylococcus Aureus, Bacillus Cereus, Salmonella En- teritidis, Shigella Flexneri, Escherichia Coli, Salmonella Typhimurium, Shigella Dysenteriae, Pseudomonas Ar- uginosa, Shigella Sonnei) 에 대하여 항균 효과를 조사하였다.선학초 추출물의 농도별 항균 활성검색에서는 선학초 의 petroleum ehter 추출물이 가장 큰 항균효과를 보였으며 Pseudomonas Aruginosa가 가장 민감하게 반응하는 균주였다.선학초의 petroleum ehter 추출물과자소엽의 methanol 추출물을 혼합하여 항균력을 측정해본 결과 두 추출물을 섞어 첨가했을 경우가 단독으로 사용했을 때보다 상승효과를 나타내었다.
- 1) Salmonella Enteritidis 균에 대해서도 선학초의 주출물은 모두 항균 활성을 나타내었고, petroleum ether 추출물은 높은 항균력을 보여 각 농도별로 큰 inhibition zone을 나타내었다 Shigella Sonnei 균에 대해서는 선학초의 chloroform 추출물과 ethyl acetate 추출물 및 methanol 추출물이 500 ppm에서부터 항균 활성을 나타내었다. 선학초의 methanol 추출물은 Shigella Sonnei 균에 대해 1,000 ppm에서 가장 큰 항균 효과를 나타내었다. Shigella Dysenteriae 균에 대해서는 선학초의 petroleum ether 추출물과 chloroform 추출물 및 ethyl acetate 추출물이 1,000 ppm에서 항균 활성을 나타내었다.
- 3과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 선학초의 petroleum ether 추출물을 넣지 않은 대조구 배지에서 배양했을 시 12시간 이후부터 급격한 증가를 보여 빠른 성장이 일어남을 관찰할 수 있었으나 선학초의 petroleum ehter 추출물1,000 ppm을 첨가했을 시부터 성장이 억제 되어 선 학초의 petroleum ehter 추출물4, 000 ppm을 첨가한 배지에서는 균의 증식이 36시간까지 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과 선학초의 petroleum ehter추출물은 Bacillus Cereus와 Sal- paella Enteritidis의 성장을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과 선학 초의 petroleum ether 추출물은 각종 식중독 유발 세균의 성장을 억제흐]는 천 연 식품 보존제 개발의 신소재로 활용될 가능성이 있음을 알 수 있었다.
- 또한 선학초의 petroleum ehter 추출물이식중독 유발세균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Bacillus Cereus와 Salmonella Enteritidis 배양액에 선 학초의 petroleum ehter 추출물을 각각 4, 000 ppm 농도로 첨가했을 때, Bacillus Cereus의 생육이 24시간 이 상까지 억제됨을 관찰할 수 있었고, Salmonella Enteritidis 의 생육도 36시간까지 지연시킬 수 있었다. 이상의 결과 선학초의 petroleum ehter추출물은 Bacillus Cereus와 Sal- paella Enteritidis의 성장을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과 선학 초의 petroleum ether 추출물은 각종 식중독 유발 세균의 성장을 억제흐]는 천 연 식품 보존제 개발의 신소재로 활용될 가능성이 있음을 알 수 있었다.
- 또한 Salmonella Enteritidis균에 대한 항균력도 농도에 비례하여 증가함을 관찰할 수 있었다. 한편 본 실험에 사용한 선학 초 추출물의 농도가 100 ppm이 하인 경우에는 항균효과를 검증할 수 없었고, 선학초의 수용성추출물의 경우도 모든 균주에 대해 그다지 큰 항균 활 성을 나타내지 않았다.
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