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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내 옥수수 품종에서 형질전환시 스템개발 및 환경친화형 제초제 저항성 형질전환체를 개발 할 목적으로 먼저 type II캘러스를 안정적으로 생산하는 모 델계통인 Hi Ⅱ의 미숙배를 Agrobacterium과 공동배양하는 방법으로 형질전환체를 생산하는 시스템을 확보 하였기에 보고 하고자 한다.
제안 방법
- 배반절편으로부터 형성된 배발생 캘러스 (type II)는 선발하여 동일배지상에서 증식시켰다. 선발된 배발생 캘러스로부터 형질전환체를 얻기 위하여 1차 재분화 배지 (MS salts, 0.1 mg/L 2, 4-D, 10'7M ABA, 2% sucrose, 50 mg/L carbenicillin, 50 mg/L paromomycin, 0.8% purified agar)와 2차 재분화배지 (N6 salts, Eriksson's vitamins, 6% sucrose, 50 mg/L carbenicillin, 50 mg/L paromomycin, 0.35% phytagel)에 2주 간격으로 옮기면서 광도 46 //mol m"s시의 16시간 광주기에서 배양한 후 완전한 식 물체를 유도하였다. 선발배지에서 얻은 유식물체는 토양으 로 옮겨 온실에서 순화한 후 종자 (「)를 수확 하였다.
- 1987). 24시간 후 70%알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성 반응을 보인 식물 체의 빈도를 조사하였다. 대조구로서는 Agr사)act아, ium과 공동배양하지 않은 식물체의 잎 절편을 사용하였다.
- 1987). 50 mg/L kana- mycin, 100 mg/L spectinomycin 및 100 mg/L streptomycin이 첨가된 LB 액체배지 50 mL에 colony를 접종하여 28 ℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD650 = 0.6 - 1.0)의균을 사용하였다.
- 8% agarose겔에 전 기 영동 하였다. Agarose 겔 상의 DNA 밴드를 ZetaR-Probe nylon membrane (Bio-Rad, catalog #162-0196)에 옮겨 32P-dCTP (Stratagene, catalog #300385)로 표지된 약 0.8 kb nptll probe를 이용하여 Southern 분석하였다 (Southern1975).
- 0 mm로 자란 이삭을 취하여 70% 알코올로 2회 표면 살균한 후 무균작업대에서 미숙 배를 분리하였다. Paromomycin저항성 배발생캘러스를 선발하기 위하여 MS salt (Murashige and Skoog 1962), Eriksson's vitamins, 1 mg/L 2, 4-D, 25 mM proline, 100 mg/L casamino acid, 3 mM MES, 1.7 mg/L AgNOa, 100 mg/L carbenicillin, 100 mg/L paromomycin 및 20 g/Lsucrose를 조합하여 선발배지 (SM)를 조성하였다. 배지는 7 g/L purified Agar를 첨가하기 전 pH를 5.
- 옥수수의 type II캘러스를 형성하는 모델계통 (Hi II) 종 자를 네브라스카대학 Tom Clemente박사로부터 분양 받았 다. 옥수수 종자를 .1일 동안 암상태에서 침적한 후 거어즈 처리하여 발아 시켰으며, 1 cm정도 유근이 자랐을 때 토양- 에 파종하여 성숙한 개체로 생육 시켰다. 성숙한 식물로부터 발달된 이삭에 화분가루를 묻혀 수정한 후 약 10~11일 째에 L5 ~2.
- 미숙배는 페트리디쉬당 10개씩 치상하여 28℃에서 암 배양하였다. 치상 후 4일째 미숙배로부터 발달된 유경과 유 근 부위를 제거한 후 배반절편을 동일배지에 2주 간격으로 12주간 계대배양하였다. 배반절편으로부터 형성된 배발생 캘러스 (type II)는 선발하여 동일배지상에서 증식시켰다.
- 후대 종자 (Ti 세대)를 토양에 파종하여 온실에서 생육 시켰다. 파종 후 식물체의 크기가 약 50 cm이상 되었을 때 GUS양성반응을 나타낸 식물체의 잎 조직으로부터 genomic DNA를 추출하였다 (Dellaporta et al. 1985). 10 陽의 DNA를 FcoRI 제한효소 반응액에 37℃에서 16시간 동안 반응시켜 절단 한 후 0.
- GUS 양성반응을 나타낸 식물체 (T。세대)로부터 종자 (1) 세대)를 얻었다. 후대 종자 (Ti 세대)를 토양에 파종하여 온실에서 생육 시켰다. 파종 후 식물체의 크기가 약 50 cm이상 되었을 때 GUS양성반응을 나타낸 식물체의 잎 조직으로부터 genomic DNA를 추출하였다 (Dellaporta et al.
대상 데이터
- 옥수수 미숙배배양고} Agrobacterium 似〃効心e〃s공동배 양법에 의해 형질전환체를 생산하였다. Hi II계통의 미숙배 를 Ubiquitin 1 promoter-GUS유전자와 선발마커로서 nptll 유전자로 제작된 pPTN290벡터를 C58C1 에 도입한 후 형 질전환 균주로 사용하였다. 7개의 paromomycin저항성 배 발생캘러스를 얻었으며, GUS양성반응을 나타내는 7개의 독립적인 식물체를 얻었다.
- 기내에서 성숙한 유식물체 (약 10 cm)를 토양에 이식하여 성숙 시킨 후 5개의 GUS양성반응을 나타내는 식물체(TM-1, TM-2, TM-3, TM-4, TM-5)로부터 후대 종자 (T, )를 얻었다. 각 형질전환체로부터 수확한 종자 (L 세대)를 1~5개씩 토양에 파종하여 성숙한 식물체를 얻었고 10주 정도 자란 형질전환체 (12개체)의 잎으로부터 추출한 genomic DNA/를 이용하여 Southern분석을 수행한 결과 TM- 1-1, TM-4-1, TM-4-2 은 3 copy 가, TM-1-2는 4 copy가, TM-2-1과 TM-2-2는 1 copy가, TM-3-1, TM-3-2, TM-5-1, TM-5-2, TM-5-3, TM-5-4는 2 copy가 식물체 genome에삽입되어 있었다 (Figure 3).
- 24시간 후 70%알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성 반응을 보인 식물 체의 빈도를 조사하였다. 대조구로서는 Agr사)act아, ium과 공동배양하지 않은 식물체의 잎 절편을 사용하였다.
- 본 연구는 바이오그린21사업단과 작물유전체사업단의 지 원 하에 수행 되었으며, Hi II계통 종자는 네브라스카 대학 Tom Clemente박사로부터 공급받아 수행하였다.
- 옥수수의 type II캘러스를 형성하는 모델계통 (Hi II) 종 자를 네브라스카대학 Tom Clemente박사로부터 분양 받았 다. 옥수수 종자를 .
이론/모형
- Ubiquitinl 프로모터, -glucuroinidase (GUS)유전자와 NPT II유전자를 선발표지로 포함하고 있는 pPTN290벡터 (Figure 1)를 fi*eeze-thaw방법으로 C58C1 에 형질전환하여 균주로 사용하였다 (Jefferson et al. 1987). 50 mg/L kana- mycin, 100 mg/L spectinomycin 및 100 mg/L streptomycin이 첨가된 LB 액체배지 50 mL에 colony를 접종하여 28 ℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD650 = 0.
- 옥수수 미숙배배양고} Agrobacterium 似〃効心e〃s공동배 양법에 의해 형질전환체를 생산하였다. Hi II계통의 미숙배 를 Ubiquitin 1 promoter-GUS유전자와 선발마커로서 nptll 유전자로 제작된 pPTN290벡터를 C58C1 에 도입한 후 형 질전환 균주로 사용하였다.
성능/효과
- 그러나TM-1-1과 TM-1-2의 경우 각각 3 copy와 4 copy로 다르게나타나 향후 도입유전자에 대한 분자유전학적 고찰이 필요 할 것으로 생각된다. 이와 같이 옥수수 미숙배에서 Agrobac-terium공동배양법에 의해 도입된 "所〃유전자가 옥수수 genomic DNA에 삽입된 후 다음 세대에 유전되고 있음을 확 인 할 수 있었다.
- Hi II계통의 미숙배 를 Ubiquitin 1 promoter-GUS유전자와 선발마커로서 nptll 유전자로 제작된 pPTN290벡터를 C58C1 에 도입한 후 형 질전환 균주로 사용하였다. 7개의 paromomycin저항성 배 발생캘러스를 얻었으며, GUS양성반응을 나타내는 7개의 독립적인 식물체를 얻었다. Southern분석법에 의하여 μ세 대 식물체로부터 加〃유전자가 안정적으로 도입되어 있음을 확인하였다.
- 2002). Hi II종자를 파종한 후 약 3~4개월 동안 온실에서 생육시켜 성숙한 식물체를 얻을 수 있었다. Hi II식물체의 화분가루를 이삭에 묻혀 수정한 후 10~11일째에 1.
- 7개의 paromomycin저항성 배 발생캘러스를 얻었으며, GUS양성반응을 나타내는 7개의 독립적인 식물체를 얻었다. Southern분석법에 의하여 μ세 대 식물체로부터 加〃유전자가 안정적으로 도입되어 있음을 확인하였다.
- 기내에서 성숙한 유식물체 (약 10 cm)를 토양에 이식하여 성숙 시킨 후 5개의 GUS양성반응을 나타내는 식물체(TM-1, TM-2, TM-3, TM-4, TM-5)로부터 후대 종자 (T, )를 얻었다. 각 형질전환체로부터 수확한 종자 (L 세대)를 1~5개씩 토양에 파종하여 성숙한 식물체를 얻었고 10주 정도 자란 형질전환체 (12개체)의 잎으로부터 추출한 genomic DNA/를 이용하여 Southern분석을 수행한 결과 TM- 1-1, TM-4-1, TM-4-2 은 3 copy 가, TM-1-2는 4 copy가, TM-2-1과 TM-2-2는 1 copy가, TM-3-1, TM-3-2, TM-5-1, TM-5-2, TM-5-3, TM-5-4는 2 copy가 식물체 genome에삽입되어 있었다 (Figure 3). 일반적으로 기원이 동일한 캘 러 스클론으로부터 얻어진 형 질 전환체 의 경우 다음세대 에서 도 동일 copy수가 유전되는 것으로 알려져있다.
- 반면 괴사 또는 백화현상을 보인 절편 의 경우 어떠한 캘러스 증식이나 배발생캘러스도 형성되지않았다. 배양 12주째 1, 158개 미숙배 중에서 7개 (0.60%)로부터 독립적인 배발생캘러스를 얻을 수 있었다. 이러한 배 발생캘러스를 1차 식물체 전환배지에 옮겨 2주간 배양하였 을 때 구형기 체세포배가 발생되었고, 이로 부터 흰색의 뚜렷한 체세포배가 형성되었다 (Figure 2E).
- 2002), 华〃/유전자 또한 선발마커로 이용되기도 하였다 (Moose and Clemente 2002). 본 연구에서도 Agrobacterium공동배양법에 의한 옥수수 형질전환체를 생산할 수 있었고, 특히 선발마커로서 华/■〃유전자를 사용할 수 있음을 확인하였다. 그러나 본 연구에서 얻은 형질전환빈도 (0.
- 체세포배를 2차 식물체전환배지에 옮겨 다시 2주간 배양하였을 때 자엽부 위가 점차 녹색으로 변하기 시작하였고 뿌리도 유도되었다(Figure 2F, G, H). 유식물체의 크기가 약 10 cm이상 되었을 때 토양으로 순화하여 건강한 식물체를 얻을 수 있었고Figure 21), 이러한 형질전환체 (To)의 잎에서 GUS유전자 가 안정적으로 발현되고 있었고 (Figure 2K, L), 반면 대조 군 식물체에서는 발현되지 않음을 확인 하였다 (Figure 2J). 수정후 식물체로부터 후대종자 (「)를 얻었다.
- (Roa-Rodriguez and Nottenburg 1999).이와 같이 옥수수 형질전환에서 paromomycine 효과적인 선발마커로서 가능성을 확인할 수 있었다. 한편 Agro- 力acter汕初공동배양법에 의한 형질전환시스템은 높은 형질 전환율, 적은 DNA copy수 및 높은 형질전환율 등 많은 장점이 있다.
후속연구
- 5%)에 비하여 매우 낮기 때문에 향후 형질전환빈도 증진을 위한 최적 /gr.泌ac/erz由w선정, 최적 선발마커선정, 최적 공동배양조건 및 재분화시스템 등에 대한 연구가 진행되어져야 할 것으로 생각되며, 이러한 형질전환시스템을 이용하여 국내 옥수수 품종 중 type II캘러스와 유사한 배발생캘러스 (YFEC, Cho et al. 2005)를형성하는 품종 (흑점찰)과 계통 (HW3)을 대상으로 형질전 환시스템 확립 및 유용유전자 도입을 위한 연구도 진행 할 것 이다
- 본 연구에서도 Agrobacterium공동배양법에 의한 옥수수 형질전환체를 생산할 수 있었고, 특히 선발마커로서 华/■〃유전자를 사용할 수 있음을 확인하였다. 그러나 본 연구에서 얻은 형질전환빈도 (0.6%)는 기 연구의 형질전환빈도 (5.5%)에 비하여 매우 낮기 때문에 향후 형질전환빈도 증진을 위한 최적 /gr.泌ac/erz由w선정, 최적 선발마커선정, 최적 공동배양조건 및 재분화시스템 등에 대한 연구가 진행되어져야 할 것으로 생각되며, 이러한 형질전환시스템을 이용하여 국내 옥수수 품종 중 type II캘러스와 유사한 배발생캘러스 (YFEC, Cho et al.
- 일반적으로 기원이 동일한 캘 러 스클론으로부터 얻어진 형 질 전환체 의 경우 다음세대 에서 도 동일 copy수가 유전되는 것으로 알려져있다. 그러나TM-1-1과 TM-1-2의 경우 각각 3 copy와 4 copy로 다르게나타나 향후 도입유전자에 대한 분자유전학적 고찰이 필요 할 것으로 생각된다. 이와 같이 옥수수 미숙배에서 Agrobac-terium공동배양법에 의해 도입된 "所〃유전자가 옥수수 genomic DNA에 삽입된 후 다음 세대에 유전되고 있음을 확 인 할 수 있었다.
- 옥수수는 세계 곡류생산량에서 벼와 밀 다음으로 많이 재배 되는 중요한 작물이다. 분자육종을 통한 옥수수 형질 전환시스템 개발은 제초제 저항성, 내병성, 내한성 등 유 용 유전자 도입을 가능하게 하여 옥수수 신품종 육성을 앞당길 수 있을 것이다. 옥수수형질전환체는 재분화능이높은 미숙배 또는 배발생캘러스를 이용하여 particle bom-bardment법 (Gordon-Kamm et aL 1990; Songstad et al.
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