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문제 정의
- 손바닥선인장 추출물이 천연 보존제로 이용될 가능성을 조사하기 위하여 염(100 mM KC1, 100 mM NaCl, 100 mM NHQ, 20 mM CaCl:"과 금속이온(15 mM MnCl2, 30 mM MgCk)이 손바닥선인장 추출물의 항균활성에 미치는 영향을 검토하였다. 오염 지표균인 E.
- 이에 본 연구에서는 천연 신규 생리활성물질 탐색의 일환으로 제주도 손바닥선인장 줄기를 methanol을 이용하여 추출한 후 그 추출물의 항균특성을 일반 세균 및 약제내성균을 이용하여 검토하였으며, 그 외에 식품 매개 병원체, 충치 원인균, 여드름 원인균을 비롯한 피부 병변 관련균, 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대한 항균 활성 등을 검토하였다. 또한 사회적 문제로 대두되고 있는 약제내성균을 중심으로 손바닥 선인장 줄기 추출물의 생리활성 특성에 관해 살펴봄으로서 보다 다양한 분야로의 응용 가능성을 확인하였다.
제안 방법
- 손바닥선인장 추출물의 열 안정성을 검토하기 위하여 일 반적인 병원성 세균으로 알려진 Staphylococcus aureus KCTC 1621, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636, Enterococcus faecium KCTC 3095와 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 약제내성균인 MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), R-P. aeruginosa (Resistant Pseudomonas aeruginosa), VRE (Van comycin-resistant Enterococcus faecium) 등을 이용하여 열처리, 저장온도 및 저장기간에 따른 추출물의 항균 활성 변화를 살펴보았다. 열처리 실험은 손바닥선인장 추출물 10 ml를 100℃, 121 ℃에서 각각 15분 동안 처리한 후 paper disc법 [7, 10, 14]을 이용하여 항균활성을 측정하였다.
- 이로서 손바닥선인장을 이용한 여드름을 비롯한 피부염증 완화제 등의 제품을 생산할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 또한 손바닥선인장 추출물을 이용 하여 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대한 항균활성을 검토하였 는데, Table 6에서 보는 바와 같이 손바닥선인장 추출물은 특이적으로 세균뿐 만 아니라 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대해서도 항균활성을 나타내었다. 이처럼 손바닥선인장 메탄올 추출물은 넓은 항균 스펙트럼을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 또한 손바닥선인장 추출물을 이용하여 여드름 원인균을 비롯한 피부 병변 관련균에 대한 항균활성을 확인하였다. Tablele 5에서 보는 바와 같이 혐기성 균인 여드름 원인균과 피부염증 유발 세균인 포도상구균에서도 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 또한 손바닥선인장 추출물을 이용하여 충치 원인균에 대한 항균활성을 검토하였다. Table 4에서 보는 바와 같이 충치 원인균인 Streptococcus mutans KCTC 3065와 sero-type이 다른 균주 모두에서 항균활성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 또한 식습관의 변화로 인한 가공식품 섭취의 증가와 급식 및 외식의 증가로 인한 식중독이 증가하고 있는 실정에서, 증식된 미생물을 섭취함으로서 병의 증세를 나타내는 감염 형식중독과 미생물이 생산한 독소가 인체에 들어감으로서 증세를 나타내는 독소형 식중독 등 식품을 매개로 하여 발병하는 질병 원인균에 대해 선인장 추출물을 이용하여 항균활성을 확인하였다. Table 3에서 보는 바와 같이 장염 및 패혈증 원인균인 Vibrio 속 세균과 대장균, 대장균 0-157, 감염형 식중독 원인균, 이질 원인균 등에서도 동일하게 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 열처리 실험은 손바닥선인장 추출물 10 ml를 100℃, 121 ℃에서 각각 15분 동안 처리한 후 paper disc법 [7, 10, 14]을 이용하여 항균활성을 측정하였다. 또한 저장온도 및 저장기간에 따른 추출물의 항균 활성 변화 실험은 손바닥 선인장 추출물 10 ml를 4℃(냉장고), 25℃(상온)에서 10주간 보관하면서 1, 4, 7, 10주에 각각 항균활성을 측정하였고, 그 방법은 전과 동일한 paper disc법을 사용하였다.
- 손바닥선인장 줄기 분말 WO g과 50% methanol 1 L를 혼 합하여 3시간 동안 교반(CORNING, Stirrer, USA)하면서 항 균활성 물질을 추출한 후 원심분리기(BECKMAN COULTER, Avanti J-E Centrifuge, USA)를 사용하여 17, 000%에서 20분 간 원심분리를 실시하여 상등액을 취한 후, 진공농축기(EYELAROTARY VACUUM EVAPORATOR N-N SERIES, Japan)를 이용하여 800 ml의 상등액이 최종 부피 80 ml (1/10 volume) 가 되도록 농축을 실시하였다. 진공농축액 찌꺼기를 제거하 기 위하여 17, 000xg에서 20분간 원심분리하여 그 상등액을 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 각 균주 중 세균은 1.0~2.0xl06 cells/ml가 되도록 배양한 후 각 평판배지에 100 ㎕씩 도말 하였으며, methanol 추출시료는 각 paper disc (0 8 mm, ADVANTEC, Japan)에 50 nl씩 흡수시킨 후 균주의 최적 배양온도에서 24 - 72시간 배양한 후 생육 저지환의 크기를 확인하였다. 이때 혐 기 성 균주는 anaerobic jar (AnaeroGen, OXOID, England) 에서 배 양하였으며, 곰팡이 인 Aspergillus niger ATCC 8642는 PDA 배지에 접종하여 30℃, 3일간 배양한 후 멸균된 0.
- 오염 지표 미생물인 Escherichia coli KCTC 1039 균주를 이 용하여 식품 첨가제 중 보존제로 사용되는 sodium benzoate 와 손바닥선인장 추출물의 농도에 따른 항균활성을 비교하 였 다. 액 체 배 지 에 선 인 장 추출물과 sodium benzoate를 각각 0.3, 0.5, 0.7% 첨가하고, E. coli KCTC 1039 전배양액을 1% 접종하였다. 접종 후 24시간 동안 배양하면서 3시간마다 시 료를 채 취하여 CFU (colony forming units)를 측정 하여 항균 활성을 비교하였다.
- coli KCTC 1039를 전배양한 후 각 액 체배 지 10 ml에 손바닥선인장 추출물 100 ㎕와 각각 의 염, 금속이온을 100 ㎕씩 첨가하여 배양 0, 6, 12시간에 시 료를 채취하여 실험하였다. 염과 금속이온을 처리한 시료는 OD 660에서의 흡광도를 측정하여 비교하였다.
- 오염 지표 미생물인 E. coli KCTC 1039 균주를 이용하여 식품 첨가제 중 보존제로 사용되는 sodium benzoate와 손바닥 선인장 추출물의 농도에 따른 항균활성을 CFU를 측정하여 비교하였다 [Fig. 3 (A), (B)]. 선인장 추출물은 E.
- 오염 지표 미생물인 Escherichia coli KCTC 1039 균주를 이 용하여 식품 첨가제 중 보존제로 사용되는 sodium benzoate 와 손바닥선인장 추출물의 농도에 따른 항균활성을 비교하 였 다. 액 체 배 지 에 선 인 장 추출물과 sodium benzoate를 각각 0.
- , 100 mM NaCl, 100 mM NHQ, 20 mM CaCl:"과 금속이온(15 mM MnCl2, 30 mM MgCk)이 손바닥선인장 추출물의 항균활성에 미치는 영향을 검토하였다. 오염 지표균인 E. coli KCTC 1039를 전배양한 후 각 액 체배 지 10 ml에 손바닥선인장 추출물 100 ㎕와 각각 의 염, 금속이온을 100 ㎕씩 첨가하여 배양 0, 6, 12시간에 시 료를 채취하여 실험하였다. 염과 금속이온을 처리한 시료는 OD 660에서의 흡광도를 측정하여 비교하였다.
- 이에 본 연구에서는 천연 신규 생리활성물질 탐색의 일환으로 제주도 손바닥선인장 줄기를 methanol을 이용하여 추출한 후 그 추출물의 항균특성을 일반 세균 및 약제내성균을 이용하여 검토하였으며, 그 외에 식품 매개 병원체, 충치 원인균, 여드름 원인균을 비롯한 피부 병변 관련균, 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대한 항균 활성 등을 검토하였다. 또한 사회적 문제로 대두되고 있는 약제내성균을 중심으로 손바닥 선인장 줄기 추출물의 생리활성 특성에 관해 살펴봄으로서 보다 다양한 분야로의 응용 가능성을 확인하였다.
- coli KCTC 1039 전배양액을 1% 접종하였다. 접종 후 24시간 동안 배양하면서 3시간마다 시 료를 채 취하여 CFU (colony forming units)를 측정 하여 항균 활성을 비교하였다.
- 추출물의 천연 보존제로서의 이용 가능성을 검토하기 위하여 추출물을 다양한 염과 금속이온에 노출하여 항균활성의 변화를 각각 0, 6, 12시간 오염 지표 미생물인 E. coli KCTC 1039의 생육도를 측정하여 항균활성의 변화를 확인하였다. KC1, NaCl, NH4CI, CaCl2, MnCl2, MgCh 등과 같은 염과 금속이온들을 이용하여 나타난 결과, Table 8에서 보는 바와 같이 본 실험에 사용된 염과 금속이온들은 추출물의 항균활성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 균주 중 Staphylococcus aureus KCTC 1621 등 공시균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에서, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 등 약제내성균은 부산광역시 소재 병원 임상병리과에서 환자로부터 분리한 균주를, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Escherichia coli 0-157, Escherichia coli 0-157 H(-) 등의 분리 균은 부산광역시 보건환경연구원에서 분리한 균주를, Escheri chia coli ATCC 10536 등의 공시균주는 American Type Culture Collection (USA)에서 분양된 것을, 충치 원인균인 Streptococcus mutans 균주의 sero-type은 Department of Biology, Wash ington University (USA)의 보관용 균주를, Saccharomyces del- buruekii IFO 0285는 Institute for Fermentation (Japan) 에서 각각 분양 받아 실험에 사용하였다. 또한 본 실험에 사용한 배양용 배지는 일급시약(Difco, USA)을 사용하였고, 염과 금 속이온 및 기타 시약도 일급시약(Junsei Chemical Co., Ltd., Japan)을 사용하였다. 본 실험에 사용한 균주 및 배지는 Table 1과 같다.
- 본 실험에 사용한 균주 중 Staphylococcus aureus KCTC 1621 등 공시균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에서, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 등 약제내성균은 부산광역시 소재 병원 임상병리과에서 환자로부터 분리한 균주를, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Escherichia coli 0-157, Escherichia coli 0-157 H(-) 등의 분리 균은 부산광역시 보건환경연구원에서 분리한 균주를, Escheri chia coli ATCC 10536 등의 공시균주는 American Type Culture Collection (USA)에서 분양된 것을, 충치 원인균인 Streptococcus mutans 균주의 sero-type은 Department of Biology, Wash ington University (USA)의 보관용 균주를, Saccharomyces del- buruekii IFO 0285는 Institute for Fermentation (Japan) 에서 각각 분양 받아 실험에 사용하였다. 또한 본 실험에 사용한 배양용 배지는 일급시약(Difco, USA)을 사용하였고, 염과 금 속이온 및 기타 시약도 일급시약(Junsei Chemical Co.
- 본 실험에 사용한 손바닥선인장 줄기는 제주도 농장에서 생산된 것을 구입하여 가시를 제거하여 동결건조한 후 파쇄 하여 사용하였으며, 또한 북제주군 농업기술센터에서 설립 한 손바닥선인장 줄기 분말 생산공장으로부터 줄기 분말을 구입하여 실험에 사용하였다.
- 손바닥선인장 줄기 분말 WO g과 50% methanol 1 L를 혼 합하여 3시간 동안 교반(CORNING, Stirrer, USA)하면서 항 균활성 물질을 추출한 후 원심분리기(BECKMAN COULTER, Avanti J-E Centrifuge, USA)를 사용하여 17, 000%에서 20분 간 원심분리를 실시하여 상등액을 취한 후, 진공농축기(EYELAROTARY VACUUM EVAPORATOR N-N SERIES, Japan)를 이용하여 800 ml의 상등액이 최종 부피 80 ml (1/10 volume) 가 되도록 농축을 실시하였다. 진공농축액 찌꺼기를 제거하 기 위하여 17, 000xg에서 20분간 원심분리하여 그 상등액을 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 1% Tween 80 용액 10 ml을 배지에 부어 loop를 이용하여 포자 를 가볍게 긁어모아 원심분리한 후 포자상등액을 시험에 사 용하였다. 각 실험은 3번 실행하여 평균값으로 평가하였다. 저지환의 크기가 20 mm 이상인 것은 +++로, 저지환의 크기 가 10-20 mm인 것은 ++로, 저지환의 크기가 10 mm 미만 인 것은 +로 구분하여 표기하였다.
이론/모형
- aeruginosa (Resistant Pseudomonas aeruginosa), VRE (Van comycin-resistant Enterococcus faecium) 등을 이용하여 열처리, 저장온도 및 저장기간에 따른 추출물의 항균 활성 변화를 살펴보았다. 열처리 실험은 손바닥선인장 추출물 10 ml를 100℃, 121 ℃에서 각각 15분 동안 처리한 후 paper disc법 [7, 10, 14]을 이용하여 항균활성을 측정하였다. 또한 저장온도 및 저장기간에 따른 추출물의 항균 활성 변화 실험은 손바닥 선인장 추출물 10 ml를 4℃(냉장고), 25℃(상온)에서 10주간 보관하면서 1, 4, 7, 10주에 각각 항균활성을 측정하였고, 그 방법은 전과 동일한 paper disc법을 사용하였다.
성능/효과
- coli KCTC 1039의 생육도를 측정하여 항균활성의 변화를 확인하였다. KC1, NaCl, NH4CI, CaCl2, MnCl2, MgCh 등과 같은 염과 금속이온들을 이용하여 나타난 결과, Table 8에서 보는 바와 같이 본 실험에 사용된 염과 금속이온들은 추출물의 항균활성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이는 선인장 추출물이 각종 염과 금속이온에 의해서 항균활성에 영향을 받지 않으므로 천연식품 보존제로서의 사용 가능성을 다시 한 번 확인할 수 있는 기초적인 실험 결과를 제공하는 것으로 사료된다.
- 3 (A)]. Sodium benzoate의 첨가구도 약간의 저지 효과가 나타났고 농도가 증가할수록 그 효과도 증가하였지만 [Fig. 3 (B)], sodium benzoate의 0.7% 첨가구와 선인장 추출물의 0.3% 첨가구의 저지 효과가 비슷한 것으로 보아 식품 보존제로서의 효과적인 측면에서 비교해 볼 때 천연물로서의 식품 보존을 위한 보존제로서의 적용 가능성이 더 높은 것으로 평가할 수 있었다. 또한 Fig.
- 또한 식습관의 변화로 인한 가공식품 섭취의 증가와 급식 및 외식의 증가로 인한 식중독이 증가하고 있는 실정에서, 증식된 미생물을 섭취함으로서 병의 증세를 나타내는 감염 형식중독과 미생물이 생산한 독소가 인체에 들어감으로서 증세를 나타내는 독소형 식중독 등 식품을 매개로 하여 발병하는 질병 원인균에 대해 선인장 추출물을 이용하여 항균활성을 확인하였다. Table 3에서 보는 바와 같이 장염 및 패혈증 원인균인 Vibrio 속 세균과 대장균, 대장균 0-157, 감염형 식중독 원인균, 이질 원인균 등에서도 동일하게 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 선인장 추출물을 이용하여 식품가공 현장 및 요식업소 등 식품 관련 업소에서 사용할 수 있는 주방용 소독제 등의 제품 개발 가능성을 확인할 수 있는 결과라고 생각된다.
- 또한 손바닥선인장 추출물을 이용하여 충치 원인균에 대한 항균활성을 검토하였다. Table 4에서 보는 바와 같이 충치 원인균인 Streptococcus mutans KCTC 3065와 sero-type이 다른 균주 모두에서 항균활성이 있음을 확인할 수 있었다. 이는 선인장 추출물을 이용하여 치약 및 구강 청결제 등의 생산 가능성을 시사하는 것이다.
- 손바닥선인장 추출물의 열 안정성을 검토하기 위하여 일 반적인 병원성 세균으로 알려진 Staphylococcus aureus KCTC 1621, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636, Enterococcus faedum KCTC 3095와 약제내성균인 MRSA, R-F. aeruginosa, VRE 등을 이용하여 열처리, 저장온도 및 저장기간에 따른 항균 성 변화 등을 살펴본 결과, Table 7에서 보는 바와 같이 균주에 따라 저지환의 크기가 약간 증가하거나 감소한 경우도 있었지만 대체적으로 항균활성에는 큰 변화가 없는 것으로 나타났으며, 약제내성균에서도 일반 세균과 큰 차이 없이 항균 활성을 나타내었다. 따라서 선인장 추출물의 항균활성은 열처리에 크게 영향을 받지 않는 것으로 보여진다.
- 1에서 보는 바와 같이 Staphylococcus aureus KCTC 1621, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636, Enterococcus faecium KCTC 3095에서뿐 만 아니라 이 균주들의 약제 내성 균주인 MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), R-P. aeru ginosa (Resistant Pseudomonas aeruginosd), VRE (Vancomycin- resistant Enterococcus faecium) 등에서도 항균 활성 이 있음을 확인하였다. 이는 원내감염 등으로 인하여 많은 문제가 되고 있는 약제내성균의 피해를 줄일 수 있는 구체적인 방법을 제시해 줄 수 있는 기초 실험결과라 할 수 있다.
- 따라서, 손바닥선인장 추출물의 항균 활성 물질은 상기실험 결과에서 확인된 바와 같이 일반 병원균, 약제내성균, 식품 매개 병원균, 피부 염증 관련균, 충치 원인균, 효모 및 곰팡이 등 넓은 항균 스펙트럼을 나타내었다. 뿐만 아니라 선인장 추출물은 열 안정성 시험에서 그 안정성이 뛰어나 식품 보존제로서의 응용 가능성과 그 기원이 천연 물질이므로 안전성 측면에서 보면, 새로운 개념의 항균 활성 물질로서 평가되어 각종 소독 및 살균 관련 제품과 기능성 항균 제품 개발에 새로운 재료로서 그 응용 범위가 매우 넓다고 생각된다.
- 또한 추출물의 항균활성을 저장온도 및 저장기간에 따라 확인해 본 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 선인장 추출물의 항균활성은 전체적으로 25℃에서 약간 더 큰 항균활성을 보였으며, 저장기간이 길어져도 항균활성이 일괄적으로 작아지거나 커지지 않음을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 약제 내성균에 대해서도 대체적으로 4℃나 25℃에서 일반 세균과 비교해서 항균활성에는 큰 차이가 없는 것으로 보여진다.
- Tablele 5에서 보는 바와 같이 혐기성 균인 여드름 원인균과 피부염증 유발 세균인 포도상구균에서도 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이로서 손바닥선인장을 이용한 여드름을 비롯한 피부염증 완화제 등의 제품을 생산할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 또한 손바닥선인장 추출물을 이용 하여 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대한 항균활성을 검토하였 는데, Table 6에서 보는 바와 같이 손바닥선인장 추출물은 특이적으로 세균뿐 만 아니라 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대해서도 항균활성을 나타내었다.
- 또한 손바닥선인장 추출물을 이용 하여 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대한 항균활성을 검토하였 는데, Table 6에서 보는 바와 같이 손바닥선인장 추출물은 특이적으로 세균뿐 만 아니라 효모 및 곰팡이 등 진균류에 대해서도 항균활성을 나타내었다. 이처럼 손바닥선인장 메탄올 추출물은 넓은 항균 스펙트럼을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 따라서, 손바닥선인장 추출물의 항균 활성 물질은 상기실험 결과에서 확인된 바와 같이 일반 병원균, 약제내성균, 식품 매개 병원균, 피부 염증 관련균, 충치 원인균, 효모 및 곰팡이 등 넓은 항균 스펙트럼을 나타내었다. 뿐만 아니라 선인장 추출물은 열 안정성 시험에서 그 안정성이 뛰어나 식품 보존제로서의 응용 가능성과 그 기원이 천연 물질이므로 안전성 측면에서 보면, 새로운 개념의 항균 활성 물질로서 평가되어 각종 소독 및 살균 관련 제품과 기능성 항균 제품 개발에 새로운 재료로서 그 응용 범위가 매우 넓다고 생각된다.
- KC1, NaCl, NH4CI, CaCl2, MnCl2, MgCh 등과 같은 염과 금속이온들을 이용하여 나타난 결과, Table 8에서 보는 바와 같이 본 실험에 사용된 염과 금속이온들은 추출물의 항균활성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이는 선인장 추출물이 각종 염과 금속이온에 의해서 항균활성에 영향을 받지 않으므로 천연식품 보존제로서의 사용 가능성을 다시 한 번 확인할 수 있는 기초적인 실험 결과를 제공하는 것으로 사료된다.
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