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문제 정의
- 일반적으로 식물성 천연물들의 항산화효과, 항균성 등은 추출방법, 추출조건 등에 따라 유효물질의 함량 및 함유패턴이 다르고, 생리적 활성도 다르게 나타나기 때문에 석류씨의 효율적인 이용을 위해서는 석류씨 추출물의 형태에 따른 체계적인 유효성분의 검증이 필요할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 물추출물, 에탄올추출물 및 석류씨 기름에 대한 항균성, 항산화성, 아질산염 소거능 및 SOD 유사활성 등의 생리활성을 비교, 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 석류 추출물의 항균효과 검색은 paper disc법(Kim MS 등 2000)으로 측정하였다. 각 시험균주를 해당 액체 배지에 24시간 전배양하였고, 평판배지의 조제는각각의 생육배지로 멸균된 1.5% agar를 petridish에 20 mL씩 분주하여 응고시킨 후 각 시험균액을 0.1 mL씩 첨가하여 멸균된 유리봉으로 배지위에 고르게 펴지도록 도포하여 사용하였다. 시료를 일정농도로 주입한paper disc(8 mm, Toyo Roshi Kaicha, Ltd.
- Louis, USA)에 각각 200 ppm 및 500 ppm의 농도로 첨가하였다. 또한 기존 항산화제 중 a-tocopherol(Sigma-Aldrich chemical Co., St. Louis, USA)도 위와 동일한 방법을 사용하여 비교, 조사하였다. 이와 같이 농도별로 첨가된 linoleic acid는 100 mL 비이커에 50 g씩 분취하여 40℃ 로 유지되는 항온기에 저장하면서 일정 저장기간 별로 과산화물가(AOAC 1990)를 측정하여 석류씨 추출 물들의 항산화 효과를 비교, 조사하였다.
- 리놀레인산 에멀션 기질에서의 항산화효과 측정은리놀레인산 1.3 mL를 99.5% ethanol 100 mil] 용해시킨 후 10 mL씩 conical tube에 넣고 석류씨 추출물들 및 항산화제를 각각 200 ppm 농도가 되도록 첨가하였다 그리고 0.1 M phosphate buffer(pH 7.0)를 10 mL 첨가한 뒤 중류수 4.5 mL 넣은 후 40±l℃ 항온기에 저장하면서 하루 간격으로 과산화물의 함량을 측정하여 항산화효과를 비교, 조사하였다. 과산화물 함량 측정은thiocyanate method(JOCS 1984)를 사용하여 측정하였다.
- 다음으로 14% BF3/methanol 5 mL 가하고 2분간 반응시킨 다음 hexane 5 mL를 가하고 1분간 가열하였다. 반응 후 삼각플라스크를 분리 냉각시키고, 이를 test tube에 옮겨 포화 식염수를 가하고 hexane층을 분취하여 가스크로마토그래피 (M600D, Youglin, Korea)에 주입하여 분석하였다. 사용한 칼럼은 SUPELCOWAX™-10 (0.
- 석류씨 추출물들을 linoleic acid(Sigma Co., St. Louis, USA)에 각각 200 ppm 및 500 ppm의 농도로 첨가하였다. 또한 기존 항산화제 중 a-tocopherol(Sigma-Aldrich chemical Co.
- 석류씨 추출물들의 전자공여능은 DPPH(l, l-diphenyl- 2-picrylhydrazyl)의 환원성을 이용하여 516 nm에서 UV/ Visible spectrophotometer(TU-1800, Human Co. LTD, Korea)로 측정하였다(Blois MS 1958). 즉, 각각의 석류씨 추출물들 0.
- 1 mL씩 첨가하여 멸균된 유리봉으로 배지위에 고르게 펴지도록 도포하여 사용하였다. 시료를 일정농도로 주입한paper disc(8 mm, Toyo Roshi Kaicha, Ltd. Japan) 를 평판배지 위에 흡착시켜 멸균수 30 µL를 주입 후 37℃ 에서 24시간 배양하여 paper disc 주변의 inhibition clear zone의 직경(mm)을 측정하였다. 항균성 실험에 사용된 균주 및 배지는 Table 1과 같았다.
- 즉, Folin-Denis시약은 sodium tungstate 10 g, phosphomolybdic 2 g, phosphoric acid 5 mL를 메스플라스크에 넣고 증류수로 정용한 후 삼각플라스크에 옮겨 2시간 동안 환류조작하여 사용하였다. 실험방법으로는 캡튜브에 증류수 7 mL씩 넣고 DMSO(dimethy- sulfoxide)에 녹인 시료를 1 mL씩 넣은 후 Folin-Dennis 시약을 0.5 mL를 첨가 후 정확히 3분 후에 sodium carbonate anhydrous 포화용액 1 mL, 증류수 0.5 mL를넣은 후 725 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액과 비교하여 총페놀 함량을 구하였다. 표준용액으로는tannic acid(Sigma Co.
- 석류씨 기름은 석류씨 건조물을 120℃ 에서 5분간 볶은 후 가열압출 방식의 착유기 (NEW KJ 900, 이조기공, Koaa)로 200℃에서 압착하였다. 압착된 기름은 다시 탈검, 탈산, 탈색, 탈취공정을 걸친 후 석류씨 기름을 제조하였다. 주줄률은 주줄전의 석류씨 건조물의 무게에 대한 추출물의 무게백분율로 계산하였으며 냉동 보관(-40℃)하면서 실험에 사용하였다.
- Louis, USA)도 위와 동일한 방법을 사용하여 비교, 조사하였다. 이와 같이 농도별로 첨가된 linoleic acid는 100 mL 비이커에 50 g씩 분취하여 40℃ 로 유지되는 항온기에 저장하면서 일정 저장기간 별로 과산화물가(AOAC 1990)를 측정하여 석류씨 추출 물들의 항산화 효과를 비교, 조사하였다. 저장 중 과산 화물가의 변화에 따른 유도기간 설정은 과산화물가가 50 meq/kg oil에 도달하는데 걸리는 시간으로 하였다.
- 석류씨의 추출물의 제조는 식용으로 사용가능한 용매인 물과 에탄올(80%)을 이용하여 제조하였다. 조분쇄된 석류씨 건조물 1 Kg에 대하여 물 및 80% 에탄올 각각 5 L씩 첨가한 후, 8시간동안 환류냉각하면서 추출하여 조여하였다. 조여과된 석류씨 추출물들을 24시간동안4℃에서 정치, IQOOOxg로 15분간 원심분리(CR 21, Hitachi,Japan)한 후 동결, 건조하여 석류씨 물 추출물 및 에탄올 추출물을 제조하였다.
- 조분쇄된 석류씨 건조물 1 Kg에 대하여 물 및 80% 에탄올 각각 5 L씩 첨가한 후, 8시간동안 환류냉각하면서 추출하여 조여하였다. 조여과된 석류씨 추출물들을 24시간동안4℃에서 정치, IQOOOxg로 15분간 원심분리(CR 21, Hitachi,Japan)한 후 동결, 건조하여 석류씨 물 추출물 및 에탄올 추출물을 제조하였다. 석류씨 기름은 석류씨 건조물을 120℃ 에서 5분간 볶은 후 가열압출 방식의 착유기 (NEW KJ 900, 이조기공, Koaa)로 200℃에서 압착하였다.
- 과산화물 함량 측정은thiocyanate method(JOCS 1984)를 사용하여 측정하였다. 즉 75% ethanol 4.7 ml에 각 시료 0.1 mL와 30% ammonium thiocyanate 0.1 mL를 넣고, 정확히 3분 후 20 mM iron(n)chloride(in 3.5% HC1) 0.1 mL를 넣어 500 nm에서 UV/Visible spectrophotometer로 흡광도를 측정하여 각 시료의 과산화물 함량의 지표로 삼았다.
- LTD, Korea)로 측정하였다(Blois MS 1958). 즉, 각각의 석류씨 추출물들 0.15 mL과 0.035% DPPH 용액 (6.25 * 10-5M) 3 mL를 시험관에 넣은 후 5초동안 vortex mixer로 혼합하여 30분간 반응시킨 후 대조구에 대한 흡광도의 감소비율로서 전자공여능을 나타내 었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 석류씨는 이란산으로 (주)한일양행(안성, 한국)으로부터 제공받았으며, 석류씨 건조물을 약 20-30 mesh로 분쇄 (IKA M20, IKA Co. LTD.Germany)하여 석류씨 추출물 제조에 사용하였다.
- 반응 후 삼각플라스크를 분리 냉각시키고, 이를 test tube에 옮겨 포화 식염수를 가하고 hexane층을 분취하여 가스크로마토그래피 (M600D, Youglin, Korea)에 주입하여 분석하였다. 사용한 칼럼은 SUPELCOWAX™-10 (0.32 mm i.d. x 60 m x 0.25 pm film thickness, U.S.A), 검출기는 불꽃이온화 검출기 (FID), 온도는 주입기 240℃, 검출기 250℃, 오븐 18 0℃/l min-3℃/min-240℃/15 min, 운반기체는 헬륨, 주입량은 1 µL 이었다.
- 석류씨의 추출물의 제조는 식용으로 사용가능한 용매인 물과 에탄올(80%)을 이용하여 제조하였다. 조분쇄된 석류씨 건조물 1 Kg에 대하여 물 및 80% 에탄올 각각 5 L씩 첨가한 후, 8시간동안 환류냉각하면서 추출하여 조여하였다.
- 5 mL를넣은 후 725 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액과 비교하여 총페놀 함량을 구하였다. 표준용액으로는tannic acid(Sigma Co., St. Louis, USA)를 사용하였다.
이론/모형
- 5 mL 넣은 후 40±l℃ 항온기에 저장하면서 하루 간격으로 과산화물의 함량을 측정하여 항산화효과를 비교, 조사하였다. 과산화물 함량 측정은thiocyanate method(JOCS 1984)를 사용하여 측정하였다. 즉 75% ethanol 4.
- 석류 추출물의 항균효과 검색은 paper disc법(Kim MS 등 2000)으로 측정하였다. 각 시험균주를 해당 액체 배지에 24시간 전배양하였고, 평판배지의 조제는각각의 생육배지로 멸균된 1.
-
3. 지방산 분석
석류씨 기름의 지방산조성을 분석하기 위한 전처리는 AOAC법(AOAC 1995)에 따라 행하였다. 즉, 시료를 250 mL 삼각플라스크에 0.
- 석류씨 추출물의 superoxide 라디칼 (·O2) 소거활성은 lio 등의 방법 (lio M 1985)에 따라 xanthine-xanthine oxidase cytochrome c 환원법으로 측정하였다. 즉, 시료 0.
- 아질산염 소거작용은 Gray와 Dugan의 방법 (Gray JI 와 Dugan JLR 1975)에 의하여 측정하였다. 즉 1 mM NaNO2 용액 1 mL에 일정농도의 시료 1 mL를 가하고 0.
- 총페놀 함량은 Folin-Denis법 (AOAC 1984)에 의하여 분석하였다. 즉, Folin-Denis시약은 sodium tungstate 10 g, phosphomolybdic 2 g, phosphoric acid 5 mL를 메스플라스크에 넣고 증류수로 정용한 후 삼각플라스크에 옮겨 2시간 동안 환류조작하여 사용하였다.
성능/효과
- 석류씨 기름의 지방산 조성 Table 3과 같이palmitic acid기" 3.7%, stearic acid:가 2.4%, oleic acid 가 7.8%, linoleic acid 8.2%, linolenic acid 7.6%이었으며 일반적으로 종자유에서는 검출되지 않는 4개의 peak가 검출되었으며 이들의 함량은 65.0%에 달하였다. 최 등(최원균 등 2002)은 석류농축액의 지방산조성을 분석한 결과, myristic acid 가 13.
- 특히 석류씨 기름은 100 ppm 농도에서 가장 낮은 소거능을 보였으나 500 ppm 농도 이상에서는 아질산염 소거능이 크게 증가하는 경향을 보였다. 2, 000 ppm 농도에서 물 추출물, 에탄올 주줄물 및 석류씨 기름의 아질산염 소거능은 각각 27.5, 23.7 및 39.6%로 석류씨 기름에서 가장 강한 소거능을 보였다.
- 07배의 연장효과를 보였다. 결론적으로 리놀레인산 기질에서의 항산화효과는 에탄올 추출물 > a-tocopherol > 물 추출물 > 석류 씨 기름의 순이었다.
- 리놀레인산 에멀젼 시스템 항산화 효과를 비교한 결과(Fig. 3), 석류씨 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름을 각각 200 ppm 첨가한 기질의 과산화물 함량은 저장 10일째에 L149, 1.011 및 L275로 나타나 대조구(2.525)에 비해 낮은 값을 나타내었다. 리놀레인산기질에서 항산화효과를 보이지 않았던 석류씨 기름의 경우, 리놀레인산 에멀젼 기질에서는 항산화효과는 나타내어 리놀레인산 기질에서의 항산화효과의 경우와는 다른 경향을 보였다.
- 이러한 SOD와 똑같지는 않지만 유사활성 측정 방법이 실험실에서 사용되고 있는데 즉, superoxide anion의 활성을 억제시키는 물질 즉, SOD 유사활성 측정방법이 널리 이용되고 있다. 석류씨 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름의 SOD 유사활성을 측정한 결과(Fig.5), 1, 000 ppm의 농도에서 각각 15.9, 34.9 및 0.10%로나타나 에탄올 추출물에서 가장 강항 SOD 유사활성을 보였고 석류씨 기름에서는 거의 활성을 보이지 않았다. 즉, 석류씨 에탄올 추출물의 경우 catechin의 SOD 유사활성에 약 60.
- 석류씨 추출물들을 리놀레인산 기질에 각각 200 ppm 농도로 첨가한 후 과산화물가의 변화를 측정한 결과(Fig. 1), 저장 6일째의 대조구, 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름을 첨가한 리놀레인산의 과산화물가는 각각 79.2, 76.5, 71.0 및 79.6 meg/kg oil로 나타나 에탄올 추출물에서 가장 좋은 항산화효과를 보인 반면 석류씨 기름에서는 그 효과가 보이지 않았다. 에탄올 추출물의 항산화효과는 a-tocopherol 첨가구(71.
- 석류씨 추출물들을 멸균된 paper disc (8mm 직경)에 각각 일정 농도로 흡착시켜 배지에 접착, 미생물의 종류에 따라 적정온도에서 12〜24시간 동안 배양 후 형성된 저해 부위의 크기를 측정한 결과(Table 4), 석류씨 기름의 경우, Micrococcus luteus, Salmonella enteritidis에서 항균력을 나타내었으며 추출물의 농도(1,000 - 4,000 jig/disc)가 증가함에 따라 항균효과(10〜 12 mm)도 증가하였다. 그러나 물 추출물의 경우 Bacillus cereus, Escherichia coli에 대해서만 항균효과를 보였고, 에탄올 추출물의 경우에는 모든 균에 대하여 항균효과를 보이지 않았다.
- 석류씨 추출물들의 아질산염 소거능을 측정한 결과 (Fig. 4), 100 ppm 농도에서는 매우 낮은 아질산염 소거능을 보였으나 농도가 증가함에 따라 아질산염 소거능 또한 증가하는 경향을 보였다. 특히 석류씨 기름은 100 ppm 농도에서 가장 낮은 소거능을 보였으나 500 ppm 농도 이상에서는 아질산염 소거능이 크게 증가하는 경향을 보였다.
- 석류씨 추출물들의 총페놀 함량을 측정한 결과 (Table 2), 석류씨 추출물들의 건조물에 대하여 물 추 출물은 47 mg/g, 에탄올 추출물은 78 mg/g이었고 석류씨 기름은 40 mg/g로 모든 석류씨 추출물들에는 페놀성 화합물들이 존재하고 있었으며, 에탄올 추출물에서 가장 높은 함량을 보였다. 총 플라보노이드 함량은 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름에 대해 각각3.
- 석류씨의 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름의 추출수율은 각각 28.9, 13.0 및 4.9%로 석류씨 기름에서 가장 낮은 수율을 보였고, 물 추출물에서 가장 높은 추출 수율을 보였다. 물 추출물의 경우, 에탄올 추출물에 비해 약 2.
- 0, 16 및 18 mg/g으로 석류씨 기름에서 가장 높게 나타났다. 이들 추출물들에 대한 전자공여능을 측정한 결과, 1, 000 ppm의 농도에서 물 추출물의 전자공여능은 18.8%, 에탄올 추출물은 28.5%, 석류씨 기름은9.7%로 총 페놀 함량이 가장 높게 나타난 에탄올 추출물에서 가장 강한 전자공여능을 보였다. 그러나positive control로 사용한 BHT(36.
- 이상의 결과로 볼 때, 석류씨 추출물들의 항균효과는 총 페놀 함량이 가장 높은 에탄올 주줄물에서 가장 강한 항균효과가 나타나리라는 예상과는 달리, 페놀성 화합물들의 함량이 가장 낮은 석류씨 기름에서 가장 강한 항균효과를 보였다. 이는 석류씨 기름에 존재하는 성분들 중 페놀성 화합물이외의 다른 지용성 물질들에 의한 복합적 효과로 항균효과가 나타난 것으로 사료되었다
- 저장중 과산화물가가 50 meq/kg oil에 도달하는데 걸리는 시간(일)으로 유도기간을 설정한 결과, 대조구의 유도기간은 4.1일인 반면 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름 첨가구의 유도기간은 각각 4.8일, 5.3 일, 4.4일로 약 1.17배, 130배 1.07배의 연장효과를 보였다. 결론적으로 리놀레인산 기질에서의 항산화효과는 에탄올 추출물 > a-tocopherol > 물 추출물 > 석류 씨 기름의 순이었다.
- 007로 석류씨 에탄올 추출물과 비슷한 정도의 항산화효과를 보였다. 즉, 리놀레인산 에멀젼 기질에서의 항산화효과는 a-tocopherol ≥ 에탄올 추출물> 물 추출물> 석류씨 기름 순이었으며, 항산화효과의 차이는 크지 않았다.
- 10%로나타나 에탄올 추출물에서 가장 강항 SOD 유사활성을 보였고 석류씨 기름에서는 거의 활성을 보이지 않았다. 즉, 석류씨 에탄올 추출물의 경우 catechin의 SOD 유사활성에 약 60.3% 정도의 활성을 보인 것으로 나타났다.
- 4 meg/kg oil로 모든 첨가구에서 대조구보다 낮게 나타나 항산화효과를 보였다. 즉, 석류씨 추출물의 첨가농도를 200 ppm에서 500ppm으로 증가시킴에 따라 항산화 효과는 증가하였으며 에탄올 추출물 첨가구(500 ppm)는 a-tocopherol 첨가구(200 ppm)보다 항산화효과가 우수한 것으로 나타 났다.
- 석류씨 추출물들의 총페놀 함량을 측정한 결과 (Table 2), 석류씨 추출물들의 건조물에 대하여 물 추 출물은 47 mg/g, 에탄올 추출물은 78 mg/g이었고 석류씨 기름은 40 mg/g로 모든 석류씨 추출물들에는 페놀성 화합물들이 존재하고 있었으며, 에탄올 추출물에서 가장 높은 함량을 보였다. 총 플라보노이드 함량은 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름에 대해 각각3.0, 16 및 18 mg/g으로 석류씨 기름에서 가장 높게 나타났다. 이들 추출물들에 대한 전자공여능을 측정한 결과, 1, 000 ppm의 농도에서 물 추출물의 전자공여능은 18.
- 4), 100 ppm 농도에서는 매우 낮은 아질산염 소거능을 보였으나 농도가 증가함에 따라 아질산염 소거능 또한 증가하는 경향을 보였다. 특히 석류씨 기름은 100 ppm 농도에서 가장 낮은 소거능을 보였으나 500 ppm 농도 이상에서는 아질산염 소거능이 크게 증가하는 경향을 보였다. 2, 000 ppm 농도에서 물 추출물, 에탄올 주줄물 및 석류씨 기름의 아질산염 소거능은 각각 27.
- 2 meg/kg oil)와 비슷한 것으로 나타났다. 한편 물 추출물, 에탄올 추출물 및 석류씨 기름을 500 ppm 농도로 첨가한 리놀레인산 기질의 저장 6일째 과산화물가(Fig.2)는 각각 69.0, 54.4 및 75.4 meg/kg oil로 모든 첨가구에서 대조구보다 낮게 나타나 항산화효과를 보였다. 즉, 석류씨 추출물의 첨가농도를 200 ppm에서 500ppm으로 증가시킴에 따라 항산화 효과는 증가하였으며 에탄올 추출물 첨가구(500 ppm)는 a-tocopherol 첨가구(200 ppm)보다 항산화효과가 우수한 것으로 나타 났다.
- 일반적으로 전자공여능과 아질산염 소거능은 총 페놀 함량에 비례하는 것으로 알려져 있으나(이기동 등 1997), 본 실험에서는 총 페놀 함량이 가장 낮은 석류씨 기름에서 가장 강하게 나타났다. 한편 아질 산염 소거능이 있는 것으로 알려져 있는 ascorbic acid 및 BHT의 아질산염 소거능은 각각 93.8 및72.2%로 나타났다.
후속연구
- 따라서 석류씨 기름의 미지의 지방산은 다양한 생리 활성을 나타내는 linoleic acid의 기하학적 이성질체로 사료되며 이들 conjugated octadecatrienoic acid는 항암작용, 항산화작용, 항동맥경화중, 면역중진 효과에 효과가 있는 것으로 알려져 있어10-12) 석류씨 기름을 새로운 기능성 소재로써 이용할 수 있을 것으로 기대되었다.
- 일반적으로 식물성 천연물들의 항산화효과, 항균성 등은 추출방법, 추출조건 등에 따라 유효물질의 함량 및 함유패턴이 다르고, 생리적 활성도 다르게 나타나기 때문에 석류씨의 효율적인 이용을 위해서는 석류씨 추출물의 형태에 따른 체계적인 유효성분의 검증이 필요할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 물추출물, 에탄올추출물 및 석류씨 기름에 대한 항균성, 항산화성, 아질산염 소거능 및 SOD 유사활성 등의 생리활성을 비교, 검토하고자 하였다.
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