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문제 정의
- 석류 과실 내외부의 부위별 유효성분 및 효능 차이를 알아보기 위해 본 연구에서는 신석류인 고흥산과 단석류인 캘리포니아산 석류를 공시하여 석류 과실의 외과피, 주스 및 종자의 폴리페놀 함량, 안토시아닌 함량, 항산화성 및 항암성 차이를 검토하였다.
가설 설정
- 1)a~bMeans with different superscripts within a column indicate significant differences (p<0.05).
제안 방법
- , Bucheon, Korea)에서 혼합하였다. 5분 후 NaCO3 포화 용액 1 mL를 넣어 혼합하여 실온에서 1시간 방치한 후 640 nm에서 분광광도계(UV-1650PC, SHIMADZU, Kyoto, Japan)로 흡광도를 측정하였다. 페놀 화합물 함량은 표준물질 chlorogenic acid, tannic acid 및 catechin(Sigma Co.
- 900 μL DPPH 용액(100 μM)과 시료추출물의 용해한 용액(100 μL)을 혼합하여 상기방법으로 측정하여 시료가 첨가하지 않은 DPPH용액(무처리구)의 용출 peak의 면적으로 계산하였다.
- Column: Shim pack(4.6×250 mm), mobile phase: MeOH-H2O(70:30, v/v), wavelength: 517 nm, flow rate: 0.8 mL/min, attenuation: 32, injection volume: 20 μL의 HPLC 조건으로 실시하며 HPLC 에 의한 DPPH radical-scavenging 활성은 다음과 같이 구하였다.
- HPLC는 2998 photodiode array detector(Waters Corporation, Milford, MA, USA)가 장착된 Waters Alliance 2690 HPLC system(Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 사용하였으며, 분석칼럼은 Zorbax ODS column(5 μm, 250×4.6 mm i.d., Agilent, Palo Alto, CA, USA)을 이용하였다.
- 각 조사항목별 상관관계(p<0.05)를 알아보고자 총 페놀성 함량, 총 안토시아닌 함량, DPPH 라디컬 소거능 및 세포독성에 있어서 각 항목 양자 간의 상관계수를 도출하여 비교하였다.
- 고흥산과 캘리포나이산의 석류나무(Punica granatum L.) 과실을 과육, 종자 및 외과피로 분리하여 부위별 총 페놀성 함량, 안토시아닌 함량, DPPH 라디컬 소거능에 대한 항산화 활성 및 항암활성을 비교․검토하였다. 석류과실의 총 페놀성 함량은 외과피>주스>종자 순으로 유의적인 차이로 높게 나타났다.
- 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum)와 peniciline G(25 unit/mL) 및 streptomycin(25 μg/mL)를 첨가한 RPMI 1640배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2의 습윤화된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
- 900 μL DPPH 용액(100 μM)과 시료추출물의 용해한 용액(100 μL)을 혼합하여 상기방법으로 측정하여 시료가 첨가하지 않은 DPPH용액(무처리구)의 용출 peak의 면적으로 계산하였다. 시료의 DPPH radical-scavenging 활성은 ascorbic acid(대조구)와 비교하였다. Column: Shim pack(4.
- 이동상의 유속은 1 mL/min, ultraviolet-visible detector의 파장은 520 nm에서 시행하였다. 시료의 안토시아닌 피크는 크로마토그램에서 검출된 시간과 UV-Vis 스펙트럼을 표준물질의 피크와 비교하여 확인하였다(Fig. 1). 안토시아닌 화합물인 Cy3,5G, Cy3G, Dp3,5G, Dp3G, Pg3,5G, Pg3G의 표준용액은 주입된 10 μL에 5~200 μg 범위에서 직선상을 나타냈다.
- , Agilent, Palo Alto, CA, USA)을 이용하였다. 안토시아닌 분리는 이동상 용매 A(0.2 M o-phosphoric acid, pH 1.5)와 용매 B(80% acetonitrile/20% 0.2 M o-phosphoric acid, pH 1.5)를 다음과 같은 농도 구배 조건으로 총 55분에 걸쳐 시행하였다. 이동상 용매 A와 B의 비율은, 100% 용매 A를 시작으로 하여 4분까지 92%로, 이 후 10분까지 86%, 30분까지 83.
- 이것을 검정에 가장 적합하다고 판단되는 기간인 72시간 동안 배양시킨 후, 5 mg/mL 농도로 조제한 MTT 용액을 각 well당 10 μL씩 넣고 세포 배양기에서 4시간 동안 더 배양시킨 후, MTT 용액이 있는 배지를 제거하고 DMSO 150 μL를 첨가하여 30분간 교반하여 각 세포를 용해시켜 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 그 값을 아래와 같이 각 세포의 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 성장률을 환산하였고, 억제정도가 50%일 때의 추출물의 농도를 IC50값으로 나타냈다.
- 5)를 다음과 같은 농도 구배 조건으로 총 55분에 걸쳐 시행하였다. 이동상 용매 A와 B의 비율은, 100% 용매 A를 시작으로 하여 4분까지 92%로, 이 후 10분까지 86%, 30분까지 83.5%, 35분까지 74%, 55분까지 20%로 단계적으로 낮추면서, 용매 B의 비율을 상대적으로 증가시켰다. 이동상의 유속은 1 mL/min, ultraviolet-visible detector의 파장은 520 nm에서 시행하였다.
- 종양세포를 3×104 cells/mL의 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate에 90 μL/well씩 분주하고 이것을 37℃, 5% CO2 세포배양기(Forma, Germany)에서 12시간 배양하여 세포를 부착시킨 다음 추출물을 50, 100, 200, 400, 800 mg/kg 농도가 되도록 10 μL씩 첨가하였다.
- 안토시아닌 화합물인 Cy3,5G, Cy3G, Dp3,5G, Dp3G, Pg3,5G, Pg3G의 표준용액은 주입된 10 μL에 5~200 μg 범위에서 직선상을 나타냈다. 총 안토시 아닌 함량은 샘플 내 각 개별 안토시아닌 함량을 합산하여 구하였다.
- 추출액은 4℃로 설정된 4,500×g에서 20분 동안 원심분리하여 상징액을 농축플라스크로 옮기고, 남은 시료는 위와 동일한 방법으로 두 번 더 추출하였다.
- 필요에 따라 각 식물체의 메탄올 추출물을 처리하여 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도를 IC50 또는 RC50으로 하여 결과를 나타내고 저해율(inhibition rate or reduction concentration, %)을 산출하였다.
대상 데이터
- 고흥산 신석류와 캘리포니아산 단석류를 구입하여 외과피, 과육 및 종자 부분으로 나눈 후 -60℃하에서 5일간 동결 건조(SFDSM24, SAMWON ENG, Busan, Korea) 하였다. 건조된 시료를 마쇄하여 1 mm 체에 통과시킨 후 시료 당 200 g을 95% methanol 2 L에 24시간 동안 추출하여 여과한 후 그 추출액을 50℃에서 감압농축기(N-1000S-WCCA1100, Eyela, Tokyo, Japan)하여 methanol 추출물을 얻어 동결 건조하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 암세포주는 모두 인체기원의 세포주로서, Korean Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입한 폐암세포주인 Calu-6(ATCC, HTB-56)과 위암 SNU-601을 사용하였다. 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum)와 peniciline G(25 unit/mL) 및 streptomycin(25 μg/mL)를 첨가한 RPMI 1640배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2의 습윤화된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
데이터처리
- 모든 항목의 분석은 3회 반복 실시하였으며 그 결과를 SAS(30)를 이용하여 처리간의 평균치 차이는 LSD(Least significant difference) 검정을 통해 비교․분석하였다. 각 조사항목별 상관관계(p<0.
이론/모형
- HPLC에 의해 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl radical) scavenging activity 검정 방법(27)으로서 분석대상이 DPPH 용액의 흡광도(500~550 nm)와 같은 영역에 있을 경우 HPLC(HPLC system, SHIMADZU, Kyoto, Japan)를 이용하여 정량적 분석조건이 가능하다. 900 μL DPPH 용액(100μM)과 시료용액 100 μL을 혼합한 후 암조건에서 10분 동안 반응시켰다.
- 석류의 안토시아닌 함량은 Hiemori 등의 방법(26)에 따라 분석되었다. 동결건조하여 분쇄한 시료 0.
- 총 페놀성 화합물 함량은 Folin-Denis 방법(25)에 따라 분석하였다. 추출물을 1 mg/mL 농도로 조제한 후, 이 시료액 1 mL에 증류수 3 mL를 첨가하고, Folin & Ciocalteau's phenol reagent(Sigma Co.
성능/효과
- DPPH 라디컬 소거능은 외과피>주스>종자순으로 높았고, 특히 외과피의 항산화 활성은 vitamin C와 유사한 활성을 보였다.
- Folin-Denis방법에 따라 chlorogenic acid를 표준물질로 하여 분석한 석류 부위별 메탄올 추출물 농도 1,000 mg/kg 에서 총 페놀성 함량을 정량한 결과, 고흥산 석류외과피에서 238.1 mg/kg으로 가장 높았고, 주스와 종자는 각각 26.0와 23.2 mg/kg으로 낮은 함량을 보였다(Table 1). 이와 같은 경향은 캘리포니아산에서도 유사하게 나타났으며 전체적으로 고흥산(23.
- 7 mg/kg으로 낮은 함량을 보였다. 가장 많은 함량을 보인 안토시아닌 색소는 역시 Cy3,5G로 나타났고 그 다음이 Dp3,5G, Cy3G와 Dp3G 순으로 높았다(Table 2). 과실 부위별 주요한 안토시아닌은 과육과 종자는 주로 Cy3,5G와 Dp3,5G 중심으로, 외과피는 Cy3,5G와 Cy3G 중심으로, 종자에서는 Cy3,5G와 Dp3,5G 중심으로 높은 함량을 보였다.
- 한편, 총 안토시아닌 함량이 DPPH 라디컬 소거능, SNU 위암세포주 활성에 영향을 주는 상관계수는 매우 낮은 것으로 나타났다. 결국, 총 페놀성 함량의 생리활성물질이 Calu-6 폐암세포주에 대한 활성과 DPPH 라디컬 소거능에 미치는 상관계수는 매우 높아 상호간에 높은 상관성이 있음을 알 수 있었다 (Table 5).
- 고흥산 석류 과실 부위별 총 안토시아닌 함량은 외과피>주스>종자 순으로 나타났고, 함유된 주요 안토시아닌은 Cy3,5G로서 가장 높은 함량을 보였고 그 다음이 Cy3G, Dp3,5G순으로 높게 나타났다.
- 4 mg/kg) 가 가장 낮은 함량을 보였다(Table 2). 고흥산 석류에서 가장 많은 함량을 보인 안토시아닌 색소는 Cy3,5G로 나타났고 그 다음이 Cy3G, Dp3,5G와 Pg3,5G 순으로 높았다. 한편, 캘리포니아산은 주스, 외과피, 종자 순으로 주스에서 총량으로 1,539.
- 가장 많은 함량을 보인 안토시아닌 색소는 역시 Cy3,5G로 나타났고 그 다음이 Dp3,5G, Cy3G와 Dp3G 순으로 높았다(Table 2). 과실 부위별 주요한 안토시아닌은 과육과 종자는 주로 Cy3,5G와 Dp3,5G 중심으로, 외과피는 Cy3,5G와 Cy3G 중심으로, 종자에서는 Cy3,5G와 Dp3,5G 중심으로 높은 함량을 보였다. 따라서 지역간, 부위별 안토시아닌 정성적 및 정량적인 차이는 뚜렷한 것으로 나타났다.
- 과실 부위별 주요한 안토시아닌은 과육과 종자는 주로 Cy3,5G와 Dp3,5G 중심으로, 외과피는 Cy3,5G와 Cy3G 중심으로, 종자에서는 Cy3,5G와 Dp3,5G 중심으로 높은 함량을 보였다. 따라서 지역간, 부위별 안토시아닌 정성적 및 정량적인 차이는 뚜렷한 것으로 나타났다.
- 석류 과실 부위에서 총 합산의 안토시아닌 함량을 기준으로 고흥산 외과피(176.4 mg/kg)에서 가장 높은 함량을 보였고, 그 다음이 주스(52.2 mg/kg)였고, 종자(28.4 mg/kg) 가 가장 낮은 함량을 보였다(Table 2). 고흥산 석류에서 가장 많은 함량을 보인 안토시아닌 색소는 Cy3,5G로 나타났고 그 다음이 Cy3G, Dp3,5G와 Pg3,5G 순으로 높았다.
- 석류과실의 총 페놀성 함량은 외과피>주스>종자 순으로 유의적인 차이로 높게 나타났다.
- 고흥산 석류 과실 부위별 총 안토시아닌 함량은 외과피>주스>종자 순으로 나타났고, 함유된 주요 안토시아닌은 Cy3,5G로서 가장 높은 함량을 보였고 그 다음이 Cy3G, Dp3,5G순으로 높게 나타났다. 총 페놀성 함량과 Calu-6폐암세포주 활성 간이 r2=0.9706으로 가장 높았고, 그 다음이 총 페놀성 함량과 DPPH 라디컬 소거능 간, DPPH 라디컬소거능과 Calu-6 폐암세포주 활성 간 순으로 상관계수(r2)가 각각 0.8904, 0.8309로 나타나 상호 연관이 있음을 나타냈다.
- 폐암세포주(Calu-6)에 대한 추출물의 항암활성은 외과피>종자>과육 순으로 높게 나타났다.
- 있다는 보고들(33,34)과 유사한 경향이었다. 한편, 총 안토시아닌 함량이 DPPH 라디컬 소거능, SNU 위암세포주 활성에 영향을 주는 상관계수는 매우 낮은 것으로 나타났다. 결국, 총 페놀성 함량의 생리활성물질이 Calu-6 폐암세포주에 대한 활성과 DPPH 라디컬 소거능에 미치는 상관계수는 매우 높아 상호간에 높은 상관성이 있음을 알 수 있었다 (Table 5).
- 고흥산 석류에서 가장 많은 함량을 보인 안토시아닌 색소는 Cy3,5G로 나타났고 그 다음이 Cy3G, Dp3,5G와 Pg3,5G 순으로 높았다. 한편, 캘리포니아산은 주스, 외과피, 종자 순으로 주스에서 총량으로 1,539.4 mg/kg으로 가장 높은 함량을 보였고, 그 다음이 외과피와 종자 순으로 각각 161.6과 68.7 mg/kg으로 낮은 함량을 보였다. 가장 많은 함량을 보인 안토시아닌 색소는 역시 Cy3,5G로 나타났고 그 다음이 Dp3,5G, Cy3G와 Dp3G 순으로 높았다(Table 2).
후속연구
- 본 연구는 석류의 부위별 항암활성에 대해 MTT-assay라는 고전적인 방법을 통해 in-vitro 시험에 국한된 한계점이 있으며 이를 극복하기 위해 차후 활성을 보인 추출물과 분획물을 목표로 보다 정밀한 in-vivo 차원의 시험연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다.
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