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문제 정의
- 본 연구에서는 배의 면역기능조절 관련 기능식품소재로서의 가능성을 연구하고자 일차적으로 배의 메탄올 추출물이 비장세 포의 증식능과 cytokines(IFN-Y, IL-4) 생성능에 미치는 영향을 in vistro에서 즉정하였다.
제안 방법
- 정상 마우스를 ether로 치사시킨 후, 비장을 무균적으로 적출 하여 위와 같은 방법으로 비장세포액을 조제한 후, 24 well flat bottomed plate에 세포액 500 g/(4x 106 cells/m/)을 가하였다. 30 분간 배양(37°C, 5% CO?)하여 안정시킨 후, 각 well에서 배 메 탄올 추출물의 최종농도가 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.50 mg/mZ가 되도록 100 B 가하고 Con A(2 ng/m/) 100 B와 10% FBS- RPMI 배지 300 0를 가하여 24시간 동안 배양하여 얻은 배양액 을 -70°C에 보관하면서 사용하였다. PharMingen에서 제공한 sandwich ELISA법에 준하여 배양액 중의 cytokine 생성량을 측 정하였다.
- 즉, anti-mouse IFN-y monoclonal antibody 또는 anti-mouse IL-4 monoclonal antibody# 96 well flat bottomed plate(Dynex Immulon 4HBX)에 도포한 후 acetate plate sealer 로 밀봉하여 4°C에서 하룻밤 방치한 후 washing buffer로 3회 세척하고 blank well을 제외한 well에 각각 200 B의 10% FBS- PBS를 가하고 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 3회 세척 후 비 장세포를 배양하여 얻은 배양액을 각 welM] 100 B씩 duplicate 로 가하고, 검량선을 작성하기 위해서는 recombinant mouse IFN--)를 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 pg/mZ, recombinant mouse IL-4를 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81 pg/m/ 농 도로 희석하여 100 W씩 duplicated. 가한 후, plate를 acetate plate sealer로 봉하여 4°C에서 하룻밤 방치하였다.
- 배의 메탄올 추출물 자체가 in 面知에서 비장세포의 증식능을 증가시키고, T 세포 mitogen인 Con A와 B 세포 mitogen인 LPS로 유도되는 비장세포 증식능도 항진시켰다. 또한 P-M은 cytokine(IFN-Y, IL-4)의 생성을 농도의존적으로 유의성 있게 증 가시켜 세포성 및 체액성 면역반응을 증강시킬 수 잇는 가능성 을 시사해 주어 배의 면역조절 기능식품 소재로서의 개발가능성 에 대한 계속적인 연구가 필요하다.
- 배의 추출물(P-M)이 세포성 및 체액성 면역반응에 미치는 영 향을 평가하기 위하여 일차적으로 In 0汐0에서 비장세포 중 T 세포를 자극하여 증식을 유도하는 miotogen 또는 B 세포를 자 극하여 증식을 유도하는 mitogen^을 정상 마우스의 비장세포 에 P-M과 동시에 처리하여 배양하거나, P-M만을 비장세포에 가 하여 배양하여 비장세포의 증식정도를 MTT assay로 측정하여 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다.
- 비장세포액 (lx IO, cells/m/)을 96 well plat冽] well 당 100 叫 씩 가하고 각 well에서 배 메탄올 추출물의 최종농도가 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.50mg/mZ가 되도록 10% FBS-RPMI 배지액 에 녹여 well 당 20 |北씩 가하였다. 여기에 mitogen(Con A; 2 |ig/ ml, LPS; 50 |回1血) 또는 10% FBS-RPMI 배지액을 20 山 가한 후 예비실험결과 임파구 증식능이 최고에 달한 배양시간을 택하 여 72시간 동안 배양(37°C, 5% CO, 하였다.
- 비장세포의 cytokinedFN^y, IL-4) 생성능에 미치는 영향 배의 메탄올 추출물이 Con A로 유도되는 비장세포의 cytokine 생성능에 미치는 영향을 알아 보기 위해 마우스 비장세포에 Con A와 P-M을 농도별로 동시에 가하여 배양한 후 배양액 중의 IFN- 7와 IL-42] 생성량을 측정하여 그 결과를 Fig. 2와 Fig. 3에 나타 내었다.
- 5회 반복 세 척 한 후 biotinylated anti-mouse IFN-y polyclonal antibody 또 는 biotinylated anti-mouse IL-4 polyclonal antibody용액을 well당 100 B씩 가하고 2시간 후에 다시 5회 세척하고 100 昭 avidin-horseradish peroxidase conjugate용액을 각 well에 가하 였다. 실온에서 30분간 방치한 뒤 platef- 7회 세척하고, 각 well 에 tetraminebezidine(TMB)과 hydrogen peroxidase를 같은 부 피로 혼합한 TMB substrate 용액을 100 B씩 가하고 15분 후 50 B의 2N-H2SO4를 가하여 반응을 정지시킨 다음 30분이내에 ELISA reader을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 검량 선으로부터 자동적으로 cytokines(IFN-Y, IL-4) 함량을 산출하 였다.
- 본 실험에 사용한 ^5L(Pyrus pyrifolia)^ 전남 나주시에 있는 나주배연구소로부터 제공받아 저온실에 보관하였다. 저장 후 1 개월 이내에 신선한 것을 선택하여 과피와 과속의 폐기부분을 제 거한 후 잘게 자른 과육 1kg을 methanol 1Z로 수욕상에서 3시 간동안 추출하는 조작을 2회 반복하고 추출물을 합하여 감압농 축하였다. 이를 동결건조하여 얻은 methanol 추출물(pear methanol extracts, P-M)의 수득율은 6.
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Cytokines(IFN-y, IL-4) 생성능 측정
정상 마우스를 ether로 치사시킨 후, 비장을 무균적으로 적출 하여 위와 같은 방법으로 비장세포액을 조제한 후, 24 well flat bottomed plate에 세포액 500 g/(4x 106 cells/m/)을 가하였다. 30 분간 배양(37°C, 5% CO?)하여 안정시킨 후, 각 well에서 배 메 탄올 추출물의 최종농도가 0.
- PharMingen에서 제공한 sandwich ELISA법에 준하여 배양액 중의 cytokine 생성량을 측 정하였다. 즉, anti-mouse IFN-y monoclonal antibody 또는 anti-mouse IL-4 monoclonal antibody# 96 well flat bottomed plate(Dynex Immulon 4HBX)에 도포한 후 acetate plate sealer 로 밀봉하여 4°C에서 하룻밤 방치한 후 washing buffer로 3회 세척하고 blank well을 제외한 well에 각각 200 B의 10% FBS- PBS를 가하고 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 3회 세척 후 비 장세포를 배양하여 얻은 배양액을 각 welM] 100 B씩 duplicate 로 가하고, 검량선을 작성하기 위해서는 recombinant mouse IFN--)를 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.
- 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 빙냉의 RPMI-1640 배 지액에 넣고 teflon pestle을 이용하여 200 mesh stainless sieve 를 통과시키고 이 세포액에 RBC lysis buffer를 가하여 원심분 리 (lOOOrpm, 10 min, 4°C)하여 적혈구를 용혈시킨 후 상등액을 제거하였다. 침전된 비장세포에 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배 지 액을 가하여 trypan blue exclusion m*) ethod 로 1 x 107 cells/m/의 비장세포액이 되도록 조정하였다.
대상 데이터
- 3 〜 4주령인 ICR계 암컷 마우스를 유한양행 중앙연구소로부터 분양받아 고형사료와 물을 자유롭게 공급하면서 실험동물실에서 2~3주간 적응시킨 毛 체중 23土2 g의 마우스를 실험에 사용하 였다. 실험동물실의 온도는 21~24°C, 습도는 40-60%, 명암교 대는 12시간을 유지하였다.
- 본 실험에 사용한 ^5L(Pyrus pyrifolia)^ 전남 나주시에 있는 나주배연구소로부터 제공받아 저온실에 보관하였다. 저장 후 1 개월 이내에 신선한 것을 선택하여 과피와 과속의 폐기부분을 제 거한 후 잘게 자른 과육 1kg을 methanol 1Z로 수욕상에서 3시 간동안 추출하는 조작을 2회 반복하고 추출물을 합하여 감압농 축하였다.
- 에서, 그리고 concanavalin A(Con A), lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma Co. 에서 3-(4, 5, - dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium (MTT)는 Amresco 에서 구입하였으며, Mouse IL-4 set, Mouse IFN-y set는 PharMingen에서 구입하였다. 기타 시약은 세포 배약용 및 특급 으로 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 50 mg/mZ가 되도록 100 B 가하고 Con A(2 ng/m/) 100 B와 10% FBS- RPMI 배지 300 0를 가하여 24시간 동안 배양하여 얻은 배양액 을 -70°C에 보관하면서 사용하였다. PharMingen에서 제공한 sandwich ELISA법에 준하여 배양액 중의 cytokine 생성량을 측 정하였다. 즉, anti-mouse IFN-y monoclonal antibody 또는 anti-mouse IL-4 monoclonal antibody# 96 well flat bottomed plate(Dynex Immulon 4HBX)에 도포한 후 acetate plate sealer 로 밀봉하여 4°C에서 하룻밤 방치한 후 washing buffer로 3회 세척하고 blank well을 제외한 well에 각각 200 B의 10% FBS- PBS를 가하고 2시간 동안 실온에서 방치하였다.
성능/효과
- 값 에 비하여 각각 58, 103, 65, 55, 33% 정도 유의성 있게 증가되 었다. Con A 또는 LPS를 첨가하여 배양한 대조군(Fig. IB)의 O.D.값이 mitogens을 첨가하지 않고 비장세포만을 배양한 대조 군(Fig. 1A)보다 높아 Con A 또는 LPS에 의해 비장세포 증식이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. Fig.
- 50 mg/m/을 제 외한 모든 농도에서 약 17-28% 정도 증가되는 현상을 보였다. 또한 P-M과 LPS를 동시에 첨가하여 배양한 실험군의 O.D.값도 LPS만을 첨가하여 배양한 군의 O.D.값보다 증가되는 현상을 보 였으며, 특히 0.31 mg/m/ 농도에서는 현저호] (약 54%) 유의성 있 게0<0.01) 증가되었다. 이러한 실험결과로 배의 메탄올 추출물 은 그 자체가 비장세포를 자극하여 증식을 증가시키고, T 세포 를 자극하는 Con A 또는 B 세포를 자극하는 LPS mitogen으로 유도되는 비장세포 증식도 증가시켜 세포성 면역 및 체액성 면 역기능을 항진 시킬 수 있음을 시사해 주고 있다.
- 마우스 비장세포 증식의 최적조건을 결정하기 위하여 Con A 농도별(1, 2, 4 |丄以m/), LPS 농도별(25, 50, 100 飓向)로, 배양시 간별(24, 48, 72 hr)로 증식정도을 예비실험한 결과, Con A 2 卩以 ml, LPS 50)xg/m/의 농도와 72시간 배양에서 최고의 임파구 증 식능이 관찰되었다.
- 01) 증가되었다. 이러한 실험결과로 배의 메탄올 추출물 은 그 자체가 비장세포를 자극하여 증식을 증가시키고, T 세포 를 자극하는 Con A 또는 B 세포를 자극하는 LPS mitogen으로 유도되는 비장세포 증식도 증가시켜 세포성 면역 및 체액성 면 역기능을 항진 시킬 수 있음을 시사해 주고 있다.
후속연구
- 배의 메탄올 추출물 자체가 in 面知에서 비장세포의 증식능을 증가시키고, T 세포 mitogen인 Con A와 B 세포 mitogen인 LPS로 유도되는 비장세포 증식능도 항진시켰다. 또한 P-M은 cytokine(IFN-Y, IL-4)의 생성을 농도의존적으로 유의성 있게 증 가시켜 세포성 및 체액성 면역반응을 증강시킬 수 잇는 가능성 을 시사해 주어 배의 면역조절 기능식품 소재로서의 개발가능성 에 대한 계속적인 연구가 필요하다.
- 이상의 결과로 배 메탄올 추출물의 직접 노출에 의해 비장세 포의 Thl 반응과 Th2 반응이 모두 증가되었음을 알 수 있고 IFN-r와 IL-4에 영향을 받는 B 세포 반응에도 배의 메탄올 추출 물이 영향을 미칠 것으로 예측이 되어 생체내에서의 체액성 면 역기능에 대한 실험을 진행 중이다.
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