자외선B 노출로 인해 손상된 피부세포에 대한 돌배나무잎 추출물의 보호효과 Protective Effects of Pyrus pyrifolia NAKAI Leaf Extracts on UVB-induced Toxicity in Human Dermal Fibroblasts원문보기
피부 손상은 주로 자외선, 열, 담배 등과 같은 환경적 요인으로부터 초래되는데, 이는 활성산소종의 과생성으로 인한 피부노화와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 돌배(Pyrus pyrifolia NAKAI)는 전 세계적으로 많이 소비되는 과일로써 항암, 항산화, 항염증효과가 알려져 있다. 본 연구에서는 돌배나무잎 추출물(Pyrus pyrifolia leaf extract, PPE)의 ultraviolet B (UVB)스트레스에 대한 피부 섬유아세포 보호효과를 검증하였다. Lactate dehydrogenase assay와 DCF-DA를 이용한 정성분석 실험은 PPE가 인간의 섬유아세포에서 UVB 스트레스에 의해 유발된 세포독성 및 과생성된 활성산소종을 농도 의존적으로 억제할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 기능저하, 막전위 저하, 그리고 세포사멸과정의 핵심 인자인 caspase-3 활성도 유의하게 억제함을 보여주었다. 결론적으로, PPE는 UVB스트레스에 의해 과생성된 활성산소종을 억제시켰으며, 이로 인해 생기는 피부세포 사멸을 효과적으로 저해함을 확인하였다.
피부 손상은 주로 자외선, 열, 담배 등과 같은 환경적 요인으로부터 초래되는데, 이는 활성산소종의 과생성으로 인한 피부노화와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 돌배(Pyrus pyrifolia NAKAI)는 전 세계적으로 많이 소비되는 과일로써 항암, 항산화, 항염증효과가 알려져 있다. 본 연구에서는 돌배나무잎 추출물(Pyrus pyrifolia leaf extract, PPE)의 ultraviolet B (UVB)스트레스에 대한 피부 섬유아세포 보호효과를 검증하였다. Lactate dehydrogenase assay와 DCF-DA를 이용한 정성분석 실험은 PPE가 인간의 섬유아세포에서 UVB 스트레스에 의해 유발된 세포독성 및 과생성된 활성산소종을 농도 의존적으로 억제할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 기능저하, 막전위 저하, 그리고 세포사멸과정의 핵심 인자인 caspase-3 활성도 유의하게 억제함을 보여주었다. 결론적으로, PPE는 UVB스트레스에 의해 과생성된 활성산소종을 억제시켰으며, 이로 인해 생기는 피부세포 사멸을 효과적으로 저해함을 확인하였다.
Skin damage is mainly caused by environmental factors such as ultraviolet light, heat, and smoking. It is known that reactive oxygen species production is commonly involved in the pathogenesis of skin damage induced by these factors, causing skin aging. Pyrus pyrifolia Nakai continues to be a popula...
Skin damage is mainly caused by environmental factors such as ultraviolet light, heat, and smoking. It is known that reactive oxygen species production is commonly involved in the pathogenesis of skin damage induced by these factors, causing skin aging. Pyrus pyrifolia Nakai continues to be a popular and highly consumed fruit in many countries with known beneficial effects including antitumor, antioxidative, and anti-inflammatory effects. However, there is no evidence of a therapeutic effect of Pyrus pyrifolia extract (PPE) against skin aging via inhibition of mitochondria-mediated apoptosis. In this study, we investigated PPE protective effect against photoaging induced by UVB ($50mJ/cm^2$) in HS68 human dermal fibroblasts. Lactate dehydrogenase assay showed that PPE significantly protected HS68 cells against UVB-induced damage in a dose-dependent manner. Other assays using DCF-DA demonstrated that PPE protected HS68 cells by regulating reactive oxygen species production. PPE also regulated mitochondrial dysfunction and mitochondrial membrane potential induced by UVB, and inhibited UVB-induced caspase-3 activity. These results indicate that PPE protects human dermal fibroblasts from UVB-induced damage by regulating the oxidative defense system.
Skin damage is mainly caused by environmental factors such as ultraviolet light, heat, and smoking. It is known that reactive oxygen species production is commonly involved in the pathogenesis of skin damage induced by these factors, causing skin aging. Pyrus pyrifolia Nakai continues to be a popular and highly consumed fruit in many countries with known beneficial effects including antitumor, antioxidative, and anti-inflammatory effects. However, there is no evidence of a therapeutic effect of Pyrus pyrifolia extract (PPE) against skin aging via inhibition of mitochondria-mediated apoptosis. In this study, we investigated PPE protective effect against photoaging induced by UVB ($50mJ/cm^2$) in HS68 human dermal fibroblasts. Lactate dehydrogenase assay showed that PPE significantly protected HS68 cells against UVB-induced damage in a dose-dependent manner. Other assays using DCF-DA demonstrated that PPE protected HS68 cells by regulating reactive oxygen species production. PPE also regulated mitochondrial dysfunction and mitochondrial membrane potential induced by UVB, and inhibited UVB-induced caspase-3 activity. These results indicate that PPE protects human dermal fibroblasts from UVB-induced damage by regulating the oxidative defense system.
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문제 정의
또한, 배의 과피는 고혈당 억제 및 blood urea nitrogen과 blood creatinine의 증가 억제, 항산화 효과, α-glucosidase 저해 효과 및 항균 효과가 있는 것으로 보고되었다[12,13]. 기 발표된 연구를 종합해 볼 때, 위 소재는 라디칼 소거능을 통한 항세포 사멸 억제가 가능할 것으로 충분히 예상되나, 아직 연구된 바 없어, 이를 검증 및 기능성소재로의 적용 가능성을 검토하였다.
최근 많은 천연물들의 ROS 소거능 효과를 통한 피부보호효과 및 항노화효과를 증명한 바가 있으며, 고수추출물, 호두추출물, 금은화 추출물, 가래나무잎추출물 등이 그 예이다[17-20]. 따라서 본 연구에서는 이러한 활성산소종이 UVB로 유도된 세포독성 및 사멸에 실질적으로 관여하는지 규명하기 위하여 세포 내 축적된 활성산소종의 양을 DCF-DA시약을 사용하여 측정하였다. Figure 2와 같이 대조군의 경우 227.
따라서 많은 연구자들은 위의 기전을 통해 피부세포사멸억제를 보고한 바 있으며, 기 발표된 효두추출물의 경우 피부세포에서 미토콘드리아손상과 동시에 B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)-associated X 및 Bcl-2의 변화가 생기고 cytochrome c의 분비로 인해 caspase-3 활성억제 효과를 보였다고 보고된 바 있다[18]. 본 연구에서는 PPE의 caspase-3 활성 억제능을 확인하다. UVB 조사로 인해 caspase-3의 활성이 대조군 대비 260.
본 연구에서는 돌배나무잎추출물(PPE)의 피부세포 보호효과를 평가하기 위하여, HS68세포를 UVB 처리 하여 산화적 스트레스를 유도한 모델을 이용하여 피부 세포독성, ROS 생성능, 미토콘드리아 막전위의 기능 및 apoptosis 관련인자인 caspase-3 활성에 미치는 PPE의 효과를 측정하였으며 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
따라서, Figure 1A와 같이, 10 ∼ 200 µg/mL의 PPE를 HS68 세포주에 24 h 동안 처리하고 LDH assay로 세포독성영향력을 측정한 결과, 200 µg/mL 농도까지 영향이 없었다. 이를 바탕으로 UVB를 조사하여 세포독성에 미치는 PPE의 보호효과를 검토하였다. Figure 1B 결과와 같이, 대조군의 세포독성이 217.
제안 방법
UVB는 세포 내 신호전달을 통하여 면역억제, 염증 촉진, 유전자손상 등을 매개하는 것으로 알려져 있으며, 특히 이러한 신호 전달 과정의 시작은 산화적 스트레스가 중요한 역할을 한다[1-4]. UVB로 유도된 섬유아세포의 산화적 손상에 대한 PPE의 보호효과를 검토 하기 위해, 먼저 PPE를 단독으로 처리하고 세포에 미치는 영향을 살펴보았다. LDH는 모든 세포의 세포질 안에 존재하는 효소로서 pyruvic acid와 lactic acid의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, LDH를 내포한 세포가 파괴될 때 흘러나와 LDH가 상승한다[15].
또한 처리가 끝난 세포에 미토콘드리아 막 전위 측정을 위해 JC-1을 5 µM 농도로 1 h 처리하여, fluorescence excitation 485 nm, emission 530 nm로 형광 강도를 측정하였다.
JC-1은 낮은 농도에서는 monomer로 존재하여 녹색형광을 내며, 높은 농도에서는 J-aggregate를 형성하여 넓은 범위의 흥분스펙트럼을 나타내기 때문에 mitochondrial membrane potential을 측정하는 민감한 색소로 이용되고 있다[23]. 본 실험에서는 JC-1 시약을 통해 미토콘드리아의 막전위 측정을 하여 PPE의 효과를 평가해 보았으며, 미토콘드리아의 전자전달계에 있는 NADH dehydrogenase 활성 또한 측정하였다. 연구 결과, UVB 조사군은 NADH dehydrogenase가 대조군에 대비하여 28.
처리가 끝난 세포를 모은 후 lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출한 후 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등 액을 Bradford assay로 단백질 농도를 정량한 후 caspase-3 activity kit를 통해 측정하였다.
또한 처리가 끝난 세포에 미토콘드리아 막 전위 측정을 위해 JC-1을 5 µM 농도로 1 h 처리하여, fluorescence excitation 485 nm, emission 530 nm로 형광 강도를 측정하였다. 이미지는 fluorescence microscope를 이용해 촬영하였다.
9”E)에 자생하는 수종을 대상으로 부위별로 시료를 채취하였다. 잡질을 제거한 잎에 10배의 70% 에탄올을 가하여 24 h 침출한 후 동결 건조하여 21.29%의 추출물(PPE)을 수득하였다. -20 ℃에서 보관하여 실험 시 용매에 녹여 사용하였다.
추출물의 ROS 소거능 측정을 위해 96-well black plate에 HS68 cell은 1.3 × 104 cells/well씩 분주하고 24 h 배양한 후, UVB (Sankyo Denki sunlamps)를 50 mJ/cm2 (40 s 동안)로 노출하였으며, 추출물 10 ∼ 200 µg/mL 농도로 1 h 동안 처리하였다.
대상 데이터
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin (P/S)은 Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), phosphate buffer saline (PBS), 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), paraformaldehyde (PFA) 등은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, CA, USA)에서 구입하였다. 5,5',6,6'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine iodide(JC-1) kit는 Thermofisher Scientific (San Jose, CA, USA)에서 구입하였으며, caspase-3 fluorometric substrate kit는 Biovision (Milpitas, CA, USA)에서 구입하였다.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin (P/S)은 Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 돌배나무잎은 2014년 6월 초순에 강원도 횡성군(37°28’35.8”N, 127°42’18.9”E)에 자생하는 수종을 대상으로 부위별로 시료를 채취하였다.
데이터처리
모든 측정값은 mean ± standard error of mean으로 표시하였다.
모든 측정값은 mean ± standard error of mean으로 표시하였다. 본 연구의 통계처리는 Graphpad Prism 5.0 (San Diego, CA) 프로그램을 사용하여, one-way ANOVA를 이용하였으며, 사후검정은 Tukey test를 이용하여 평균값의 유의성을 5% 미만의 한계로 조사하였다.
이론/모형
ROS 측정은 DCF-DA를 사용하여 fluorescence를 측정하는 방법을 이용하였다[11]. 추출물의 ROS 소거능 측정을 위해 96-well black plate에 HS68 cell은 1.
성능/효과
1) PPE를 HS68 세포에 10, 50, 100, 200 µg/mL의 농도로 24 h 배양 후 LDH assay를 수행한 결과 모든 농도에서 독성이 없는 것으로 나타났다.
2) UVB로 산화적 스트레스를 24 h 유도하였을 때 미토콘드리아의 막전위가 감소되었으며, PPE 200 µg/mL에서 이러한 감소를 통계적으로 유의하게 회복시켰다.
PPE 및 UVB 처치 후 농도 의존적으로 세포독성을 감소시켰을 뿐만 아니라, 50, 100, 200 µg/mL의 농도에서 ROS활성능이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.
UVB 조사로 인해 caspase-3의 활성이 대조군 대비 260.64 ± 17.01%로 나타나 유의한 증가를 관찰할 수 있었으며, 이에 PPE를 처리한 결과 caspase-3 수준이 PPE 50 ∼ 200 µg/mL 농도에서 대조군 대비하여 173.01 ± 30.52 – 136.44 ±4.44%로 통계적으로 유의하게 감소하였으며, 이는 vitamin C 100 µM 농도의 효과와 비슷한 정도로 확인되었다(Figure 5).
2) UVB로 산화적 스트레스를 24 h 유도하였을 때 미토콘드리아의 막전위가 감소되었으며, PPE 200 µg/mL에서 이러한 감소를 통계적으로 유의하게 회복시켰다. 뿐만 아니라, NADH dehydrogenase의 발현 역시 유의하게 회복시키는 것으로 나타났다.
뿐만 아니라, UVB 조사군의 미토콘드리아 막전위는 대조군에 대비하여 63.32 ± 5.16%를 나타내어 유의하게 억제되었고, PPE를 처리한 결과 UVB의 산화스트레스에 대하여 PPE 200 µg/mL 농도에서 대조군에 대비 하여 78.65 ± 6.13%으로 통계적으로 유의하게 감소하였다(Figure 4).
연구 결과, UVB 조사군은 NADH dehydrogenase가 대조군에 대비하여 28.20 ± 1.42%로 나타내어 유의하게 감소하였으며, PPE를 처리한 결과 UVB의 산화스트레스에 대하여 PPE 10 ∼ 200 µg/mL 농도에서 대조군 대비하여 각각 57.27 ± 4.84 과 71.76 ± 1.65%으로 통계적으로 유의하게 보호하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3).
뿐만 아니라, 양성대조군 vitamin C 100 µM 농도와 비교하였을 때와 상응하는 세포독성억제 효과를 확인할 수 있었다(Figure 1C)[15]. 이 결과를 통해 PPE가 UVB에 의해 유도된 피부세포독성을 강력하게 억제한다는 것을 확인하였다.
종합적으로 해석해보면, PPE는 UVB 스트레스에 의해 oxidant chemicals의 불균형의 발생으로 과잉생성된 ROS를 억제하였고, 이로 인해 단계적으로 생기는 미토콘드리아 막전위 및 기능을 안정화 시켰다. 뿐만 아니라, 피부세포사멸의 최종산출물인 caspase-3 활성을 감소시킨 효과를 보였으므로, 강력한 산화스트레스 억제를 통한 항세포 사멸효과 소재라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
돌배나무는 무엇인가?
돌배나무(Pyrus pyrifolia NAKAI)는 장미과에 속하는 낙엽교목으로, 열매는 식용으로 널리 알려져 있다. 한의학적으로 해열(解熱) 효과가 있으며, 토사(吐瀉), 개선(疥癬) 등에 사용되어 왔다[6].
과도한 자유 라디칼 생성에 의해 산화 방어 시스템의 균형이 무너지면 어떤 문제가 발생하는가?
지속적으로 자외선에 노출 시 피부 세포 안에서는 자유 라디칼(free radicals)의 과도한 생성과 함께 산화 방어 시스템의 균형이 깨지게 된다[3-5]. 이와 같은 불균형은 피부 매트릭스 조직을 파괴하며, 세포 내 구조 및 세포막 손상을 일으켜 피부주름과 같은 노화를 가속화 시킨다고 알려져 있다[3-5]. 따라서 많은 연구자 및 산업계에서는 과생성된 활성산소를 억제 가능한 소재를 찾고, 이를 이용한 피부노화 예방 건강기능식품 및 화장품 개발을 위해 노력하고 있다.
돌배나무에는 어떤 성분들이 함유되어 있는가?
한의학적으로 해열(解熱) 효과가 있으며, 토사(吐瀉), 개선(疥癬) 등에 사용되어 왔다[6]. 돌배나무에는 chlorogenic acid, catechin, gallocatechin, epigallocatechin, procyanidin B-3-3-O-gallate 등의 성분이 함유되어 있다고 알려져 있으며, 최근 많은 연구를 통해 다양한 활성 효과가 밝혀졌다[7-9]. 배의 과즙은 피부 보습 효과 이외에도, 알코올 분해 활성을 증가시키는 것으로 보고되었으며, 잎 추출물은 효소 반응을 이용한 항산화효과 및 대식세포에서의 항염증 효과가 있다고 보고되었다[7,9-11].
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