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제안 방법
- 3에서 보듯이 전체 well에서 DNA가 제대로 추출됨을 확인하였고, DNA 양에 있어서 well간에 변이가 적어 이후 분석에서 신뢰성 있는 결과를 기대할 수 있었다 이렇게 추출한 96 well DNA는 벼 품종의 genotyping 분석에 적용하였다. 6종의 microsatellite 마커를 한번에 증폭하는 multiplex PCR kit(자체 제작)을 이용하여 PCR한 후에, 자동 염기서열분석장치(MegaBACElOOO, GE healthcare)로 capillary electrophoresis를 수행하였고, Fragment profiler vl.2 softwares genotyping 결괴'를 분석하였다. 그림 4는 96개 쌀 시료로부터 추출한 DNA 의 genotyping 결과를 gel view로 보여주는데, 96개 well에서 6종의 마커 밴드가 모두 분석 가능함을 알 수 있었다.
- 상등액을 모두 버린 후에, 70% ethanol 600 ㎕를 넣고 잘 섞어준 뒤 5분간 원심분리 하고 상등액을 모두 버렸다. DNA가 침칙된 tube는 ethanol 성분이 완전히 제거될 때까지 공기 중에 방치했으며, 수분이 없어진 것을 확인하고 250 ng/mg 의 RNase A가 들어있는 TE buff&를 50 ㎕씩 넣어 37℃에서 20분간 반응시켜 침착된 DNA를 해리시켰다. 추출된 DNA 용액은 아가로스젤 전기 영동과 UV-흡광도 측정으로 농도와 순도를 확인하였다.
- 시료 분쇄 이후 전 과정을 96-well plate상에서 새로 제시된 방법으로 DNA 추출을 진행하였고, 이렇게 plate 단위로 추출한 DNA는 tube에서 추출한 DNA와 동등한 양과 순도를 나타내었다. Fig. 3에서 보듯이 전체 well에서 DNA가 제대로 추출됨을 확인하였고, DNA 양에 있어서 well간에 변이가 적어 이후 분석에서 신뢰성 있는 결과를 기대할 수 있었다 이렇게 추출한 96 well DNA는 벼 품종의 genotyping 분석에 적용하였다. 6종의 microsatellite 마커를 한번에 증폭하는 multiplex PCR kit(자체 제작)을 이용하여 PCR한 후에, 자동 염기서열분석장치(MegaBACElOOO, GE healthcare)로 capillary electrophoresis를 수행하였고, Fragment profiler vl.
- 따라서 DNA의 순도를 확인하기 위해 UV 흡광도를 측정하여 각 방법으로 추출한 DNA의 흡광도를 비교하였다 (Table 1). A260/A280의 값을 비교한 결과, 방법 A는 볍씨, 현미 백미 세 가지 형태로부터 얻어진 DNA에 대한 평균값이 각각 1.
- , 2002). 따라서 본 연구에서는 phenol 대신 5M guanidine을 단백질 변형제로서 사용하였으며, 회수율을 높이기 위해 acetic acid와 potassium acetate를 DNA 침전에 이용하였다(Wong et al., 1990). 또한 한 번에 192개의 쌀 시료를 1분 안에 분쇄시킬 수 있는 기기를 이용하고, 전 추출 과정을 96-well plate 단위로 진행하여 소요시간 및 노동을 대폭 단축하였다.
- 있는 방법들보다 우수한 것으로 나타났다. 또한 실험 절차도 보다 단순하며 DNA 추출 시간도 보다 빠르기 때문에, 다량의 시료를 처리해야 하는 high-throughput system에 적합한 것으로 입증되었다 이에 따라, 새로 제시된 방법을 이용하여 다량의 쌀 genotyping을 위한 high-throughput 시스템을 구축하였다.
- , 1990). 또한 한 번에 192개의 쌀 시료를 1분 안에 분쇄시킬 수 있는 기기를 이용하고, 전 추출 과정을 96-well plate 단위로 진행하여 소요시간 및 노동을 대폭 단축하였다. 이는 이미 보고된 방법을 토대로 쌀 DNA 추출 방법을 재설계 한 것이며, 앞서 언급한 단점들을 극복하여 대량의 DNA 추출시 신속하고 유해성이 적으며 비용 측면에서 매우 유리할 것으로 생각한다.
- 먼저 96-well Deep well plate에서 96개 시료를 한번에 처리하는 방법을 적용하였다 시료의 분쇄는 자동분쇄기인 TissueLyser (Qiagen)를 사용하여 수행하였는데, 막자사발을 이용하여 분쇄한 결과와 비교해 볼 때 별반 차이가 없었다. 막자사발을 이용하여 많은 시료를 분쇄하는 데에는 상당한 시간과 노동이 필요하나, 자동분쇄기를 사용하였을 때는 192개의 시료를 단 1-2분에 완전 분쇄가 가능하였다.
- 않는 경우가 많다. 새로 제시된 방법으로 추출한 DNA가 일반적인 PCR 분석에 이용할 수 있는지를 확인하기 위해, 분자유전학과 육종학 등의 연구에 널리 쓰이는 여러가지 분자표지들 중 가장 빈번하게 활용되는 STS marker, microsatellite marker, SNP marker를 이용해 PCR을 수행하였다(Fig. 2).
- 새로 제시된 방법의 DNA 추출 성능을 시험하기 위해 볍씨 (seed rice), 현미 (brown rice), 백미 (white rice)의 시료로부터 DNA를 추출하였고, 대조군으로 유사한 방식의 상용 제품인 P사와 S사의 plant genomic DNA extraction kit 제품의 방법을 이용하여 같은 시료에서 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 1% 아가로스젤에 전기 영동하여 DNA의 농도를 확인하였다(Fig.
- 막자사발을 이용하여 많은 시료를 분쇄하는 데에는 상당한 시간과 노동이 필요하나, 자동분쇄기를 사용하였을 때는 192개의 시료를 단 1-2분에 완전 분쇄가 가능하였다. 시료 분쇄 이후 전 과정을 96-well plate상에서 새로 제시된 방법으로 DNA 추출을 진행하였고, 이렇게 plate 단위로 추출한 DNA는 tube에서 추출한 DNA와 동등한 양과 순도를 나타내었다. Fig.
- 제공받은 품종 시료를 이용하였다. 우선 도정된 정도에 따라 볍씨, 현미, 백미로 구분하였으며, 볍씨는 백진주 쌀 현미는 히토메보레, 백미는 추청쌀을 이용하였다. 추출 효과를 검증하기 위해 대조군으로 국외의 P사 제품(Promega, USA)과 국내 S사(Solgent) 제품을 사용하여 볍씨, 현미, 백미에서 동시에 DNA 추출을 진행하였다.
- 우선 도정된 정도에 따라 볍씨, 현미, 백미로 구분하였으며, 볍씨는 백진주 쌀 현미는 히토메보레, 백미는 추청쌀을 이용하였다. 추출 효과를 검증하기 위해 대조군으로 국외의 P사 제품(Promega, USA)과 국내 S사(Solgent) 제품을 사용하여 볍씨, 현미, 백미에서 동시에 DNA 추출을 진행하였다.
- DNA가 침칙된 tube는 ethanol 성분이 완전히 제거될 때까지 공기 중에 방치했으며, 수분이 없어진 것을 확인하고 250 ng/mg 의 RNase A가 들어있는 TE buff&를 50 ㎕씩 넣어 37℃에서 20분간 반응시켜 침착된 DNA를 해리시켰다. 추출된 DNA 용액은 아가로스젤 전기 영동과 UV-흡광도 측정으로 농도와 순도를 확인하였다.
- 추출하였다. 추출한 DNA를 1% 아가로스젤에 전기 영동하여 DNA의 농도를 확인하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- DNA 추출에 사용된 쌀 시료는 작물과학원과 다카라 바이오(일본)로부터 제공받은 품종 시료를 이용하였다. 우선 도정된 정도에 따라 볍씨, 현미, 백미로 구분하였으며, 볍씨는 백진주 쌀 현미는 히토메보레, 백미는 추청쌀을 이용하였다.
- PCR 반응에 사용된 프라이머는 본 실험실에서 벼 게놈연구에 사용하는 STS marker와 microsatellite marker, SNP marker에 해당하는 프라이머를 임의로 선발하여 사용하였다. PCR 반응은 총 20 U1 부피에 다음과 같이 각 용액을 첨가하였다; 10XPCR buffer 2 µl, dNTPs(2.
- 막자사발을 이용하여 많은 시료를 분쇄하는 데에는 상당한 시간과 노동이 필요하나, 자동분쇄기를 사용하였을 때는 192개의 시료를 단 1-2분에 완전 분쇄가 가능하였다. 시료 분쇄 이후 전 과정을 96-well plate상에서 새로 제시된 방법으로 DNA 추출을 진행하였고, 이렇게 plate 단위로 추출한 DNA는 tube에서 추출한 DNA와 동등한 양과 순도를 나타내었다.
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