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문제 정의
- 본 연구에서는 리포솜의 안정성 확보와 단백질 흡착방지의 목적으로 측쇄에 폴리에틸렌옥사이드를 갖는 빗 모양 고분자를 합성하고 이를 리포솜에 공유 결합시켜 폴리에틸렌옥사이드가 표면에 수식된 리포솜을 제조하여 빗 모양 고분자가 리포솜의 특성과 단백질 흡착 등에 미치는 영향을 살펴보았다. 기존에 알려진 빗 모양 고분자 골격에 사용된 메틸메타크릴 레이트(MMA)에 비해 친수성을 증가시키기 위해 말단에 히드록시기가 존재하는 히드록시에틸메타크릴 레이트(HEMA)를 사용하였으며 폴리에틸렌옥사이드 측쇄를 갖는 히드록시폴리옥시에틸렌메타크릴레이트(HPOEM) 그리고 특히 카르복실기를 도입하기 위하여 사슬이동제인 머캅토프로피오닉산(MPA)을 자유 라디칼 중합에 의해 빗 모양의 poly(HEMA-co-HPOEM)를 합성한 후, 아민기를 가진 지질을 구성 성분으로 하여 제조한 리포솜과 공유결합하였다.
제안 방법
- 리포솜의 제조. 대조군 리포솜은 HSPC, CHOL, DSPG, DSPE를 8 : 10 : 1 : 1 몰 비율로 제조하였으며 최종 지질 농도는 11.5 mg/ml가 되도록 하였다. 스텔스 리포솜은 HSPC, CHOL, DSPE-mPEG2000을 12.
- 기기. 말단에 카르복실기를 갖는 poly(HEMA-co-HPOEM)의 구조는 1H-NMR(300MHz, Bruker DRX-300 FT-NMR spectrometer)과 FT-IR(Bomen 102 FT-IR spectroscopy)을 이용하여 분석하였다. Poly(HEMA-co-HPOEM)의 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC, KF 804 column, intelligent refractive index detector (RI930), intelligent HPLC pump (PU980), Jasco)를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에서는 말단에 카르복실기를 갖는 poly(HEMA-co-HPOEM)을 합성하고 아민기를 가진 지질로 구성된 리포솜과 공유결합을 통해 친수성 고분자가 표면수식된 리포솜을 제조하였고, 제조된 리포솜의 단백질 흡착에 대한 poly(HEMA-co-HPOEM)의 영향을 평가하기 위하여 소 혈청 내에서의 입자 크기 변화와 소혈청 단백질의 흡착량을 관찰하였다. Poly(HEMA-co-HPOEM)과 리포솜의 결합은 FT-IR을 통하여 확인을 하였고, poly(HEMA-co-HPOEM)은 음전하를 갖는 리포솜의 표면전하의 절대값을 감소시켰다.
- 반응 종료 후, 반응용액을 디에틸 에테르에 가하여 합성된 빗 모양 고분자를 침전하여 정제하였고 이 과정을 3회 반복하였다. 생성된 고분자를 분자량별로 분획하기 위하여 분별 침전법을 사용하여 5회 분별하였으며 각각의 침전 생성물은 진공오븐을 사용하여 완전히 건조시킨 후 겔 투과 크로마토그래피를 사용하여 분자량을 확인하였고, 1H-NMR를 통하여 구조를 확인하였다.
- 5 mg/ml가 되도록 하였다. 스텔스 리포솜은 HSPC, CHOL, DSPE-mPEG2000을 12.6 : 8.2 : 1.1 몰 비율로 제조하였으며 최종 지질농도는 15.9 mg/ml가 되도록 하였다. 리포솜의 제조는 각각의 지질을 클로로포름과 메탄올 2 : 1(v/v)로 혼합한 용매에 용해시킨 후, 회전증발기를 사용하여 50 ℃에서 감압 증류하여 둥근 플라스크 벽에 얇은 지질막을 형성시켰다.
대상 데이터
- 리포솜 제조에 사용된 지질인 L-a-phosphatidylcholine(soy-hydrogenated)(HSPC), cholesterol (CHOL), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(DSPE) 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-[phosphorac-(1-glycerol)](DSPG)는 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 리포솜과 poly(HEMA-co-HPOEM)의 공유결합에 사용된 N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)는 Sigma Aldrich Inc.
- (Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. HEMA와 HPOEM에 함유된 중합금지제인 monomethyl ether of hydroquinone (MEHQ)을 중합금지제 제거 컬럼을 통하여 정제하여 사용하였다. 리포솜 제조에 사용된 지질인 L-a-phosphatidylcholine(soy-hydrogenated)(HSPC), cholesterol (CHOL), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(DSPE) 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-[phosphorac-(1-glycerol)](DSPG)는 Avanti Polar Lipids Inc.
- (Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 리포솜과 poly(HEMA-co-HPOEM)의 공유결합에 사용된 N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)는 Sigma Aldrich Inc.(Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모델 약물로는 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 보령제약(주)에서 구입하여 사용하였고, 그 밖에 실험에 사용한 클로로포름과 메탄올 등은 일급 및 특급시약을 그대로 사용하였다.
- 리포솜의 제조. 대조군 리포솜은 HSPC, CHOL, DSPG, DSPE를 8 : 10 : 1 : 1 몰 비율로 제조하였으며 최종 지질 농도는 11.
- (Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모델 약물로는 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 보령제약(주)에서 구입하여 사용하였고, 그 밖에 실험에 사용한 클로로포름과 메탄올 등은 일급 및 특급시약을 그대로 사용하였다.
- 시약. 빗 모양 고분자의 합성에 사용된 단량체인 2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA)와 hydroxy poly (oxyethylene) methacrylate(HPOEM), 사슬이동제인 3-mercaptopropionic acid(MPA) 및 개시제인 a,a'- azoisobutyronitrile(AIBN)은 Sigma Aldrich Inc.(Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. HEMA와 HPOEM에 함유된 중합금지제인 monomethyl ether of hydroquinone (MEHQ)을 중합금지제 제거 컬럼을 통하여 정제하여 사용하였다.
- 리포솜의 제조는 각각의 지질을 클로로포름과 메탄올 2 : 1(v/v)로 혼합한 용매에 용해시킨 후, 회전증발기를 사용하여 50 ℃에서 감압 증류하여 둥근 플라스크 벽에 얇은 지질막을 형성시켰다. 형성된 지질막을 250 mM의 암모늄설페이트 용액으로 지질막이 완전히 분산될때까지 수화하며 리포솜을 제조하였다. 리포솜 입자의 크기를 조절하기 위하여 가압압출기로 100 nm의 공극을 갖는 폴리카보네이트 분리막(Whatman, USA)을 이용하여 가압압출 하였다.
이론/모형
- 03%의 비율로 존재함을 확인하였다. 생성된 공중합체는 분별 침전법을 이용하여 분자량별로 분획하였으며 분획된 공중합체의 분자량을 겔 투과 크로마토그래피로 측정한 결과를 Table 1에 제시하였다. 리포솜의 표면 수식을 위해서 측쇄 폴리에틸렌옥사이드의 분자량이 2,000정도이고 분산도가 가장 낮은 중량 평균 분자량 4,118인 poly(HEMA-co-HPOEM)을 사용하였다.
성능/효과
- Poly(HEMA-co-HPOEM)과 리포솜의 결합은 FT-IR을 통하여 확인을 하였고, poly(HEMA-co-HPOEM)은 음전하를 갖는 리포솜의 표면전하의 절대값을 감소시켰다. Poly(HEMA-co-HPOEM)가 결합된 리포솜의 안정성과 단백질 흡착특성을 평가한 결과 소 혈청 내에서 시간에 따른 입자 크기의 변화는 없었으며, 소 혈청 단백질 흡착은 대조군 리포솜 또는 스텔스 리포솜에 비해 억제되었다. 이러한 결과는 리포솜에 결합된 poly(HEMA-co-HPOEM)의 측쇄에 존재하는 폴리에틸렌옥사이드가 리포솜의 표면에 분포되어 나타나는 효과로 생각된다.
- 본 연구에서는 말단에 카르복실기를 갖는 poly(HEMA-co-HPOEM)을 합성하고 아민기를 가진 지질로 구성된 리포솜과 공유결합을 통해 친수성 고분자가 표면수식된 리포솜을 제조하였고, 제조된 리포솜의 단백질 흡착에 대한 poly(HEMA-co-HPOEM)의 영향을 평가하기 위하여 소 혈청 내에서의 입자 크기 변화와 소혈청 단백질의 흡착량을 관찰하였다. Poly(HEMA-co-HPOEM)과 리포솜의 결합은 FT-IR을 통하여 확인을 하였고, poly(HEMA-co-HPOEM)은 음전하를 갖는 리포솜의 표면전하의 절대값을 감소시켰다. Poly(HEMA-co-HPOEM)가 결합된 리포솜의 안정성과 단백질 흡착특성을 평가한 결과 소 혈청 내에서 시간에 따른 입자 크기의 변화는 없었으며, 소 혈청 단백질 흡착은 대조군 리포솜 또는 스텔스 리포솜에 비해 억제되었다.
- 21 Poly(HEMA-co-HPOEM)이 리포솜의 독소루비신의 봉입에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 독소루비신의 봉입률을 측정한 결과 봉입률은 90% 내외로 측정되었다. poly(HEMA-co-HPOEM)가 결합된 리포솜은 독소루비신의 봉입에 영향이 없는 것으로 판단되었고 200 nm이하의 입자크기를 나타내어 약물전달체로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
- 3의 (c)는 poly(HEMA-co-HPOEM)가 결합된 리포솜의 스펙트럼으로서 에스터 및 에테르 결합의 특성피크와 1640 cm-1에서 아미드결합의 특성피크를 관찰하였다. 공중합체가 결합된 리포솜에서 에테르 결합 특성피크와 아미드 결합의 특성피크가 나타난 것으로부터 리포솜의 입자 표면에 poly(HEMA-co-HPOEM)가 결합됨을 확인하였다.
- 이러한 결과는 리포솜에 결합된 poly(HEMA-co-HPOEM)의 측쇄에 존재하는 폴리에틸렌옥사이드가 리포솜의 표면에 분포되어 나타나는 효과로 생각된다. 따라서 poly(HEMA-co-HPOEM)은 리포솜의 단백흡착을 억제하고 안정성을 향상시킬 수 있는 물질로서 유용하며 poly(HEMA-co-HPOEM)이 도입된 리포솜은 혈류 내 체류시간을 증가시킬 수 있는 약물전달체로서 제시될 수 있다.
- 4는 제조된 리포솜을 소 혈청수용액과 혼합한 후 37 ℃ 배양기에 숙성하면서 시간에 따른 입자의 크기를 측정한 결과이다. 모든 리포솜들은 초기 24시간 이내에는 입자크기의 변화가 적었고, 24시간 이후에 대조군 리포솜의 입자 크기는 증가하였으나 스텔스 리포솜 또는 poly(HEMA-co-HPOEM)가 결합된 리포솜의 경우에는 48시간까지 입자크기가 변화되지 않았다. 대조군 리포솜의 경우 24시간 이후 단백질이 흡착된 리포솜간의 응집에 의하여 커진 것으로 생각된다.
- Poly(HEMA-co-HPOEM)가 결합된 리포솜의 안정성과 단백질 흡착특성을 평가한 결과 소 혈청 내에서 시간에 따른 입자 크기의 변화는 없었으며, 소 혈청 단백질 흡착은 대조군 리포솜 또는 스텔스 리포솜에 비해 억제되었다. 이러한 결과는 리포솜에 결합된 poly(HEMA-co-HPOEM)의 측쇄에 존재하는 폴리에틸렌옥사이드가 리포솜의 표면에 분포되어 나타나는 효과로 생각된다. 따라서 poly(HEMA-co-HPOEM)은 리포솜의 단백흡착을 억제하고 안정성을 향상시킬 수 있는 물질로서 유용하며 poly(HEMA-co-HPOEM)이 도입된 리포솜은 혈류 내 체류시간을 증가시킬 수 있는 약물전달체로서 제시될 수 있다.
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