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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 분자표지인자에 의한 벼 품종 판별 방법에 대한 가능성 여부를 검토하기 위하여, 염색체상에 위치가 확인된 SSR marker를 이용하여 고품질 벼 21품종을 분석하여 얻어진 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- org/)로부터 SSR primer의 정보를 확인하여 염색체상에 고르게 위치하면서 대립유전자의 수가 많은 50개의 marker를 최종 선정하였다. SSR marker의 다형성 정도를 조사하기 위하여 아래의 공식을 이용하여 PIC(polymorphism information cont-ent) 값을 산출하였다.여기에서 Pij는 마커 i의 밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다[11].
- 10b)[7] 컴퓨터 프로그램을 이용하여 Dice 방법[12]의해 산출하였고, 이 값을 근거로 비가중산술방식(UPGMA:unweighted pair group method us-ing arithmetic averages)의해 집괴분석하여 dendro-gram을 작성한 다음 품종간 유연관계를 비교 분석하였다. 그리고 벼 21 품종의 식별 및 순도 검정에 필요한 최소 set의 SSR marker를 선정하기 위하여다 형성을 보인 marker중에서 대립유전자 패턴이 선명하고 PIC 값이 높은 것을 선발하여 공시품종에 대해 고유한 밴드 특성을 나타내는지를 비교 · 분석하였다.
- 벼의 품종간 유연관계 분석 및 품종식별에 적합한 SSR marker를 선발하기 위하여, 2005년에 종자관리소에서 보급된 21품종의 genomic DNA와 SSR marker를 이용하여 다형성 정도를 조사한 바(Table 2), 총 50개의 SSR pr-imer 중에서 공시 품종간에 다형성을 나타내는 SSR mar-ker는 23개로 조사되었다. 이들 marker에 의해 검출된 대립유전자의 수는 2~9개였고, 총 68개의 대립유전자가 분석되었으며, marker당 평균 대립유전자의 수는 3.
- 본 연구에서 SSR 분석에 이용된 PCR의 반응액 조성은 벼genomic DNA 25ng을 template DNA로 이용하여, 2.5 mL10xbuffer(500 mM KC1; 100 mM Tris-HCl, pH 8.3; 15 mM MgCl2), 2.0 mL의 dNTP mixture(2.5 mM), 50 pmol의 SSR primer, 1 units의 Taq DNA polymerase를 첨가하여 실시하였다. PCR은 UNO Ⅱ Thermocycler (Biometra, Germany)에서 35 cycle을 실시하며, den-aturation은 94℃에서 1분, annealing은 55~60℃에서 1분, 그리고 extension을 72℃에서 1분간 수행하였다.
- 본 연구에서는 2005년에 고품질벼로 선정되어 농가에 보급되고 있는 '주남벼'외 20품종을 공시하여(Table 1), 공시품 종의 종자 2립을 마쇄한 다음 Nucleospion® Pl-ant Kit(Cat no. 740.270.540.)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 추출된 DNA는 spectrophotometer를 이용하여 260nm에서 비색 정량하고 최종 농도가 5 ng/μL가 되도록 희석한 다음 SSR 분석에 이용하였다.
- PCR은 UNO Ⅱ Thermocycler (Biometra, Germany)에서 35 cycle을 실시하며, den-aturation은 94℃에서 1분, annealing은 55~60℃에서 1분, 그리고 extension을 72℃에서 1분간 수행하였다. 증폭된 DNA 산물은 6% polyacrylamide sequencing gel에 2시간 전기 영동한 다음 Silver sequence™ sta-ining reagents(Promega, USA)로 염색하여 band를 확인하고 다형성 밴드의 유무에 따라 1과 0으로 수치화 하여 기록하였다. 공시된 벼 품종에 대한 유전적 유사도는 NTSYSpc(version 2.
- )를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 추출된 DNA는 spectrophotometer를 이용하여 260nm에서 비색 정량하고 최종 농도가 5 ng/μL가 되도록 희석한 다음 SSR 분석에 이용하였다.
대상 데이터
- SSR marker^] 의한 벼 보급종의 유전적 유연관계 및 순도검정에 적합한 primer를 선발하기 위하여, 국제 벼 유전체D/B(http://www.gramene.org/)로부터 SSR primer의 정보를 확인하여 염색체상에 고르게 위치하면서 대립유전자의 수가 많은 50개의 marker를 최종 선정하였다. SSR marker의 다형성 정도를 조사하기 위하여 아래의 공식을 이용하여 PIC(polymorphism information cont-ent) 값을 산출하였다.
데이터처리
- 증폭된 DNA 산물은 6% polyacrylamide sequencing gel에 2시간 전기 영동한 다음 Silver sequence™ sta-ining reagents(Promega, USA)로 염색하여 band를 확인하고 다형성 밴드의 유무에 따라 1과 0으로 수치화 하여 기록하였다. 공시된 벼 품종에 대한 유전적 유사도는 NTSYSpc(version 2.10b)[7] 컴퓨터 프로그램을 이용하여 Dice 방법[12]의해 산출하였고, 이 값을 근거로 비가중산술방식(UPGMA:unweighted pair group method us-ing arithmetic averages)의해 집괴분석하여 dendro-gram을 작성한 다음 품종간 유연관계를 비교 분석하였다. 그리고 벼 21 품종의 식별 및 순도 검정에 필요한 최소 set의 SSR marker를 선정하기 위하여다 형성을 보인 marker중에서 대립유전자 패턴이 선명하고 PIC 값이 높은 것을 선발하여 공시품종에 대해 고유한 밴드 특성을 나타내는지를 비교 · 분석하였다.
성능/효과
- SSR marker를 이용하여 벼 21품종에 대한 유전적 유연관계를 조사한 바(Fig. 1), 공시품종의 전체 유사도 지수는 0.59~0.92의 범위로 나타났으며, 유사도 지수 0.65를 기준으로 할 때 21개 품종은 4개의 그룹으로 구분할 수 있었다.
- 839까지 다양하게 분석되었다. SSR marker를 이용하여 분석된 벼 21품종에 대한 전체 유전적 유사도는 0.59-0.92의 범위에 속하였고 유사도 지수 0.65를 기준으로 할 때 4개의 그룹으로 구분되었다. SSR marker중에서 RM206, RM225, RM418, RM478은 marker genotype에 의해 21 품종에 대해 각각 고유한 밴드 특성을 나타내어 품종판별이 가능한 것으로 나타났다.
- 65를 기준으로 할 때 4개의 그룹으로 구분되었다. SSR marker중에서 RM206, RM225, RM418, RM478은 marker genotype에 의해 21 품종에 대해 각각 고유한 밴드 특성을 나타내어 품종판별이 가능한 것으로 나타났다. 금후 이 연구결과는 벼 보급종의 품종식별을 위해 효과적으로 이용될 수 있는 것으로 나타났다.
- SSR primer 50개와 벼 보급종 21품종을 PCR 반응시킨 결과 다형성을 뚜렷하게 나타내는 primer는 23개였으며, 각 marker에 의해 발생된 대립유전자의 수는 2~9까지 검출되었고, 평균값은 3.00개로 나타났다. 유전적 다형성 정도를 나타내어 주는 SSR marker의 PIC 값은 최소 0.
- 00개로 나타났다. 그리고 각 marker의 유전적 다형성 정도를 나타내어 주는 PIC 값은 0.091~0.839까지 나타났으며, 평균값은 0.460으로 조사되었다. 한편 보급종 21품종은 RM206외 21개 marker에서 한 개씩의 대립유전자를 나타내어 동형접합체임을 알 수 있었으나, RM418의 경우 '오대벼,와 '동진찰벼'에서 2개의 대립유전자가 검출되었다.
- 그리고 제 Ⅱ그룹은 'Chukei 803'이 교배모본으로 활용된 '화영벼'와 '새계화벼', '화영벼'가 교배모본으로 이용된 '동진 1호', '주남벼', '신동진벼'와 나머지 4품종이 속하였으며, 특히, '추청벼'와 제반형질이 유사하며 도열병 저항성을 가진 '새추청벼'의 유전적 유사도가 가장 높게 나타났다. 그리고 Aichi 37/삼남벼' 조합의 약배양 기법에 의해 육성된 '화성벼'와 '수원345호/KantoPL4' 조합에 '수원345호'가 여교배되어 육성된 '수라벼'는 어느 품종군에도 속하지 않고 다른 품종들과 유전적 거리가 먼 것으로 분석되었다.
- 그리고 Aichi 37/삼남벼' 조합의 약배양 기법에 의해 육성된 '화성벼'와 '수원345호/KantoPL4' 조합에 '수원345호'가 여교배되어 육성된 '수라벼'는 어느 품종군에도 속하지 않고 다른 품종들과 유전적 거리가 먼 것으로 분석되었다. 따라서 본 연구에서 SSR marker의 genotype에 의해 작성된 dendrogram을 분석해 볼 때 벼 품종의 생태형이 비슷하거나 품종육성에 이용된 교배모본의 계보가 유사한 품종이 동일한 그룹 내에 위치하는 것으로 분석되었다.
- 그리고 Aichi 37/삼남벼' 조합의 약배양 기법에 의해 육성된 '화성벼'와 '수원345호/KantoPL4' 조합에 '수원345호'가 여교배되어 육성된 '수라벼'는 어느 품종군에도 속하지 않고 다른 품종들과 유전적 거리가 먼 것으로 분석되었다. 따라서 본 연구에서 SSR marker의 genotype에 의해 작성된 dendrogram을 분석해 볼 때 벼 품종의 생태형이 비슷하거나 품종육성에 이용된 교배모본의 계보가 유사한 품종이 동일한 그룹 내에 위치하는 것으로 분석되었다.
- 86의 높은 범위에 속하였다. 또한 이들 4개의 marker genotype에 의해 21품종은 각각의 고유한 밴드 특성을 나타내어 이 4개의 marker 만으로 벼 21품종의 식별이 가능할 것으로 나타났다.
- 벼 21품종에 대한 품종판별을 위한 최소 SSR marker를 설정하기 위하여, 품종간 유전적 유연관계 분석에서 다형성을 보인 23개의 marker 중에서 밴드가 선명하고 PIC 값이 높은 marker를 선정하여 각 품종간 대립유전자의 특성을 비교한바(Fig. 2), RM206, RM225, RM418, RM478은 대립유전자의 패턴이 선명할 뿐만 아니라 PIC 값도 0.47-0.86의 높은 범위에 속하였다. 또한 이들 4개의 marker genotype에 의해 21품종은 각각의 고유한 밴드 특성을 나타내어 이 4개의 marker 만으로 벼 21품종의 식별이 가능할 것으로 나타났다.
- 00개로 나타났다. 유전적 다형성 정도를 나타내어 주는 SSR marker의 PIC 값은 최소 0.091 에서부터 최대 0.839까지 다양하게 분석되었다. SSR marker를 이용하여 분석된 벼 21품종에 대한 전체 유전적 유사도는 0.
- 이들 marker에 의해 검출된 대립유전자의 수는 2~9개였고, 총 68개의 대립유전자가 분석되었으며, marker당 평균 대립유전자의 수는 3.00개로 나타났다. 그리고 각 marker의 유전적 다형성 정도를 나타내어 주는 PIC 값은 0.
- 460으로 조사되었다. 한편 보급종 21품종은 RM206외 21개 marker에서 한 개씩의 대립유전자를 나타내어 동형접합체임을 알 수 있었으나, RM418의 경우 '오대벼,와 '동진찰벼'에서 2개의 대립유전자가 검출되었다.
후속연구
- 그러나 인도에서 개발된 품종식별방법은 분석에 이용된 marker의 수가 너무 많아 효율적이지 못한 것으로 사료되었고, 일본에서 개발된 분자표지 인자의경우 marker가 dominant 형태를 나타내기 때문에 heterozygous한 상태를 알 수 없는 문제점이 있다. 그러나 본 연구에서 분석 대상 품종의 수가 21품종에 불과하지만, 최근에 보급되고 있는 벼 육종 목표가 고품질미 육성에 주력하고 있기 때문에 이들 품종군의 유전적 거리가 아주 좁은 것으로 추정되고 있어 이들 품종을 판별할 수 있는 SSR marker라면 다른 품종의 식별에도 충분히 활용될 수 있을 것이라고 사료된다. 앞으로 본 연구에서 선발된 4개의 marker를 이용하여 최근에 육성되고 있는 고품질 벼를 대상으로 보다 구체적인 분석이 이루어진다면 벼 보급종의 순도를 높일 수 있을 뿐만 아니라 수입쌀을 국내산으로 둔갑시켜 유통시키는 유통 질서의 교란에도 적극적으로 대처할 수 있을 것이며, 나아가 종자분쟁 발생시 하나의 보조적 해결 수단으로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- SSR marker중에서 RM206, RM225, RM418, RM478은 marker genotype에 의해 21 품종에 대해 각각 고유한 밴드 특성을 나타내어 품종판별이 가능한 것으로 나타났다. 금후 이 연구결과는 벼 보급종의 품종식별을 위해 효과적으로 이용될 수 있는 것으로 나타났다.
- 그러나 본 연구에서 분석 대상 품종의 수가 21품종에 불과하지만, 최근에 보급되고 있는 벼 육종 목표가 고품질미 육성에 주력하고 있기 때문에 이들 품종군의 유전적 거리가 아주 좁은 것으로 추정되고 있어 이들 품종을 판별할 수 있는 SSR marker라면 다른 품종의 식별에도 충분히 활용될 수 있을 것이라고 사료된다. 앞으로 본 연구에서 선발된 4개의 marker를 이용하여 최근에 육성되고 있는 고품질 벼를 대상으로 보다 구체적인 분석이 이루어진다면 벼 보급종의 순도를 높일 수 있을 뿐만 아니라 수입쌀을 국내산으로 둔갑시켜 유통시키는 유통 질서의 교란에도 적극적으로 대처할 수 있을 것이며, 나아가 종자분쟁 발생시 하나의 보조적 해결 수단으로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 그러나 최근 보급되고 있는 우리나라의 고품질벼 품종을 대상으로 하여 분자표지인자를 활용하여 품종간 유전적 유연관계 분석이나 품종식별에 활용한 예는 거의 없는 실정이다. 한편, 분자표지인자에 의해 최근 육성된 벼 품종 식별 방법이 구체적으로 구명된다면 보급종의 순도를 높일 수 있을 뿐만 아니라 분쟁 발생시 이를 조정하는 보조자료로 활용될 수 있을 것이다.
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