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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 SSR 마커를 이용한 국내외 감귤류 유전자원 및 품종 108개에 대한 DNA 데이터베이스를 구축하기 위하여 SSR 마커의 선발과 유전자원 및 품종간 유전적 근연도 분석 등과 같은 일련의 연구를 수행하여 얻어진 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- PCR 반응은 게놈 DNA 30ng, 0.1μM의 SSRprimer, 2.0μL dNTP mixture(2.5mM), Taq polymerase 1.0U, 2.5μL의 10×PCR buffer(50mM KCl, 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0mM MgCl2)에 초순수를 첨가하여 전체 부피를 30μL로 조절하였다.
- PCR 증폭 산물 1.0μL와 탈이온된 포름아마이드(deionized formamide) 10μL, size marker(LIZ500 size standard) 0.25μL를 혼합하고 94℃에서 2분간 변성시킨 다음 자동염기서열분석기(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystems, Foster, USA)를 활용하여 전기 영동 하였다.
- , 2007)를 활용하여 다형성 정도를 조사하였다. PCR(Cat. C1000, Biorad, USA)을 통한 유전자 증폭 산물은 QIAxcel Advanced System(Cat. 9001941, QIAGEN, Deutsch)을 이용하여 전기영동하고 컴퓨터 프로그램 (QIAxcel ScreenGel)을 활용하여 각 품종별 대립 유전자의 차이를 분석하였다. 반복 재현성이 높고 밴드의 패턴이 깨끗한 분자표지를 선정하여 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET의 화학 물질 중 한가지로 형광 표지한 다음 감귤류 108품종(Table 1)에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축에 이용하였다.
- SSR 마커의 다형성 정도를 조사하기 위하여 대립 유전자의 수, 대립 유전자의 출현빈도, 기대된 이형접합성, 관찰된 이형접합성 및 polymorphism information content(PIC) 값은 PowerMarker(version 3.25)(Liu and Muse, 2005)를 이용하여 산출하였다. NTSYSpc(version 2.
- 감귤류 식물의 품종식별에 효과적인 분자 마커를 선발하기 위하여, 만다린에 속하는 ‘Sangdojosaeng’, ‘Hiroshimakaken 7gou’, ‘Sunburst’, ‘Dancy’, 오렌지인 ‘Rohde Red Valencia’, 탄골인 ‘Dweet’, 탄젤로인 ‘Page’, 문단류에 속하는 ‘Yuma Ponderosa’ 를 대상으로 기 보고된 203개 SSR 프라이머(Ahmed et al., 2003; Kijas et al., 1997; Ollitrault et al., 2010; Palmieri et al., 2007)를 활용하여 다형성 정도를 조사하였다.
- 공시 품종의 어린잎과 텅스텐 구슬 2개를 2mL 튜브에 넣고 분쇄기(Pulverisette6, Fritsch)를 이용하여 시료를 고르게 마쇄한 다음 NucleoSpin®PlantII(Cat. 740 770.250, Macherey-Nagel GmbH & Co., KG, Deutsch) 키트를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다.
- 추출된 DNA는 1.5% 아가로스젤에서 전기 영동하여 DNA 농도를 확인한 후 μL당 10ng의 농도로 정량하여 polymerase chain reaction(PCR) 분석에 이용하였다.
대상 데이터
- (1997)와 Ahmad et al.(2003)이 개발한 SSR 마커에 대한 다형성 정도를 재검정하고 프랑스 및 브라질에서 개발된 마커를 추가적으로 이용하여 활용하여 반복 재현성이 높은 18개를 최종 선발하였다. 이러한 연구 결과는 국외의 연구자들이 감귤속 식물의 품종식별 및 유전자원의 특성평가에 활용하지 않았던 새로운 마커 세트로서 자동염기서열 분석기로 분석시 대립유전자의 유전자형이 복잡하지 않고 반복 재현성이 높기 때문에 향후 품종의 진위 확인과 관련된 다양한 분야에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 9001941, QIAGEN, Deutsch)을 이용하여 전기영동하고 컴퓨터 프로그램 (QIAxcel ScreenGel)을 활용하여 각 품종별 대립 유전자의 차이를 분석하였다. 반복 재현성이 높고 밴드의 패턴이 깨끗한 분자표지를 선정하여 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET의 화학 물질 중 한가지로 형광 표지한 다음 감귤류 108품종(Table 1)에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축에 이용하였다. PCR 반응은 게놈 DNA 30ng, 0.
- 본 연구에서는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 감귤연구소에서 수집 보존하고 있는 감귤속 유전자원 및 품종 85개, 재주재래종 10점(‘Gamja’, ‘Dangyooja’, ‘Dongjungkyool’, ‘Bungkyool’, ‘Binkyool’, ‘Sadoogam’, ‘Jinkyool’, ‘Cheongkyool’, ‘Punkyool’, ‘Hongkyool’) 국내에서 육성된 13 품종(‘Sangdojosaeng’, ‘Samdajosaeng’, Tamnajosaeng’, ‘Haraejosaeng’, ‘Tamdo 1ho’, ‘Seolbongmi’, ‘Sinyegam’, ‘Wonkyoah Danbaiseong 1ho’, ‘Wonkyoah Danbaiseong 2ho’, ‘Wonkyoah Danbaiseong 3ho’, ‘Tamdo 3ho’, ‘Tambit 1ho’, ‘Suneat’)을 공시하여 SSR 마커의 분석 재료로 활용하였다(Table 1).
데이터처리
- 25)(Liu and Muse, 2005)를 이용하여 산출하였다. NTSYSpc(version 2.10b)(Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램을 이용하여 Jaccard 방법에 준하여 유전적 유사도 값을 계산한 다음 unweighted pair-group method with arithmetical average (UPGMA)(Sneath and Sokal, 1973) 방법으로 집괴 분석하고 계통도를 작성한 다음 수집종별 유전적 다양성 및 유연 관계를 비교 분석하였다.
- 25μL를 혼합하고 94℃에서 2분간 변성시킨 다음 자동염기서열분석기(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystems, Foster, USA)를 활용하여 전기 영동 하였다. SSR 마커에 의해 증폭된 대립 유전자의 크기는 GeneMapper(version 3.7) 컴퓨터 프로그램(Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 203개의 감귤속 식물에서 유래된 SSR 마커중에서 반복재현성 및 다형성 정도가 높은 18개를 이용하여 감귤속 식물 108품종 및 유전자원에 대한 유전적 유사도 정도를 분석한 결과(Fig. 3), 공시품종 및 유전자원의 전체 유사도 지수는 0.10-1.00의 넓은 범위에 속하였고, 유전적 유사도 지수 0.34를 기준으로 할 때 SSR 마커의 유전자형에 의해 13개의 대그룹으로 크게 구분할 수 있었다. I그룹은 만다린인 ‘Robinson’ 등 40품종이 분포하였으며, 유전적 유사도 지수 0.
- I-1 소그룹에는 오렌지에 속하는 ‘Succari’ 등 14품종, 만다린인 ‘Clementine’과 ‘Orlando’가 교배되어 육성된 ‘Robinson’ 등 9품종, 탄골인 ‘Dweet’, 탄젤로인 ‘Orlando’ 등 4품종, 탄골과 탄젤로가 교배된 ‘Sampson’, 탄골인 ‘Prince Kiyomi’와 재주재래종인 ‘Byungkyool’을 교배하여 우리나라에서 육성한 ‘Tambit 1ho’가 속하였다.
- II 그룹은 우리나라에서 육성된 ‘Sangdojosaeng’ 등 51품종이 그룹화되었으며 유전적 유사도 0.38을 기준으로 할 때 3개의 소그룹으로 나눌 수 있었다.
- V와 VI그룹은 만다린인 ‘Cleopatra’와 ‘Changsha’가 속하였으며, VII과VIII 그룹에는 제주도에서 자생하고 있는 ‘Binkyool’, ‘Cheongkyool’, ‘Hongkyool’이 분포하였고, Ⅸ 그룹은 문단류인 ‘Banpeiyu’, X 그룹은 레몬류에 속하는 ‘Lisbon’과 ‘Allen-Newman Eureka’가 속하였으며 이 두 품종간에는 100%의 유전적 유사도를 나타내었다.
- 감귤류 식물의 품종 식별에 효과적인 SSR 마커를 선발하기 위하여, 만다린인 ‘Sangdojosaeng’, ‘Hiroshimakaken 7gou’, ‘Sunburst’, ‘Dancy’, 오렌지인 ‘Rohde Red Valencia’, 탄골인 ‘Dweet’, 탄젤로인 ‘Page’, 문단에 속하는 ‘Yuma Ponderosa’ 품종과 203개의 SSR 프라이머를 활용하여 다형성 정도를 조사한 바(Fig. 1), 총 203개 primer중에서 78개는 PCR 반응을 보이지 않거나 다형성을 보이지 않았으며, 85개는 특정 유형의 감귤속 품종에만 다형성을 보이는 양상을 보였고, 다형성이 나타나더라도 대립유전자의 양상이 복잡하였다.
- 감귤류 품종 식별용 분자표지 선발과정에서 다형성 정도 및 반복 재현성을 고려하여 최종 선정된 18개의 SSR 프라이머와 감귤류 식물 108품종에 대한 다형성 정도를 조사한 바(Table 2), SSR 프라이머에 따라 검출된 대립유전자의 수는 5-14개로 다양하게 나타났으며 총 167개의 대립유전자가 검출되었고, 마커당 평균 대립유전자의 수는 9.28개로 분석되었다. 본 연구에서 활용된 SSR 마커의 유전적 다양성 정도를 나타내는 관찰된 이형접합성과 기대된 이형접합성의 평균 값은 각각 0.
- 국내에서 육성된 감귤속 식물13품종과 제주재래종 10점을 해외 유전자원과 비교 분석하였을 때, ‘Tambit 1ho’는 해외 수집종인 ‘Sexton tangelo’와 59%의 유전적 유사도를 나타내었으며, ‘Sangdojosaeng’, ‘Samdajosaeng’, ‘Tamnajosaeng’, ‘Haraejosaeng’은 일본에서 육성된 18개의 감귤 품종들과 ‘Suneat’와 ‘Shiranui’는 100%의 유전적 유사도를 나타내었다.
- 그리고 ‘Tamdo 1ho’, ‘Bungkyool’, ‘Wonkyoah Danbaiseong 1ho’, ‘Wonkyoah Danbaiseong 2ho’, ‘Gamja’, ‘Punkyool’, ‘Dongjungkyool’, ‘Jinkyool’은 II-3 그룹, ‘Binkyool’은 VII 그룹, ‘Cheongkyool’과 ‘Hongkyool’은 VIII 그룹 내에 분포하였으며 외국 수집종과는 유전적 유사도가 아주 낮게 나타났다.
- 그리고 품종 육성 계보도상 양친의 특성을 알 수 없는 ‘Batangas’와 ‘Taiwan Ponkan’의 아조 돌연변이에서 유래된 ‘Yoshida Pokan’은 100%의 유전적 유사도를 나타내었다.
- 따라서 40개의 SSR 정방향 프라이머의 5’-말단에 형광물질인 FAM, VIC, NED, PET를 각각 표지하여 감귤류 108품종의 genomic DNA와 PCR하고 증폭산물을 자동염기서열분석기를 이용하여 전기 영동 한 바(Fig. 2.), 40개중 18개는 반복 재현성이 높을 뿐만 아니라 GeneMapper 컴퓨터 프로그램에서 검출된 피크가 깨끗하여 품종별 genotyping에 용이하였다.
- 89까지 다양하다고 발표하였다. 본 연구에서 감귤속 식물의 유전자원 및 품종들을 분석하였을 때 평균 대립유전자의 수의 경우 9.28개로 다른 연구결과와 유사한 경향을 나타내었으나 평균 PIC 값의 경우 0.624로 다소 낮게 나타났는데 이러한 연구결과는 마커의 다형성이 낮은 것보다는 분석되는 감귤속 식물의 유전적 다양성의 차이에서 비롯된 결과라고 추정된다.
- 28개로 분석되었다. 본 연구에서 활용된 SSR 마커의 유전적 다양성 정도를 나타내는 관찰된 이형접합성과 기대된 이형접합성의 평균 값은 각각 0.621과 0.654로 높게 나타났다. 한편 각 마커 별 공시 품종의 유전적 다형성 정도를 나타내는 지수인 PIC 값은 0.
- 606으로 높은 경향을 보였다. 총 18개의 SSR 마커 가운데 10개가 0.60 이상의 높은 PIC 값을 나타내어 본 연구에서 선발된 SSR 마커는 여러 가지 감귤류의 품종 식별 및 유전자원의 다양성 평가에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 나타났다.
- 특히, 우리나라에서 육성한 감귤 품종인 ‘Sangdojosaeng’, ‘Samdajosaeng’, ‘Tamnajosaeng’, ‘Haraejosaeng’ 4품종과 일본에서 육성한 ‘Yura Wase’ 등 18품종, ‘Shiranui’와 ‘Suneat’, ‘Nishinokaori’, ‘Prince Kiyomi’ 및 ‘Ariake’가 SSR 마커의 유전자형에 의해 식별이 되지 않았다.
- 654로 높게 나타났다. 한편 각 마커 별 공시 품종의 유전적 다형성 정도를 나타내는 지수인 PIC 값은 0.417-0.782까지 다양한 범위에서 분포하였으며, 평균값도 0.606으로 높은 경향을 보였다. 총 18개의 SSR 마커 가운데 10개가 0.
- 한편, I-1에 속하는 31품종중 14개의 오렌지 품종이 속하였는데 이들 품종중에서 ‘Sanguinelli’와 ‘Ambersweet’를 제외한 12품종은 100%의 유전적 유사도를 나타내었다.
- 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 SSR이나 SNP 마커를 추가적으로 개발하여 정밀 분석이 이루어져야 될 뿐만 아니라 형태적 특성과 마커의 연관성 여부를 비교 분석하여 품종 특이적인 새로운 마커 개발이 필요할 것으로 사료된다. 한편, 본 연구에서 선정된 SSR 마커 세트를 이용하여 감귤속 식물의 품종 및 유전자원을 분석한 결과, 오렌지와 온주 밀감은 품종 식별력이 다소 낮지만 품종 육성 계보도와 품종 개발 방법에 따라 일치하는 양상을 나타내었다. 이러한 연구결과는 향후 감귤류 식물의 신품종 육성 시 유전거리의 사전 예측이 가능하여 육종효율을 향상시킬 뿐만 아니라 우리나라에서 자생하는 감귤 유전자원의 보호 및 품종보호제도 강화 등과 같은 분야에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
후속연구
- 그리고 ‘Tamdo 1ho’, ‘Bungkyool’, ‘Wonkyoah Danbaiseong 1ho’, ‘Wonkyoah Danbaiseong 2ho’, ‘Gamja’, ‘Punkyool’, ‘Dongjungkyool’, ‘Jinkyool’은 II-3 그룹, ‘Binkyool’은 VII 그룹, ‘Cheongkyool’과 ‘Hongkyool’은 VIII 그룹 내에 분포하였으며 외국 수집종과는 유전적 유사도가 아주 낮게 나타났다. 따라서 이들 품종 및 유전자원은 감귤속 식물의 품종 개발에 매우 유용한 육종 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다. 한편, 본 연구에 공시된 감귤속에 속하는 108개 품종 및 유전자원에 대하여 18개의 SSR 마커를 이용하여 분석하였을 때, 감귤속 식물의 분류학적 특성 및 품종 육성 계보도에 따라 뚜렷하게 그룹화되는 경향을 보여, 본 연구에서 선정된 분자 마커들은 품종간 유연관계 설정을 통한 유전자원 특성 평가에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
- (2006)은 여러 가지 형태를 가진 41개 품종의 스위트 오렌지를 대상으로 50개의 SSR마커로 분석하였을 때 8품종만이 식별이 가능할 정도로 유전적 유사도가 높게 나타남을 보고하였고, Al-Mouei and Choumane(2014)도 레몬, 오렌지, 만다린, 자몽 등을 대상으로 SSR 마커로 분석하였을 때 스위트 오렌지 15품종 중 12품종이 식별이 되지 않음을 지적한 바 있다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 SSR이나 SNP 마커를 추가적으로 개발하여 정밀 분석이 이루어져야 될 뿐만 아니라 형태적 특성과 마커의 연관성 여부를 비교 분석하여 품종 특이적인 새로운 마커 개발이 필요할 것으로 사료된다. 한편, 본 연구에서 선정된 SSR 마커 세트를 이용하여 감귤속 식물의 품종 및 유전자원을 분석한 결과, 오렌지와 온주 밀감은 품종 식별력이 다소 낮지만 품종 육성 계보도와 품종 개발 방법에 따라 일치하는 양상을 나타내었다.
- , 2009). 따라서 지금까지 여러 연구자(Ahmed et al., 2003; Kijas et al., 1997; Ollitrault et al., 2010; Palmieri et al., 2007)에 의해 개발된 SSR 마커를 활용하여 다형성 정도와 반복 재현성이 높은 마커의 새로운 선발은 감귤속 식물의 유전적 근연 관계 분석과 품종식별력의 정밀도 향상에 크게 기여할 것이다. 한편, 우리나라의 경우 감귤에 대한 유전자 분석은 RAPD 기법을 활용하여 일본 유전자원 9점의 분류에 관한 단편적인 연구결과가 보고된 바 있으나(Kim et al.
- (2003)이 개발한 SSR 마커에 대한 다형성 정도를 재검정하고 프랑스 및 브라질에서 개발된 마커를 추가적으로 이용하여 활용하여 반복 재현성이 높은 18개를 최종 선발하였다. 이러한 연구 결과는 국외의 연구자들이 감귤속 식물의 품종식별 및 유전자원의 특성평가에 활용하지 않았던 새로운 마커 세트로서 자동염기서열 분석기로 분석시 대립유전자의 유전자형이 복잡하지 않고 반복 재현성이 높기 때문에 향후 품종의 진위 확인과 관련된 다양한 분야에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 한편, 본 연구에서 선정된 SSR 마커 세트를 이용하여 감귤속 식물의 품종 및 유전자원을 분석한 결과, 오렌지와 온주 밀감은 품종 식별력이 다소 낮지만 품종 육성 계보도와 품종 개발 방법에 따라 일치하는 양상을 나타내었다. 이러한 연구결과는 향후 감귤류 식물의 신품종 육성 시 유전거리의 사전 예측이 가능하여 육종효율을 향상시킬 뿐만 아니라 우리나라에서 자생하는 감귤 유전자원의 보호 및 품종보호제도 강화 등과 같은 분야에 활용도가 높을 것으로 판단된다.
- 따라서 이들 품종 및 유전자원은 감귤속 식물의 품종 개발에 매우 유용한 육종 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다. 한편, 본 연구에 공시된 감귤속에 속하는 108개 품종 및 유전자원에 대하여 18개의 SSR 마커를 이용하여 분석하였을 때, 감귤속 식물의 분류학적 특성 및 품종 육성 계보도에 따라 뚜렷하게 그룹화되는 경향을 보여, 본 연구에서 선정된 분자 마커들은 품종간 유연관계 설정을 통한 유전자원 특성 평가에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 오렌지에 속하는 12품종과 밀감에 속하는 21품종은 SSR 마커의 유전자형에 따라 구분이 되지 않았는데 이는 감귤속 식물의 품종 개발은 제한된 유전자원을 교배모본으로 활용하여 유발된 아조변이나 주심배 실생에 의한 방법으로 품종을 육성하기 때문에 품종들간 유전적 거리가 매우 가깝기 때문에 나타난 결과라고 사료된다.
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