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문제 정의
- 본 연구는 보건복지부 보건의료기술개발사업(과제번호02-PJ1-PG1-CH08-0002)의 지원으로 이루어졌으며 이에 저자들은 사의를 표하고자 합니다.
- 따라서 새로운 probiotics를 개발하기 위해서는 유익한 효과와 아울러 인체내로의 침투성, 병원성과 항생제 내성 특성 등이 고려 되어야 할 것으로 보인다. 본 연구는 현재 산업적으로 활용되 고 있는 Bifidobacterium의 항생제 내성특성을 분석함과 아울러 장내 유익한 세균인 Bifidobacterium을 한국인 장내에서 분리하여 항생제 감수성 테스트를 수행하여 그 내성 형태를 분석하여 새로운 probiotics개발을 위한 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 이렇게 분리된 단일집 락을 다시 선택배지에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후 순수 단 일집락을 취하여 현미경 하에서 의 형태학적인 특 징, Gram염색, F-6-PPK test를 통하여 Bifidobacterium spp로 동 정하였다. 선택배지로는 BS배지와 TP배지를 이용하였고(13), 혐 기배양은 혐기배양조(BBL, Franklin Lakes, USA)와 혐기 배양 장 치 (Lab Line Instrument Inc., Iowa, USA)를 사용하였다. 분리된 균주는 항생제 테스트를 위하여 Lactobacilli MRS broth(Criterion, CA, USA)에 접종하여 혐기적인 조건에서 37℃, 24시간 동안 배양하여 사용하였다
- 유산균 음료에서의 분리는 이 음료를 선택 배지에 도말한 후 혐기상태에서 37℃, 24-48시간 배양하여 단일 집락의 특성으로 일차적으로 분리하였다. 이렇게 분리된 단일집 락을 다시 선택배지에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후 순수 단 일집락을 취하여 현미경 하에서 의 형태학적인 특 징, Gram염색, F-6-PPK test를 통하여 Bifidobacterium spp로 동 정하였다. 선택배지로는 BS배지와 TP배지를 이용하였고(13), 혐 기배양은 혐기배양조(BBL, Franklin Lakes, USA)와 혐기 배양 장 치 (Lab Line Instrument Inc.
- 징내 상주균이며 probiotics로 활용되고 있는 Bifidobacterium6^ 대한 항생제 내성분포를 분석하였다. 분석된 93개의 Bifidobacterium 이 chloramphenicol, rifampicin, erythromycin에 대해서는 감수성을 갖고 있었고, aminoglycoside계 항생제, nalidixic acid와 vancomy cin0)) 내성을 갖는 것으로 나타났다.
- 05% L-cysteine이 함 유된 MRS 한천배지에 항생제를 단계별로 희석하여 첨가한 배지 에 접종기구를 이용하여 접종한 후 혐기적인 조건하에 37℃에서 48시간 배양하였다. 최소 생육저해 농도(minimum inhibition concentration, MIC)는 각각의 항생제가 첨가된 배지에서 균주가 증식하지 않는 최소 농도로 결정하였다.
- Louise, USA)이며, 이들 항 생제는 규정돤 용매에 녹인 후 -20℃에서 보관하였다. 항생제 테스트를 위한 배지는 0.05% L-cysteine이 첨가된 Lactobacilli MRS agar plate(Criterion, CA, USA)에 -20℃에서 냉동 보관된 항생제 를 각 농도별로 조절하여 첨가하였다.
- 항생제 테스트는 한천 희석방법을 이용하여 수행하였다(14). 혐기적으로 배양한 103균주의 분리 균주를 0.05% L-cysteine이 함 유된 MRS 한천배지에 항생제를 단계별로 희석하여 첨가한 배지 에 접종기구를 이용하여 접종한 후 혐기적인 조건하에 37℃에서 48시간 배양하였다. 최소 생육저해 농도(minimum inhibition concentration, MIC)는 각각의 항생제가 첨가된 배지에서 균주가 증식하지 않는 최소 농도로 결정하였다.
대상 데이터
- 사용된 Bifidobacterium spp는 한국인의 성인, 유아의 분변으로 부터 분리되어 당 연구실에 보관 중인 93개의 Bifidobacterium collection과 시중에 유통중인 유산균 음료 13종으로부터 분리한 10균주를 사용하였다. 유산균 음료에서의 분리는 이 음료를 선택 배지에 도말한 후 혐기상태에서 37℃, 24-48시간 배양하여 단일 집락의 특성으로 일차적으로 분리하였다.
- 사용한 항생제는 종 14종으로 penicillin G, ampicillin, amoxicillin, cephalothin, neomycin, kanamycin, streptomycin, paromomycin, nalidixic acid, vancomycin, erythromycin, tetracycline, rifampicin, chloramphenicol(Sigma, St. Louise, USA)이며, 이들 항 생제는 규정돤 용매에 녹인 후 -20℃에서 보관하였다. 항생제 테스트를 위한 배지는 0.
이론/모형
- 항생제 테스트는 한천 희석방법을 이용하여 수행하였다(14). 혐기적으로 배양한 103균주의 분리 균주를 0.
성능/효과
- Aminoglycoside계 항생제 내성특성: Aminoglycoside계 항생제인 kanamycin, neomycin, streptomycin, paromomycin에서는 대부분의 균주가 100 μg/mL 이상의 농도에서도 생육하는 것으로 나타나 다른 항생제 보다 높은 내성 정도를 나타내었다. 이는 이미 발표된 다른 연구(15,16,18)와 유사한 결과로 이들 항생제에 대한 높은 MIC는 BijidobacteriMm이 갖는 특징 중의 하나로 생각되며, 특히 kanamycin, neomycin의 경우에는 Bifidobacterium의 선택배지에 점가되는 선택약제중의 하나이다.
- Penicillin G에 대한 MIC의 농도는 대부분의 균주가 1 曲/ mL 이하의 농도에서 저해되었으나 100μg/mL 이상에서도 생육이 가능한 균주도 14%로 나타났다. Ampicillin와 amoxicillin도 penicillin G와 비슷한 형태를 보여주었고, cephalothin은 1 μg/mL 보다 큰 균주가 87%로 다른 β-lactams계 항생제보다 내성의 정도가 높다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 penicillin G의 MIC의 농도가 1 μg/mL 이하 이었던 Lim(15)의 결과와 비교했을 때 1 μg/mL에서 100 μg/mL까지 고르게 분포하고 있으며 100 p,g/mL 보다 큰 균이 14%나 검출된 것으로 보아 내성률이 높아짐을 알 수 있었다.
- Gram specific antibiotics 내성특성: Gram(+)균의 항생물질인 erythromycin의 경우 50% 이상 균주의 MIC가 1 μg/mL 이하인 것으로 나타났고 1 μg/mL보다 크고 10μg/mL 이하 균이 25%이며 10μg/mL보다 크고 100μg/mL 이하인 균주 개수가 12%였다. Vincomycin의 경우는 전반적으로 1 μg/mL 이하의 균이 대부분이었지 만, 100μg/mL 이상인 균이 34%로 나타났는데 가장 강력한 항생제라 불리우는 vancomycin에 높은 내성을 갖는 균이 많은 것으로 나타났다.
- 인체장관에서 분리한 균주나 유산균 음료의 경우, kanamycin, neomycin, streptomycin, paromo mycin 이들 항생제에 대해 거의 대부분의 분리 균주가 MIC가 10O μg/mL 이상임을 확인할 수 있었다. Gram(+) 균의 항생물질인 erythromycin과 vancomycin의 내성 비교는 erythromycin의 경우 1 ng/mL 이하의 MIC농도를 갖는 균이 인체장관 균의 경우 55%, 유산균식품 분리균의 경우 20%이며, 1 ng/mL 보다 크고 10ng/mL 이하의 내성을 갖는 균은 인체장관이 25%, 유산균 식품 분리균의 경우가 80%로 월등히 높았다. 그러나 인체장관 분리 균주는 다양한 내성 분포를 보여 주었다.
- Tet racycline, erythromycin, penicillin6!] 대한 내성은 매우 다양하게 나타났다. R-lactarm계 항생제인 penicillin G와 cephalothin은 10년보다 더 내성이 높아졌음을 알 수 있었고, ampicillin, amoxicillin, tetracycline은 항생제 농도가 점차 증가하고 있는 것으로 보인다. 인체유래 분리균과 유산균식품 분리균의 항생제 내성은 대부분 비슷한 특성을 보였으나 유산균식품 분리 균주중 vancomycin의 MIC가 100 μg/mL 이상인 균주가 약 20%가 되는 것으로 나타났다.
- 12%였다. Vincomycin의 경우는 전반적으로 1 μg/mL 이하의 균이 대부분이었지 만, 100μg/mL 이상인 균이 34%로 나타났는데 가장 강력한 항생제라 불리우는 vancomycin에 높은 내성을 갖는 균이 많은 것으로 나타났다. 이는 발표된 다른 연구들과 비교했을 때 차이를 보여주고 것으로, Streptococci, Corynebacteria, Clostridia, Listeria, Bacillus species와 같은 Garm(+)균은 보통 0.
- 따라서 인체 장관유래 균과 유산균 식품의 균주 모두 비슷한 항생제 내성 특성을 보여 주고 있는 것으로 나타났으며 vanco mycin 에 대한 내성이 강한 Bifidobacterium균들이 유산균 식품에의 probiotics으로 활용되고 있는 것으로 보인다. 그러므로 현재 항생제 내성 세균의 출현으로 의학적으로 문제가 되고 있는 가운데 특히 최후의 치료 항생제로 알려진 vancomycin 내성이 높은 probiotics 균주에 대한 유해성 검토가 필요할 것으로 보인다.
- 항생제 내성분포를 분석하였다. 분석된 93개의 Bifidobacterium 이 chloramphenicol, rifampicin, erythromycin에 대해서는 감수성을 갖고 있었고, aminoglycoside계 항생제, nalidixic acid와 vancomy cin0)) 내성을 갖는 것으로 나타났다. 그리고 vancomycin의 MIC 가 100μg/mL 이상인 균이 전체 균주 중 34%를 차지했다.
- Ampicillin와 amoxicillin도 penicillin G와 비슷한 형태를 보여주었고, cephalothin은 1 μg/mL 보다 큰 균주가 87%로 다른 β-lactams계 항생제보다 내성의 정도가 높다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 penicillin G의 MIC의 농도가 1 μg/mL 이하 이었던 Lim(15)의 결과와 비교했을 때 1 μg/mL에서 100 μg/mL까지 고르게 분포하고 있으며 100 p,g/mL 보다 큰 균이 14%나 검출된 것으로 보아 내성률이 높아짐을 알 수 있었다. Cephalothin 또한 6.
- R-lactarm계 항생제인 penicillin G와 cephalothin은 10년보다 더 내성이 높아졌음을 알 수 있었고, ampicillin, amoxicillin, tetracycline은 항생제 농도가 점차 증가하고 있는 것으로 보인다. 인체유래 분리균과 유산균식품 분리균의 항생제 내성은 대부분 비슷한 특성을 보였으나 유산균식품 분리 균주중 vancomycin의 MIC가 100 μg/mL 이상인 균주가 약 20%가 되는 것으로 나타났다. 따라서 새로운 probiotics를 개발하기 위해서는 이러한 항생제 내성 특성을 분석하고 항생제 내성 위해성에 대한 검증이 필요한 것으로 보인다.
- Aminoglycoside계 항생제는 Bijidobacterium의 선택배지에 첨가되는 항생제로서 본래 이들 항생제에 대한 내성을 갖고 있다. 인체장관에서 분리한 균주나 유산균 음료의 경우, kanamycin, neomycin, streptomycin, paromo mycin 이들 항생제에 대해 거의 대부분의 분리 균주가 MIC가 10O μg/mL 이상임을 확인할 수 있었다. Gram(+) 균의 항생물질인 erythromycin과 vancomycin의 내성 비교는 erythromycin의 경우 1 ng/mL 이하의 MIC농도를 갖는 균이 인체장관 균의 경우 55%, 유산균식품 분리균의 경우 20%이며, 1 ng/mL 보다 크고 10ng/mL 이하의 내성을 갖는 균은 인체장관이 25%, 유산균 식품 분리균의 경우가 80%로 월등히 높았다.
후속연구
- probiotics으로 활용되고 있는 것으로 보인다. 그러므로 현재 항생제 내성 세균의 출현으로 의학적으로 문제가 되고 있는 가운데 특히 최후의 치료 항생제로 알려진 vancomycin 내성이 높은 probiotics 균주에 대한 유해성 검토가 필요할 것으로 보인다.
- 따라서 새로운 probiotics를 개발하기 위해서는 유익한 효과와 아울러 인체내로의 침투성, 병원성과 항생제 내성 특성 등이 고려 되어야 할 것으로 보인다. 본 연구는 현재 산업적으로 활용되 고 있는 Bifidobacterium의 항생제 내성특성을 분석함과 아울러 장내 유익한 세균인 Bifidobacterium을 한국인 장내에서 분리하여 항생제 감수성 테스트를 수행하여 그 내성 형태를 분석하여 새로운 probiotics개발을 위한 기초자료를 얻고자 하였다.
- 최근에는 vancomycin에 내성을 갖는vancomycin-resistant Enterococcus와 methicillin-resistant Stapylo- coccus aureus(MRSA)의 출현으로 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 따라서 이와같은 100μg/mL 이상의 농도에서 증식하는 Bifidobacterium의 줄현으로 접합(conjugation) 등에의한 다른 병원성 미생물로의 전이될 가능성에 대하여 보다 더 분자 생물학적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.
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