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문제 정의
- 20여종의 Momsci/s속의 균주로부터 mevinolin의 생산능이 우수하면서도 곰팡이 독소성분 citrinin을 생산하지 않는 우량 균주 를 선발하였으며, 콩시료에 대한 고상발효를 최적화하기 위한 영양배지의 조성물이 검토되었다. 선발된 M.
- 먼저 20여종의 Monascus sp의 균주를 대상으로 흥국콩 발효에 적합하면서도 기능성 대사 산물인 mevinolin을 가장 많이 생산하는 우량 균주를 선발하였다. 다음 단계로, 영양 배지인종배양액의 조성에 따라 홍국콩 발효물의 2차 대사 산물 의 생산량을 평가하였으며, 동시에 citrinin이 검출되지 않는 안전한 발효조건을 탐색하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
- 480 mg/mL로 알려졌다(9,10,28).본 연구에서는 Monascus^- 균주의 콩에 대한 고상발효에서, 생체 활성의 2차 대사 산물인mevinolin과 함께 citrinin의 생산이 균주에 따라 어떻게 다른지를 검토하였다. T산)le 2에서와 같이 20여종의 Monascus균주 중에서 M.
- 본 연구에서는 지금까지 시도되지 않은 콩을 대상으로, Monascus 속 균주를 이용하여 항콜레스테롤합성 성분인mevinolin과 곰팡이 독소 성분인 citriniri의 생산가능성을 탐색하기 위해 홍국콩 발 효를 수행하였다. 먼저 20여종의 Monascus sp의 균주를 대상으로 흥국콩 발효에 적합하면서도 기능성 대사 산물인 mevinolin을 가장 많이 생산하는 우량 균주를 선발하였다.
제안 방법
- 세 가지 화합물의 검색은 각 화합물의 최대 파장 224, 237, 247, 260의 중간 파장인 238㎚에서 동시에 측정하였다(13-15, 22). Mevinolin과 mevinolinic acid, 그리고 citrinin의 함량은 각 화합물의 표준물질을 사용하여 작성한 검량선을 이용하여 정량하였다.
- PDA배지에서 1차 배양한 M. pilosus IFO 480을 B형의 액체 배양물에 1백금이 접종한 후, 30℃에서 shaking incubator를 이용하여 4일간 배양한 다음 콩 중량의 10%(v/w)를 접종하여 3ITC에서 발효하였다. 이때 액체배지의 초기 pH를 0.
- 고상발효를 위한 영양^지로 광범위하게 사용되어 왔던 Lin 배지 등(7,21)의 다양한 영양 배지액을 Table 1과 같이 변형하여 4가지 유형으로 조제하였다. 1차 배양에서 분리한 각각의 균주를 각 유형의 조제액에 1백금이 접종한 후, 30℃의 shaking incubator 에서 4일간 배양한 다음 본발효에 사용하였다.
- Table 1에서와 같이 B형의 액체 배양물은, C형의 조성에서 sodium nitrate와 magnesium sulfate를 제외한 나머지 성분인 rice powder, glucose, peptone, glycine 등은 동일하였다. 따라서 C형에 포함된 미량의 무기질 성분을 보충하지 않아도, 홍국발효콩의 기능성 대사 산물의 생성량은 매우 양호한 것으로 나타나, 이후의 고상발효에 쓰이는 액체 배양물은 B형으로 조제하여 실험하였다. Type B의 조성은, 조제액의 양을 기준으로 rice powder 3.
- 05% 이상과 50ppb 이하의 기준안에 부합될 것을 제시하였다. 따라서 이후의 보다 강화된 홍국발효콩의 최적 생산 조건을 탐색하기 위해, 우량 균주로 선정된 Monascus pilosus 480을 종균 배양한 뒤, Table 1과 같이 4가지 유형으로 조제된 액체 배지에서 2차 배양하여 각균주의 생장과 증식을 강화시켰다. 액체 배양물의 일정량(10%, v/w)을 다시 고체시료인 콩에 접종하여 일정 기간 발효하면서 대사산물의 생성량을 평가하였다.
- 동정된 Monascus속의 균주 20종을 한국식품연구원(Korea Food Research Institute)으로 부터 분양받아 우량 균주 선발에 활용하였다. 먼저 모든 균주들은 potato dextrose agar(PDA배지; Difco, MI, USA)를 이용하여 3UC에서 4일간 배양한 다음, 포자의 현탁액을 균질화하여 시료에 접종하거나 종배 양액에 직접 접종하였다.
- USA)를 사용하여 5(TC에서 2시간 균체를 파쇄하고 원심분리(12,000 xg, 10 min)하였다. 상등액을 여과(0.45㎛) 한 다음 HPLC를 이용하여 2차 대사 산물의 함량을 측정하였으며, Capcell Pak Cls UG120 column(250 x 4.6 mm, Shiseido Co., Tokyo, Japan)을 사용하였다. 이동상의 용매는 acetonitrile과 0.
- 8mL/min의 유속으로 용출하였다. 세 가지 화합물의 검색은 각 화합물의 최대 파장 224, 237, 247, 260의 중간 파장인 238㎚에서 동시에 측정하였다(13-15, 22). Mevinolin과 mevinolinic acid, 그리고 citrinin의 함량은 각 화합물의 표준물질을 사용하여 작성한 검량선을 이용하여 정량하였다.
- 따라서 이후의 보다 강화된 홍국발효콩의 최적 생산 조건을 탐색하기 위해, 우량 균주로 선정된 Monascus pilosus 480을 종균 배양한 뒤, Table 1과 같이 4가지 유형으로 조제된 액체 배지에서 2차 배양하여 각균주의 생장과 증식을 강화시켰다. 액체 배양물의 일정량(10%, v/w)을 다시 고체시료인 콩에 접종하여 일정 기간 발효하면서 대사산물의 생성량을 평가하였다.
- 또한 액체배지로 배양한 각 유형의 균주액을 시료 중량의 10%(v/w)를 취하여 콩시료의 고체 배지에 무균적으로 접종하였다. 접종한 시료는 3(TC의 배양기에서 60일간 발효하면서, 일정량을 경시적으로 채취하여 홍국균의 2차 대사 산물의 변화를 관찰하였다. 이때 모든 배양물은 배양 3일째부터 하루에 한 번씩 뒤집기하였으며, 채취한 시료는 동결건조 후 분말화하여 사용할 때까지 냉동고에 보관하였다.
- 0 이하)로 희석하여 시료의 색도를 측정하였다 (7). 즉, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 다음 500nm에서 흡 광도(Hewlett packard spectrophotometer, model 8753, Germany) 를 측정하여 발효물의 색도를 평가하였다.
- , USA)로 부터 구입하여 사용하였으며, acid형의 mevinolin (이하 mevinolinic acid)은 Friedrich 등(13)의 알칼리가수분해법을 일부 변경하여 제조하였다. 즉, 표준품의 mevinolin에 0.1 M의 NaOH를 가하여 1시간동안 5(TC에서 가온한 뒤, 1 M HC1를 사용하여 pH 7.7로 보정한 후 여과(0.22 pun, Millipore Co., Bedford, MA, USA)하여 HPLC(JASCO PU-987 pump, Tokyo, Japan)로 분석하였다. 표준품의 mevinolin과 mevinolinic acid의 분리는 UV spectra(λmax)와 retention time(4)으로 확인하였다.
- mevinolin 화합물을 주출하기 위한 ethanol 등의 모든 용매는 HPLC용(Fisher Co, USA)을 사용하였다. 표준품 mevinolin (lactone form)과 citrinin은 Sigma사(St. Louis, Mo., USA)로 부터 구입하여 사용하였으며, acid형의 mevinolin (이하 mevinolinic acid)은 Friedrich 등(13)의 알칼리가수분해법을 일부 변경하여 제조하였다. 즉, 표준품의 mevinolin에 0.
- , Bedford, MA, USA)하여 HPLC(JASCO PU-987 pump, Tokyo, Japan)로 분석하였다. 표준품의 mevinolin과 mevinolinic acid의 분리는 UV spectra(λmax)와 retention time(4)으로 확인하였다.
- 홍국발효콩의 분말 0.1 g에 methanol, 70% ethanol, 0.1% H3PO4 acetonitrile의 용매를 각각 1.0 mL씩 가해, 초음파기(sonic & materials Inc. USA)를 사용하여 5(TC에서 2시간 균체를 파쇄하고 원심분리(12,000 xg, 10 min)하였다. 상등액을 여과(0.
- 홍국발효콩의 분말에 70% ethanol을 가하여 상온에서 1시간 교반한 후, 적정 농도(O.D. = 2.0 이하)로 희석하여 시료의 색도를 측정하였다 (7). 즉, 0.
대상 데이터
- 강원도 평창에서 2004년에 수확한 백태를 구입하여 시료로 사용하였다. mevinolin 화합물을 주출하기 위한 ethanol 등의 모든 용매는 HPLC용(Fisher Co, USA)을 사용하였다.
- 동정된 Monascus속의 균주 20종을 한국식품연구원(Korea Food Research Institute)으로 부터 분양받아 우량 균주 선발에 활용하였다. 먼저 모든 균주들은 potato dextrose agar(PDA배지; Difco, MI, USA)를 이용하여 3UC에서 4일간 배양한 다음, 포자의 현탁액을 균질화하여 시료에 접종하거나 종배 양액에 직접 접종하였다.
- 본 연구에서는 지금까지 시도되지 않은 콩을 대상으로, Monascus 속 균주를 이용하여 항콜레스테롤합성 성분인mevinolin과 곰팡이 독소 성분인 citriniri의 생산가능성을 탐색하기 위해 홍국콩 발 효를 수행하였다. 먼저 20여종의 Monascus sp의 균주를 대상으로 흥국콩 발효에 적합하면서도 기능성 대사 산물인 mevinolin을 가장 많이 생산하는 우량 균주를 선발하였다. 다음 단계로, 영양 배지인종배양액의 조성에 따라 홍국콩 발효물의 2차 대사 산물 의 생산량을 평가하였으며, 동시에 citrinin이 검출되지 않는 안전한 발효조건을 탐색하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
성능/효과
- Monascus속의 균주 20종을 각각 PDA배지에 배양한 뒤, 일정량의 배양물에 5배의 멸균수를 혼합하여 균질화한 후, 시료 중량의 5%(v/w)를 취하고 고체배지인 콩에 무균적으로 접종하여 15일간 발효시킨 결과는 Table 2와 같다. Monascus 균주의 종류에 따른 정상 발효의 여부와 2차 대사 산물의 생성량을 검토한 결과, M. purpureus ATCC 162를 비롯한 M. purpureus ATCC 228, M. ruber IFO 203, M. ruber IFO 317, 그리고 M. species ATCC 435 등의 균주들은 콩배지에서의 정상 발효의 가능성이 희박하여 결과 처리에서 제외하였다. 한편, 신장과 간장독의 성분으로 알려진 citrinin(Fig.
- 본 연구에서는 Monascus^- 균주의 콩에 대한 고상발효에서, 생체 활성의 2차 대사 산물인mevinolin과 함께 citrinin의 생산이 균주에 따라 어떻게 다른지를 검토하였다. T산)le 2에서와 같이 20여종의 Monascus균주 중에서 M. anka, M. purpureus, M. araneosus, M. kaoliang와 M. bitreus의 일부를 제외한 대부분의 균주에서 citrinin 의 생산은 확인되지 않았다. 발견된 균주들의 citrinin 생산량도 12.
- 3과 같았다. pH 6의 배양물로 접종한 시료의 발효물에 함유된 mevinolin의 양은 0.213%로, pH 4의 0.190%, 그리고 pH 8의 0.155%에 비해 가장 많이 생산되었으며 (p<0.05), 역시 citrinin은 검출되지 않았다. 이 같은 결과는 보리를 이용한 고상발효에서 초기 pH를 6으로 조절할 때, 균사의 성장과 색소발 현 능력이 가장 우수하였다는 Cho 등(19)의 실험 결 과와 유사하였다.
- 특히 carboxyesterase의 활성은 개인차가 심하여서 활성화가 불가능한 사람들도 많은 것으로 알려져 있다 (24). 그러나 본 실험에서 순수 고체 발 효시킨 홍국콩 발효물에 함유된 기능성 물질의 91.8% 이상은, 이미 가수 분해된 활성형의 mevinolinic acid가 주성분으로 나타나, 생체 효율성이 높은 안전한 기능성 물질로 평가될 가능성이 매우 높게 나타났다. 그러나 전체 mevinolin의 총수율은 발효물의 건조시료 중량을 기준으로 0.
- 이와 같은 결과는 시판되는 Monascus 균주 23종을 대상으로 YES(yeast extract sucrose) 배지에서 배양한 결과, citrinin의 생산은 배양물의 색소와 상관없이 모든 시료에서 검출되었다고 보고한 Wang 등(10)과는 차이가 있었다. 그러나 이 실험의 균주 배양은 본 실험의 PDA배지와는 다른 MEA(powdered malt extract, 20 g; peptone, 1.0 g; glucose, 20 g; agar, 15 g; distilled water to 1 L)의 사면 배지를 사용하였으며, 액체 배양물을 제조하기 위해 YES배지를 사용한 것은 뚜렷한 차이점으로 비교되었다. 따라서 Monascus 균주의 배양에 사용되는 배양물의 조성과 농도는 대사 산물의 종류와 생산에 가장 큰 영향을 주는 중요한 요소로 평가할 수 있다.
- 2에서처럼 mevinolinic acid와 lactone형 의 mevinolin 화합물만 발견되었다. 따라서 Monascus pilosus IFO 480을 이용한 홍국발효콩은, 내인성 콜레스테롤의 합성효소(HMGCoA reductase)의 저해 성분 즉, 약리학적 활성형의 acid형인 mevinolin(monacolin K, lovastatin)이 주성분으로 확인되었다.
- 8 이하거나 (30) 통기가 부족할 때 (28) citrinin의 생산이 억제되었다는 보고는 균주의 생장조건이 가장 큰 영향 요인임을 시사하였다. 따라서 본 실험에서 우량 균주로 선발된 M. pilosus IFO 시 80을 이용한 홍국발효콩은, 곰팡이 독소성 분 citrinin을 함유하지 않은 안전한 발효물로 평가되었다.
- bitreus의 일부를 제외한 대부분의 균주에서 citrinin 의 생산은 확인되지 않았다. 발견된 균주들의 citrinin 생산량도 12.1-31.2 gg/g 정도의 매우 미량으로 나타났다. Blanc 등(9) 역시 M.
- Mevinolin과 mevinolinic acid, 그리고 이들의 methyl, ethyl, propyl 등의 에스터는 일반적으로 알코올의 완충용 매에서 대부분 잘 분리되는 것으로 보고되어 왔다(13).본 실험의 콩발효물에서 검출된 mevinolin화합물은 acid형이 물알코올의 용매조건에서 lactone형보다 더 안정한 형태로 관찰되었으며, Fig. 2에서처럼 mevinolinic acid와 lactone형 의 mevinolin 화합물만 발견되었다. 따라서 Monascus pilosus IFO 480을 이용한 홍국발효콩은, 내인성 콜레스테롤의 합성효소(HMGCoA reductase)의 저해 성분 즉, 약리학적 활성형의 acid형인 mevinolin(monacolin K, lovastatin)이 주성분으로 확인되었다.
- 20여종의 Momsci/s속의 균주로부터 mevinolin의 생산능이 우수하면서도 곰팡이 독소성분 citrinin을 생산하지 않는 우량 균주 를 선발하였으며, 콩시료에 대한 고상발효를 최적화하기 위한 영양배지의 조성물이 검토되었다. 선발된 M. pilosus IFO 480으로 발효시킨 홍국콩 발효물에 함유된 mevinolin의 주요 화합물은, 약리학적 활성형(drug)의 mevinolinic acid로 밝혀졌다 (91.8%). 따라서 홍국발효콩은 생체 활성형의 항 콜레스테롤 성분을 최대 0.
- 4와 같았다. 전체적으로 발효시간이 경과할수록mevinolin의 생성량은 증가하는 경향으로 나타났다. 발효 28일경에 mevinolin의 생산량은 0.
- 콩시료를 기질로 하여, 4가지 유형의 액체 배양물을 접종한 후 15일간 발효한 다음 2차 대사 산물의 생성량을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 즉, Type B는 총mevinolin의 함량이 0.145%로 나타나, 액체의 영양 배지를 사용하기 전보다 그 수율이 약 2배로 향상되었다. Citrinin의 생성은, 쌀가루 대신 콩가루를 액체 배지의 영양원으로 사용한 Type D에서 71.
- 일반적으로 mevinolin의 생합성은 사용균주(16)와 생장 및 번식 조건 (20,21)에 따라 그 생산량이 좌우되는 것으로 알려져 왔다. 즉, 기질에 대한 균주의 최대 성장이 발휘되는 시점에서 대사산물의 최대 생성량도 관찰되었다. 기대했던 대로, 홍국발효콩에 함유된 mevinolin의 주성분은 acid형의 mevinolinic acid가 전체의 91.
- 064%) 균주들로 선발되었다. 특히 M. pilosus IFO 480균주의 mevinolin의 함량은 0.072%로, 나머지 균주들보다 1.4배에서 5.5배로 높게 나타나 유용한 대사 산물을 가장 많이 생성하면서도 독성 성분인 citrinin은 생산하지 않는 홍국콩발효에 가장 적합한 우량 균주로 확인되었다. 또한 Fig.
- 5 ^g/g검출되었고, 나머지 유형의 액체 배지 발효물에서는 검출되지 않았다. 특히 Type B는 Type C와 함께 mevinolin의 총생성량이 각각 0.145%와 0.143%로 나타났으며, 두 가지 유형에서 모두 citrinin은 검출되지 않아 콩의 고상발효에 가장 적합한 액체 배양물로 평가되었다. 특히 A형과 D형의 배양물로 접종한 홍국발효콩은 2차 대사 산물의 생성량이 미량으로 나타나, Mbnoscws균주에 의한 콩발효는 액체 배 양물의 영양원이 중요한 조건으로 시사되었다.
- 따라서 Monascus 균주의 배양에 사용되는 배양물의 조성과 농도는 대사 산물의 종류와 생산에 가장 큰 영향을 주는 중요한 요소로 평가할 수 있다. 한편 홍국콩의 정상적인 발효와 함께, 유용한 대사 산물인 mevinolin의 생성량이 0.04% 이상이면서 독성 성분인 citrinin의 검출량이 50|ig/g 이하로 낮은 균주는, M. anka IFO 478(0.052%), M. purpureus ATCC 489(0.051%), M. pilosus IFO 480(0.072%), 그리고 M kaoliang ATCC 595(0.064%) 균주들로 선발되었다. 특히 M.
- species ATCC 435 등의 균주들은 콩배지에서의 정상 발효의 가능성이 희박하여 결과 처리에서 제외하였다. 한편, 신장과 간장독의 성분으로 알려진 citrinin(Fig. 1)의 검출량은 균체의 색도가 높을수록, 즉 적색의 색소 대사 산물이 많이 생성될수록 높게 평가되었다(data not shown). Citrinin의 검출량 이 미량이거나 검출되지 않은 균체배양물의 색은 색도값(O.
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