미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 매우 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 동백의 종자, 종피, 유엽 그리고 성엽으로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해활성을 조사하였다. 각각의 동백부위로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin agarose plate로 확인한 결과 fibrin clot을 효과적으로 분해하였다. 그 중 단백질 분해효소의 활성이 다른 부위보다 20-33배로 높았던 동백종자와 종피의 수용성 추출물의 혈전용해활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.6-2.0배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 30-80%황산암모늄을 이용하여 농축하였으며 혈전용해효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하였다. SDS-PAGE에 의하여 동백유엽의 혈전용해효소 분자량을 측정한 결과 45 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 각종 pretense 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 PMSF,그리고 TLCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EDTA와 DTT처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않고 오히려 증진된 양상을 확인할 수 있었다. 또한, 효소 활성에 미치는 pH 및 온도의 효과는 약간의 산성쪽에 가까운 pH 5.5와 $30^{\circ}C$에서는 최적의 활성을 나타내었으며, $45^{\circ}C$ 이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 감소하였다. 이상의 모든 결과로 볼 때 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.
미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 매우 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 동백의 종자, 종피, 유엽 그리고 성엽으로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해활성을 조사하였다. 각각의 동백부위로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin agarose plate로 확인한 결과 fibrin clot을 효과적으로 분해하였다. 그 중 단백질 분해효소의 활성이 다른 부위보다 20-33배로 높았던 동백종자와 종피의 수용성 추출물의 혈전용해활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.6-2.0배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 30-80%황산암모늄을 이용하여 농축하였으며 혈전용해효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하였다. SDS-PAGE에 의하여 동백유엽의 혈전용해효소 분자량을 측정한 결과 45 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 각종 pretense 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 PMSF,그리고 TLCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EDTA와 DTT처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않고 오히려 증진된 양상을 확인할 수 있었다. 또한, 효소 활성에 미치는 pH 및 온도의 효과는 약간의 산성쪽에 가까운 pH 5.5와 $30^{\circ}C$에서는 최적의 활성을 나타내었으며, $45^{\circ}C$ 이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 감소하였다. 이상의 모든 결과로 볼 때 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.
The fibrinolytic activities of soluble proteins extracted from young leaves of Camellia japonica L. were studied. Fibrinolvity activity of extract from partitions of C. japonica L. showed 1.6-2.0 times higher than plasmin used as positive control. The fibrinolytic enzyme was confirmed directly from ...
The fibrinolytic activities of soluble proteins extracted from young leaves of Camellia japonica L. were studied. Fibrinolvity activity of extract from partitions of C. japonica L. showed 1.6-2.0 times higher than plasmin used as positive control. The fibrinolytic enzyme was confirmed directly from young leaves of C. japonica L. by a fibrin Plate and fibrin zymography. The protein was composed of a single polypeptide and its apparent molecular weight was found to be 45 kDa, as judged by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimum pH and temperature for the fibrinolytic activity were pH 5.5 and $30^{\circ}C$, respectively. Also, the fibrinolytic activity was clearly inhibited by PMSF and TLCK, suggesting that it is a member of the trypsin-like serine protease. All these results suggest the protease is a fibrinolytic enzyme belong to a family of trypsin-like serine protease.
The fibrinolytic activities of soluble proteins extracted from young leaves of Camellia japonica L. were studied. Fibrinolvity activity of extract from partitions of C. japonica L. showed 1.6-2.0 times higher than plasmin used as positive control. The fibrinolytic enzyme was confirmed directly from young leaves of C. japonica L. by a fibrin Plate and fibrin zymography. The protein was composed of a single polypeptide and its apparent molecular weight was found to be 45 kDa, as judged by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimum pH and temperature for the fibrinolytic activity were pH 5.5 and $30^{\circ}C$, respectively. Also, the fibrinolytic activity was clearly inhibited by PMSF and TLCK, suggesting that it is a member of the trypsin-like serine protease. All these results suggest the protease is a fibrinolytic enzyme belong to a family of trypsin-like serine protease.
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문제 정의
따라서 본 연구는 새로운 혈전용해 효소개발을 위한 기초 연구로 차나무과의 식물로 최근 다양한 기능성을 가지고 있다고 알려진 동백나무 (C. Japonica L.)로부터 혈전 용해 효소 생산성를 조사하고 동백나무의 유엽으로부터 조효소 용액을 추출하여 fibrin zymography와 fibrin plate 법을 이용하여 혈전용해 효소의 활성과 부분적인 효소의 특성을 조사하였다.
제안 방법
즉, 0.12% fibrinogen과 100㎕의 thrombin 용액 (100 NIH U/mg)을 함유한 12% polyacrylamide gel에 20 "g 의 시료를 zymogram sample bufier (5X0와 혼합하여 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 2.
A, fibrin zymography； B, fibrin agarose plate; C, fibrinolyhc activity. Lanes and holes, 1, plasmin (0.01 U) as control; 2Z 1 mM PMSF; 3, 1 mM ED7A, 4,1 mM TLCK; 5,1 mM TPCK; 6,1 mM DTT Electrophoresis and fibrin agarose plate were performed with 12% SDSpolyaciylamide and 1.2% agarose gel containing 0.12% fibrinogen and 100 NIHU/㎖ thrombin. Activity was detected by incubation at 37℃ for 12 hr.
pH에 따른 효소의 활성도 변화를 알아보기 위하여 3.5에서 10.0까지 0.5의 간격으로 각각 pH별로 1시간 반응시킨 후 azocasein assay와 fibrin plate를 수행하여 각각의 pH에 의한 단백질분해효소와 혈전용해효소의 활성 변화를 측정하여 pH 에대한 효소의 안정성을 조사.하였다.
각각의 종자, 종피, 유엽, 그리고 성엽의 추출물에 대한 혈전 분해 활성은 fibrin agarose plate를 이용하여 각각의 주출물에 의하여 투명환을 형성함으로써 확인할 수 있었헜으며, 기존의 혈전용해제인 plasmin을 양성 대조구로 그 활성을 비교하였다. Fig.
각종 protease 저해제의 영향을 조사하기 위하여 PMSF, EDTA, TLCK, TPCK 그리고 DTT 등을 첨가하여 혈전 용해 활성을 fibrin zymography와 fibrin agarose plate로 측정한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. PMSF, TLCK 및 TPCK는 serine protease inhibitor0] 고 그 중 TLCK는 trypsin-like serine protease inhibitor 그리고 TPCK는 chemotrypsin-like serine protease inhibitor로 알려져 있으며, EDTA는 강력한 metallo-protease inhibits이며 DTT는 polypeptide내의 disulfide bond를 절단하는 제제로 알려져 있다.
2% agarose 용액을 5mZ 첨가하여 다시 잘 혼합하고 petri- dish에 부어 상온에 30분간 방치하여 fibrin clot을 형성시켜 fibrin-agarose plate를 제조하였다. 그리고 나서 구멍을 뚫어 10㎕의 각각의 시료를 떨어뜨린 후 37℃에서 18시간 반응시키고 난 다음 형성된 투명환의 직경을 표준시료인 plasmin과 비교하여 측정하였다.
4)에 상온에서 30분간 고정한 다음 증류수 세척하고 다시 효소반웅 완충용액에 넣어 37℃에서 12 시간 반응한 다음 염색하고 탈색하여 확인하였다. 그리고 혈전 용해 효소에 해당하는 부분의 단백질을 추출하여 효소의 부분적 특성을 조사하였다
SDS-PAGE상에서 수행하였다. 시료는 환원성상태의 sample buflfer에서 2-mercaptoethanol을 제외한 비환원 sample buffet를 이용하여 non-reducing 조건에서 전기영동 하였고 혈전 용해 효소의 분자량은 표준단백질을 이용하여 상대적인 이동도인 Rf 값과 분자량의 semi-logarithmic plot에 의하여 결정하였다.
4) 300 ㎕ 에 각각의 측정시료를 50 ㎕ 넣고 37℃의 항온수조에서 30분간 반응시킨 후, 미리 차게 한 10% (W/V)의 TCA용액을 600㎕을 넣고 즉시 혼합하였다. 시료들은 10분 동안 얼음에 놓아두어 반응을 정지시킨 다음, 원심분리하고 상층액을 분리하여 366nm에서 흡광도를 측정하고 azocasein 표준곡선을 이용하여 단백질 분해활성을 환산하였다.
온도에 따른 효소의 활성도 변화를 알아보기 위하여 30℃에서 80℃까지 5℃의 간격으로 각각 온도별로 1시간 반응시킨 후 azocasein assay와 fibrin plate를 수행하여 각각의 온도에의 한 단백 질분해 효소와 혈전용해 효소의 활성 변화를 측정 하고 온도에 대한 효소의 안정성을 조사하였다.
일반적인 protease 저해제로 알려진 PMSF, EDTA, TLCK, TPCK, DTT등을 ImM의 농도로 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액으로 제조한 다음 추출효소를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 효소활성을 즉정하고 fibrin zymography와 fibrin agarose plate에 의하여 활성을 비교하였다.
0 배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 30-80% 황산암모늄을 이용하여 농축하였으며 혈전용해 효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하였다. SDS-PAGE에 의하여 동백 유엽의 혈전용해효소 분자량을 측정한 결과 45 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 각종 protease 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 PMSF, 그리고 TLCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다.
하여 측정하였다. 즉, 20 mM Tris-Cl buffer (pH 7.4)로 fibrinogen의 최종농도가 0.12%가 되도록 완전히 용해한 다음, 그 용액 5mC에 0.1 ㎖의 100NIH U/㎖의 thrombin 용액을 첨가하여 잘 혼합한 다음, 동일한 완충용액으로 만든 1.2% agarose 용액을 5mZ 첨가하여 다시 잘 혼합하고 petri- dish에 부어 상온에 30분간 방치하여 fibrin clot을 형성시켜 fibrin-agarose plate를 제조하였다. 그리고 나서 구멍을 뚫어 10㎕의 각각의 시료를 떨어뜨린 후 37℃에서 18시간 반응시키고 난 다음 형성된 투명환의 직경을 표준시료인 plasmin과 비교하여 측정하였다.
혈전용해 효소활성의 측정은 fibrin plate 법 (Astrup and Mullertz, 1952)을 약간 변형하여 혈전용해 효소인 plasmin을 표준시료로 하여 측정하였다. 즉, 20 mM Tris-Cl buffer (pH 7.
효소활성에 미치는 pH의 영향을 fibrin agarose plate에서 조사하였다. Fig.
대상 데이터
본 실험에 사용한 동백나무의 종자 및 잎은 전남 장흥군 천관산의 동백자생 군락지에 있는 아새 동백나무의 유엽을 4-5 월에 채취하여 동결건조 (Freeze dryer, Samwon Co.)하여 사용하였다.
이론/모형
Fibrin zymography는 Kim et al 방법 (1998)에 의하여 수행하였다. 즉, 0.
단백질 정량은 Bradfbrd법 (1976)에 의해 단백질 정량 Kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 OD750에서 흡광도를 측정하였으며 표준시료로는 Bovine serum albumim (BSA)를 사용하였다.
단백질의 전기영동은 Laemmli 방법 (1970)을 약간 변형한 12% SDS-PAGE상에서 수행하였다. 시료는 환원성상태의 sample buflfer에서 2-mercaptoethanol을 제외한 비환원 sample buffet를 이용하여 non-reducing 조건에서 전기영동 하였고 혈전 용해 효소의 분자량은 표준단백질을 이용하여 상대적인 이동도인 Rf 값과 분자량의 semi-logarithmic plot에 의하여 결정하였다.
성능/효과
Fig. 1에서 보는 바와 같이 대조구로 사용한 정제된 혈전 용해 효소인 plasmin과 비교 하였을 때 종피와 종자에서 약 1.6-2.0배의 높은 활성을 나타내었으며, 유엽과 성엽의 효소 활성은 plasmin과 비교하였을 때 상대적으로 그 활성이 낮게 나타났다. 또한 종자와 종피의 효소 활성은 유엽과 성엽의 효소 활성에 비하여 상대적으로 약 1.
전체 수용성 단백질은 30-80% 황산암모늄을 이용하여 농축하였으며 혈전용해 효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하였다. SDS-PAGE에 의하여 동백 유엽의 혈전용해효소 분자량을 측정한 결과 45 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 각종 protease 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 PMSF, 그리고 TLCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EDTA와 DTI처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않고 오히려 증진된 양상을 확인할 수 있었다.
6에 나타내었다. 그 결과 30℃에서 최적 활성을 보였으며 45℃ 이하의 온도에서는 비교적 안정적인 효소 활성을 보인 반면 45℃ 이상의 온도에서는 급격히 효소활성이 저하되어 50℃에서 40%의 효소활성을 보이다가 70℃ 이상에서는 20% 이하로 현저히 감소되어 활성을 전혀 나타내지 않았다.이는 뱀독류 Agkistrodon piscivorus piscivorus의 piscivo- rase I과 I]의 65℃ (Hahn et al.
단백질과 효소활성의 비를 Table 1에 나타내었다. 그 결과 각각 동백의 종자, 종피, 유엽 그리고 성엽의 수용성 단백질이 효과적으로 추출되어 농축되었음을 알 수 있었다. 혈전 분해효소는 단백질분해효소의 일종으로 주로 serine protease나 metallo-protease로 알려져 있어 혈전분해 활성을 검증하기 위해서는 단백질분해 활성 검증이 선행되어야 한다.
확인한 결과 fibrin clot을 효과적으로 분해하였다. 그 중 단백질 분해효소의 활성이 다른 부위보다 20-33배로 높았던 동백종자와 종피의 수용성 추출물의 혈전용해활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.6-2.0 배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 30-80% 황산암모늄을 이용하여 농축하였으며 혈전용해 효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하였다.
SDS-PAGE에 의하여 동백 유엽의 혈전용해효소 분자량을 측정한 결과 45 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 각종 protease 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 PMSF, 그리고 TLCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EDTA와 DTI처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않고 오히려 증진된 양상을 확인할 수 있었다. 또한, 효소 활성에 미치는 pH 및 온도의 효과는 약간의 산성쪽에 가까운 pH 5.
동백유엽의 혈전용해 효소를 30-80%의 황산암모늄으로 포화하여 농축한 다음, 동백 혈전용해효소의 단일성 확인과 분자량 측정을 위해 SDS-PAGE와 fibrin zymography# 수행한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 혈전용해 효소임을 확인하였고, 동백의 혈전용해효소 분자량은 38kDa의 주된 단백질이 아닌 약 45kDa의 미량 단백질임을 알 수 있었으며, 이와 같은 결과는 동백과 같은 식물류의 시료 조효소액의 단백질분해효소 활성이 일반적인 plate 측정법인 skim-milk plate에서 단백질 분해활성이 검출되지 않은 이유의 하나가 된다고 생각된다. 본 효소는 Vipera lebetincP^^ 분리한 뱀독 류의 fibrin clot에 직접 작용하는 혈전용해 효소인 lebetase의 분자량 약 22kDa (Siigur et al.
혈전 분해효소는 단백질분해효소의 일종으로 주로 serine protease나 metallo-protease로 알려져 있어 혈전분해 활성을 검증하기 위해서는 단백질분해 활성 검증이 선행되어야 한다. 따라서 각각의 동백의 종자, 종피, 유엽 그리고 성엽으로부터 추출한 수용성 단백질로부터 Azocasein 법을 이용하여 단백질 분해활성을 조사하였는데 그 결과 농축된 전체 단백질의 양에 비하여 비활성이 각각 종자는 56.528 units/mg, 종피는 62.741 units/mg, 유엽은 3.907units/mg 그리고 성엽에서는 1.941 units/mg로 나타나 전체 수용성 단백질의 양에 대한 단백질 분해효소의 비활성이 종자와 종피에서 유엽과 성엽의 단백질분해효소의 활성에 비하여 약 20-33배 높은 활성을 나타내었다.
0배의 높은 활성을 나타내었으며, 유엽과 성엽의 효소 활성은 plasmin과 비교하였을 때 상대적으로 그 활성이 낮게 나타났다. 또한 종자와 종피의 효소 활성은 유엽과 성엽의 효소 활성에 비하여 상대적으로 약 1.8〜3.8배의 강력한 혈전 용해 활성을 나타내었으나 유엽과 성엽에서는 전체 단백질에 비하여 상대적으로 낮은 혈전용해 활성을 나타내었다.
그러나 EDTA와 DTI처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않고 오히려 증진된 양상을 확인할 수 있었다. 또한, 효소 활성에 미치는 pH 및 온도의 효과는 약간의 산성쪽에 가까운 pH 5.5와 30℃에서는 최적의 활성을 나타내었으며, 45℃ 이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 감소하였다. 이상의 모든 결과로 볼 때 동백유엽의 혈전용해효소는 tr^sin과 유사한 serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.
PMSF, TLCK 및 TPCK는 serine protease inhibitor0] 고 그 중 TLCK는 trypsin-like serine protease inhibitor 그리고 TPCK는 chemotrypsin-like serine protease inhibitor로 알려져 있으며, EDTA는 강력한 metallo-protease inhibits이며 DTT는 polypeptide내의 disulfide bond를 절단하는 제제로 알려져 있다. 본 연구의 결과 각종 저해제에 대한 저해효과는 금속이온의 chelate제인 1 mM의 EDTA와 DTT에서는 오히려 대조구인 plasmin (0.01 보다 활성이 증진되고, TPCK를 첨가한 경우 약 8%의 저해 효과를 보인 반면, PMSF와 TLCK를 ImM의 농도로 첨가한 경우 활성이 43〜69%의 저해효과를 나타낸 것으로 보아 동백 유엽의 혈전용해 효소는 trypsin과 유사한 serine protease일 것으로 생각되며, DTE] 의해 활성이 저해되지 않는 것으로 보아 disulfide 결합을 가지지 않는 단일한 polypeptide로 구성된 단백질로 생각된다.
5와 30℃에서는 최적의 활성을 나타내었으며, 45℃ 이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 감소하였다. 이상의 모든 결과로 볼 때 동백유엽의 혈전용해효소는 tr^sin과 유사한 serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.
전체 수용성 단백질에서 혈전용해 효소를 확인하고, 분리하기 위하여 종자, 종피, 유엽 그리고 성엽의 추출물로부터 non reducing 조건의 RAGE를 행하고 fibrin zymography를 수행한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 추출물 모두에서 활성이 나타났으며, 이는 plasminogen activator (t-PA)나 urokinase 같은 fibrin clot에 간접적으로 작용하는 효소와는 달리 동백의 혈전 용해 효소는 fibrin clot에 직접적으로 작용하는 혈전 용해 효소일 것으로 생각된다.
각각의 동백부위로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin agarose plateS. 확인한 결과 fibrin clot을 효과적으로 분해하였다. 그 중 단백질 분해효소의 활성이 다른 부위보다 20-33배로 높았던 동백종자와 종피의 수용성 추출물의 혈전용해활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.
후속연구
, 2000)등 뱀독류, 미생물류, 곤중류, 동물류, 녹조류 둥에서 분리한 혈전용해 효소와는 다르게 분자량이 더 크게 나타났으나 곤충인 제조로부터 분리한 혈전 용해 효소 45kDA (Park and Park, 1998)과는 유사한 크기의 단백질임을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 기존에 보고된 혈전 용해 효소의 분리에 있어 식물류에 대한 보고가 극히 적어 식물류의 혈전용해 활성에 대한 검토와 강력한 혈전 용해 활성을 가지는 식물류의 탐색이 필요하다고 생각된다, 특히, 식물류도 혈전용해효소의 효과적인 시료가 됨을 알 수 있었으며, 추후 효과적인 정제과정과 분석 실험을 통하여 효소의 특성을 명확히 파악하고 작용기전을 조사해야 할 것으로 생각된다.
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