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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전통 메주로부터 protease 생성능이 우수한 균주를 선별하여 메주를 만들어 된장을 제조하여 90일간 숙성시키면서 각 된장의 숙성도와 효소력, 그리고 항산화력을숙성일별로 측정하면서 protease 생성 균주의 사용이 된장의 품질에 미치는 영향을 조사하여 된장 제조를 위한 기초 자료로 사용하고자 하였다.
제안 방법
- 그리고 45℃로 유지되는 incubator 에서 9일간 반응시키면서., 일정 기간별 반응 용액을 채취하여 이 반응 용액을 sepamting fiinnel에서 chlorofbm 25 ml를 첨가하여 진탕시킨 후, 하층부만을 취하여 acetic acid glacial 25m/와 KI 포화용액 In*을 가한 다음, 암소에서 5분간 방치시킨 다음, 증류수 50 ml를 가하고 0.01 N Sodium thiosulfete solution으로 적정하여 과산화물가를 계산하였다.
- 5g, Agar 0.5g, Rosebengal 1 g을 증류수 lOOm/에 녹여 제조한 배지에 도말하여 25。0에서 72시간 배양한 후 배지에 나타난 환의 크기와 protease 활성을 측정하여 단백질 분해능이 우수한 균주를 선별하였다.
- 효소활성 측정을 위한 조효소액은 된장시료 10 g에 증류수 100 ml를 첨가하여 상온에서 30분 동안 진탕 추줄한 후, 원심분리기를 사용하여 (8,000 rpm, 20 min) 그 상징 액만을 취하여 조효소액으로 하였다. Amylase 활성 측정은 1% soluble starch용액을 기질로 사용하는 D.U.N.(Dextrinogenic Unit of Nagase)법11), protease 활성 측정은 0.6% casein 용액을 기질로 하는 Anson 변법12), lipase 활성은 올리브 오일을 사용하는 김 등13)의 방법을 변형시켜 tributyrin을 기질로 사용하여 즉정하였다. 환원당 함량은 Dinitrosalicylic acid(DNS)에 의한 비색법 M)에 의해 측정하였다.
- Linoleic acid에 의한 괴산화물가 측정. 90일간 숙성시킨 된장 에탄올 추출물 5 ml를 linoleic acid에 넣고 9일간 과산화 물가를 측정한 결과는 Fig.
- 4 ml를 가한 후 vortex로 10초간 진탕하고 10분후 526 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 추출물 대신 추출용 매만을 넣은 것으로 같은 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 전자공여 능은 시험구와 대조구의 흡광도를 통해 백분율로 나타내었다.
- 제조. 된장 제조에 사용한 원료, 메주와 소금과 물의 비율을 33:13: 54로 하였다. 선별한 대두를 물로 씻어 이물질을 제거한 다음, 24시간 동안 침지한 후 이를 121℃에서 1시간 동안 증자시킨 후, 30℃까지 냉각시켰다.
- 된장 추출물의 항산화력 측정. 된장의 ethanol 추출물의 DPPH 라디칼에 의한 전자공여작용을 측정한 결과를 Table 3 에 나타내었다.
- 전자공여능 측정. 된장의 에탄올 추출물을 이용한 전자공여 능 측정은 a, a-diphenyl-P-picryl hydrazyl(DPPH, Sigma, USA) 에 대한 전자공여효과로서 추출물의 환원력을 측정하였다, 즉, 추출물 0.6 m/에 4X104 M DPPH 용액(99% Ethanol에 용해) 2.4 ml를 가한 후 vortex로 10초간 진탕하고 10분후 526 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 추출물 대신 추출용 매만을 넣은 것으로 같은 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 전자공여 능은 시험구와 대조구의 흡광도를 통해 백분율로 나타내었다.
- 숙성기간 동안 15일마다 된장 시료를 채취하여 동결 건조하여 보관하면서 본 실험에 사용하였다. 수분은 시료 1 g을 취해서 Moisture Determination Balance를 사용하여 측정하였다.
- 암모니아태 질소함량 측정은 indophenol-blue 법15)을 사용하여 측정하였다. 아미노태 질소 함량 측정과 동일한 시료액 0.11M/에 A용액(Phenol 10g and sodium nitroprusside dihydrate 0.05 g in distilled water 1, 000 m/)과 B용액(N&HPQ . 12H2O 9g, NaOH 6g and NaOCl 10 m/ in distilled water 1,000 m/)을 각각 2 이씨 넣어 37, C에서 20분간 반응시킨 후 630nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 ammonium sulfhte를 0-200)㎍으로 단계적으로 희석하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 작성하였다.
- 전통 메주로부터 proteasef- 생성하는 곰팡이를 분리한 후, 이를 사용하여 메주를 만들고, 자연 발효 하여 메주를 만든 것을 대조구로 하여 된장을 제조하고 90일간 숙성시키면서 각 된장의 효소력과 환원당 함량 그리고 아미노태 질소와 암모니아태 질소량을 측정하여 첨가한 곰팡이가 된장의 품질에 미치는 영향을 조사하였다.
- 여기에 미리 배양한 균주를 접종하여 메주를 성형하였다. 즉, 전통메주로부터 분리한 균주를 접종하여 제조한 것과, 균주를 접종하지 않고 자연 발효 시켜 제조한 것을 대조구로 해서 메주를 성형하였다. 성형한 메주를 상온에서 겉말림을 한 뒤, 볏집으로 묶어 30일 동안 발효시켰다.
- 12H2O 9g, NaOH 6g and NaOCl 10 m/ in distilled water 1,000 m/)을 각각 2 이씨 넣어 37, C에서 20분간 반응시킨 후 630nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 ammonium sulfhte를 0-200)㎍으로 단계적으로 희석하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 작성하였다.
대상 데이터
- 원료 및 균주 분리. 된장 제조에 사용한 대두는 건국대학교 여주실습농장에서 재배한 황 대두를 구입하여 사용하였으며, 소금은 태초솔트((주)태초솔트) 볶음 소금을 사용하였다. 전국에서 수집한 메주에서 곰팡이를 분리하기 위하여 각각의 시료 10 g에 생리 멸균수 90 ml를 취해서 30분간 진탕하여 10-3~10-5으로 희석한 후 PDA 3.
- 완성된 메주를 적당히 파쇄하여 항아리에 넣고 소금과 물을 넣어 90일간 숙성시켰다. 숙성기간 동안 15일마다 된장 시료를 채취하여 동결 건조하여 보관하면서 본 실험에 사용하였다. 수분은 시료 1 g을 취해서 Moisture Determination Balance를 사용하여 측정하였다.
이론/모형
- 암모니아태 질소함량 측정. 암모니아태 질소함량 측정은 indophenol-blue 법15)을 사용하여 측정하였다. 아미노태 질소 함량 측정과 동일한 시료액 0.
- 6% casein 용액을 기질로 하는 Anson 변법12), lipase 활성은 올리브 오일을 사용하는 김 등13)의 방법을 변형시켜 tributyrin을 기질로 사용하여 즉정하였다. 환원당 함량은 Dinitrosalicylic acid(DNS)에 의한 비색법 M)에 의해 측정하였다.
성능/효과
- 6과 같다. 9일간 반응시켰을 때 추출물을 넣지 않은 linoleic acid의 경우 1919meq/kg까지 과산화 물가가 증가하였으나, 에탄올 추출물을 넣은 경우는 43-52 meq/ kg을 보여 항산화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 측정결과는 Table 4와 같다. Ethanol 추출물에서 AOA 의 값이 0.17-0.27로 나타나 항산화성을 확인할 수 있었으며, 시료별로는 큰 차이를 보이지 않았고, 숙성일별로도 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 앞선 전자공여능에서 나타난 결과와 같은 원인인 것으로 생각된다.
- Protease 활성은 분리 곰팡이를 사용한 된장이 대조구보다 높았으며 숙성 30-45 일경에 최대치를 보이다가 그 이후 감소하는 경향을 나타내었다. Lipase 활성은 대조구와 시험구 된장에서 차이가 거의 없었고, 숙성 30일경에 최대 활성을 보이다가 그 이후 계속적으로 감소하였다. 환원당 함량은 숙성이 진행되면서 감소하였다.
- 효소력 측정 결과, amylase 활성은 모든 시료에서 낮은 활성을 보였으며, 숙성이 진행되면서 계속적인 감소세를 보였다. Protease 활성은 분리 곰팡이를 사용한 된장이 대조구보다 높았으며 숙성 30-45 일경에 최대치를 보이다가 그 이후 감소하는 경향을 나타내었다. Lipase 활성은 대조구와 시험구 된장에서 차이가 거의 없었고, 숙성 30일경에 최대 활성을 보이다가 그 이후 계속적으로 감소하였다.
- 3과 같다. 대조구와 protease 활성이 높은 균주를 사용하여 제조한 된장의 숙성기간에 따른 lipase 효소활성의 변화는 숙성초기인 15일에서부터 숙성 30일까지는 그 활성이 증가하여 최대치를 보여 각각 33.0, 35.75 unit/g을 나타냈으며, 그 이후 숙성 60일 까지는 완만히 감소하다가 숙성 75일 부터는 급격히 감소하는 경향을 보였다. 이런 경향은 20일까지는 lipase의 활성도가 증가하여 최대 활성을 나타냈으나 그 이후 100일까지 감소하는 경향을 보였다는 주등20)의 보고와 비슷하였다.
- 22 unit/g으로 나타났다. 대조구와 시험구의 효소활성은 큰 차이를 보이지는 않았지만, 숙성기간에 따라 amylase 효소활성은 급격히 감소하는 경향을 보였다. 즉, 숙성기간에 따른 효소 활성은 모든 시료 된장에서 숙성 초기인 15일째에서 가장 높았으며, 그 이후에 계속적인 감소를 보여, 숙성 90일에는 시료별로 각각 4.
- 숙성기간에 따른 각 시료 된장의 환원당 함량을 조사한 결과는 Table 2와 같다. 된장 중의 환원당 함량은 2.08% 이하로 매우 낮았으며, 숙성일이 경과함에 따라 환원당 함량은 점차 낮아지는 경향을 보였다.
- 등의 라디칼에 전자를 주는 능력인 전자 공여능이 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서 대조구와 균주를 첨가한 시험구 된장 간에 DPPH에 의한 전자공여작용을 통해 조사한 항산화 작용에서 별다른 차이가 나지 않는 것은 항 산화력을 나타내는 물질이 균주에 의한 것이라기 보다는 주로 대두 자체에 들어있는 성분에 의한 것이므로 이같은 결과를 나타낸 것으로 생각된다.
- 따라서 본 연구에서 각 시료 된장의 amylase의 활성이 매우 낮았으며, 숙성 초기인 15일에서 최대를 보인 후, 그 이후 계속적인 감소추세를 보였으므로, 환원당 함량 변화 역시 이와 비슷하게 나타난 것으로 보인다. 또한 본 연구에서 된장 제조시 전분질 원료를 사용하지 않았으므로, amylase의 기질이 되는 전분이 부족하여 그 활성이 낮았으며, 환원당 함량도 낮은 것으로 추정된다.
- 따라서 본 연구에서 각 시료 된장의 amylase의 활성이 매우 낮았으며, 숙성 초기인 15일에서 최대를 보인 후, 그 이후 계속적인 감소추세를 보였으므로, 환원당 함량 변화 역시 이와 비슷하게 나타난 것으로 보인다. 또한 본 연구에서 된장 제조시 전분질 원료를 사용하지 않았으므로, amylase의 기질이 되는 전분이 부족하여 그 활성이 낮았으며, 환원당 함량도 낮은 것으로 추정된다. 최 등6은 코지의 종류와 배합을 달리한 된장의 특성 연구에서 환원당 함량 변화는 쌀 된장과 밀 된장의 환원당 함량은 코지의 비율이 높을수록 증가하였으나, 콩 된장은 코지의 비율과는 관계없이 다른 된장에 비해 환원당 함량이 낮다고 보고하였다.
- 아미노태 질소함량은 분리한 곰팡이를 사용하여 제조한 된장이 대조구보다 높았으며, 숙성이 진행되면서 계속적인 증가세를 보였다. 모든 시료의 에탄올 추출물에서 항산화력이 있음이 확인되었다.
- 본 실험에서 시료에 따라 과산화물가가 다르게 나타나기는 했지만 그 차이가 크지 않았으며, 숙성 기간에 따른 차이 역시 숙성 일이 증가함에 따라 큰 차이를 볼 수 없었다. 이렇게 시료별, 숙성일별로 과산화물가의 차이가 크지 않은 것은 대조구와 균주를 첨가한 시험구 된장의 항 산화력에 차이가 거의 없는 것으로 생각된다.
- 한편 식품공전상 된장의 아미 노태 질소함량의 규격은 160mg% 이상 이며32) 국내 산업체 생산 된장의 아미노태 질소함량은 보통 250-430 mg%으로 알려져 있다*). 본 연구에서 protease 생성 균주를 사용하여 제조한 된장의 경우, 숙성 초기인 15일에 이미 이 수치를 넘고 있어 빠른 숙성도를 보이고 있음을 알 수 있다. 반면 대조구의 경우, 숙성 초기인 15일째는 182 mg%의 아미노태 질소함량을 보여 공전 상의 규격은 넘었으나, 국내 산업체 생산 된장의 함량에는 숙성 90일이 되어서야 어느정도 도달하여 protease 생성 균주를 첨가한 된장보다 숙성도가 느린 것을 알 수 있다.
- 수분 함량은 숙성기간이 증가하면서 감소하는 경향을 보였으며, 시료별 수분 함량의 차이는 크지 않았다. 효소력 측정 결과, amylase 활성은 모든 시료에서 낮은 활성을 보였으며, 숙성이 진행되면서 계속적인 감소세를 보였다.
- 아미 노태 질소함량은 시료에 따라 차이를 보였으며, protease 생성 균주를 사용하여 제조한 된장의 경우 전반적으로 대조 구보다 높은 함량을 나타내었다. 숙성 초기인 15일째에 대조구는 182 mg%, 시험구는 341 mg%를 나타냈으며, 모든 시료가 숙성 일이 증가함에 따라 아미노태 질소함량도 함께 증가하는 경향을 나타내어, 숙성 90일에 이르러서는 대조구 및 시험구의 아미 노태 질소 함량은 각각 289 및 612 mg%를 보였다. 이런 결과는 팽화밀을 이용한 고추장 및 된장의 숙성중 이화학적 특성을 연구한 금 등20)의 결과와는 상반되었다.
- 숙성기간에 따른 protease 활성의 변화를 살펴보면, 된장의 숙성 초기인 15일째에는 각각 54.30, 75.39imit/g> 보였으며, 그 이후 숙성이 진행됨에 따라 점차적으로 증가하여 숙성 30일째에 최대치를 나타내어 각각 65.2, 105.6 unit/g 까지의 분포를 보였으나, 그 이후에는 계속 감소하는 경향을 나타내었다. 주등2。)은 각 시험구의 protease 활성도 측정결과 발효 40일까지는 증가하는 경향을 보였으나, 발효 60일에는 0.
- 암모니아태 질소함량은 대조구 보다는 시험구에서 높은 함량을 나타내었다. 숙성일별로 살펴보면 모든 된장에서 숙성 일이 경과함에 따라 암모니아태 질소함량도 증가하는 경향을 나타내 숙성 초기인 15일째에는 각각 22, 39 mg%의 함량에서 숙성 90일에는 79, 107 mg%까지 증가하였다. 숙성 45일째까지는 다소 급격히 증가하던 암모니아태 질소함량이 그 이후에는 완만한 증가를 보였다.
- 된장의 숙성기간에 따른 수분함량의 변화를 Table 1에 나타내었다. 시료별로 수분함량의 차이가 크게 나타나지 않았으며, 숙성 15일에서의 수분함량은 52.9-53.4%를 나타내었으나, 숙성 90일에는 48.6-49.8%를 나타내어 전반적으로 숙성기간이 경과함에 따라 수분함량은 다소 감소하는 경향을 보였다. 이는 된장 담금 직후 수분 함량은 평균 47.
- 2와 같다. 시료별로는 protease 생성 균주를 사용하여 제조한 된장의 경우, 대조구에 비해 월등히 높은 효소 활성을 나타내었다. 이는 메주 제조시 사용한 균주가 생성하는 protease 활성이 높기 때문에 나타난 결과이며, 대조구의 경우 시험구보다 낮기는 히지만 protease 활성이 나타난 것은 자연 상태에서 다양한 균주가 protease 생성에 관여했기 때문인것으로 생각된다.
- 일반적으로 모든 시료의 제품에서 amylase 활성은 매우 낮게 나타났다. 시료별로는 대조구가 숙성 15일에서 44.80 unit/g으로 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, protease 생성균주를 접종한 시료가 같은 기간에 42.22 unit/g으로 나타났다. 대조구와 시험구의 효소활성은 큰 차이를 보이지는 않았지만, 숙성기간에 따라 amylase 효소활성은 급격히 감소하는 경향을 보였다.
- 4와 같다. 아미 노태 질소함량은 시료에 따라 차이를 보였으며, protease 생성 균주를 사용하여 제조한 된장의 경우 전반적으로 대조 구보다 높은 함량을 나타내었다. 숙성 초기인 15일째에 대조구는 182 mg%, 시험구는 341 mg%를 나타냈으며, 모든 시료가 숙성 일이 증가함에 따라 아미노태 질소함량도 함께 증가하는 경향을 나타내어, 숙성 90일에 이르러서는 대조구 및 시험구의 아미 노태 질소 함량은 각각 289 및 612 mg%를 보였다.
- 환원당 함량은 숙성이 진행되면서 감소하였다. 아미노태 질소함량은 분리한 곰팡이를 사용하여 제조한 된장이 대조구보다 높았으며, 숙성이 진행되면서 계속적인 증가세를 보였다. 모든 시료의 에탄올 추출물에서 항산화력이 있음이 확인되었다.
- 5와 같다. 암모니아태 질소함량은 대조구 보다는 시험구에서 높은 함량을 나타내었다. 숙성일별로 살펴보면 모든 된장에서 숙성 일이 경과함에 따라 암모니아태 질소함량도 증가하는 경향을 나타내 숙성 초기인 15일째에는 각각 22, 39 mg%의 함량에서 숙성 90일에는 79, 107 mg%까지 증가하였다.
- 암모니아태 질소함량이 높은 시료와 숙성 기간에 따라 암모니아태 질소함량이 증가하는 것이 좋지 않은 결과로 해석할 수도 있으나, 된장 품질에 좋은 영향을 끼치는 아미노태 질소와 비교하였을 때, 그 함량이 월등히 낮을 뿐만 아니라, 식품 공전 상의 규격이 400mg% 이하인 것을 고려할 때, 본 연구에서 사용한 균주로 제조한 된장의 품질에 나쁜 영향을 미친다고는 볼 수 없다고 생각된다.
- 등20)은 Aspergillus sp.에 의한 콩된장 발효와 효소 활성을 측정하였는데 그 결과를 보면, 된장 숙성 20일째에서 시료별로 amylase 활성이 323.2-490.0unit/g의 분포를 나타내었으며, 숙성 100일에서는 83.6-445.2 unit/g를 나타내었다. 이들의 결과와 비교하였을 때 본 연구에서의 amylase 활성도는 매우 낮은 결과인데, 이는 시료 된장의 제조 방법에 따른 차이로 보인다.
- 이상의 실험 결과 숙성초기부터 30일 까지 protease 활성이 증가하다가 그 이후에 감소하는 것으로 나타났으나 이 이후 다시 활성이 증가한다고 보고한 주 등20)은 그 원인에 대해 계속 숙성되어 가면서 가용성 단백질이나 peptide가 아미노산으로 가수 분해되면서 protease 활성도가 증가한 것으로 사료된다고 밝혔는데, 본 연구에서는 그런 현상이 나타나지 않았다. 이는 된장의 효소활성은 사용한 미생물에 따라 큰 차이가 날 수 있어, 사용한 균주의 차이에 기인하는 것으로 생각된다.
- 대조구와 시험구의 효소활성은 큰 차이를 보이지는 않았지만, 숙성기간에 따라 amylase 효소활성은 급격히 감소하는 경향을 보였다. 즉, 숙성기간에 따른 효소 활성은 모든 시료 된장에서 숙성 초기인 15일째에서 가장 높았으며, 그 이후에 계속적인 감소를 보여, 숙성 90일에는 시료별로 각각 4.65, 8.64 unit/g의 매우 낮은 효소활성을 보였다. 이는 담금 초기 된장의 원료인 콩에 소량 함유되어 있는 전분이 amylase 의 기질이 되어 효소 활성이 높았다가 숙성일이 경과하면서 기질이 소모됨에 따라 그 활성이 계속적으로 떨어진 것으로 보인다.
- 된장의 ethanol 추출물의 DPPH 라디칼에 의한 전자공여작용을 측정한 결과를 Table 3 에 나타내었다. 표에서와 같이 시료에 따라 전자공여작용에 큰 차이를 보이지는 않았으며, 숙성일이 경가함에 따라 전자공여작용이 다소 감소하기는 했으나, 역시 숙성일별로도 거의 비슷한 정도의 전자공여작용을 보였다.
- 시료별 수분 함량의 차이는 크지 않았다. 효소력 측정 결과, amylase 활성은 모든 시료에서 낮은 활성을 보였으며, 숙성이 진행되면서 계속적인 감소세를 보였다. Protease 활성은 분리 곰팡이를 사용한 된장이 대조구보다 높았으며 숙성 30-45 일경에 최대치를 보이다가 그 이후 감소하는 경향을 나타내었다.
후속연구
- 된장의 경우도 원료 대두의 유지는 간장과 유사한 효소변화를 받아 glyceride 이외에 유리 고급지방산과 휘발 산 및 그의 ester, 불검화물로 되어 일부는 풍미에 영향을 미친다 23 꺼). 따라서 lipase 활성이 우수한 균주를 된장제조에 사용할 경우 맛과 함께 향미가 더욱 향상되어 된장 품질 향상에 기여할 것으로 생각된다.
- 반면 대조구의 경우, 숙성 초기인 15일째는 182 mg%의 아미노태 질소함량을 보여 공전 상의 규격은 넘었으나, 국내 산업체 생산 된장의 함량에는 숙성 90일이 되어서야 어느정도 도달하여 protease 생성 균주를 첨가한 된장보다 숙성도가 느린 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서와 같이 protease 활성이 높은 균주를 된장 제조에 이용할 경우, 더욱 빠른 숙성속도와 함께 된장 고유의 맛을 낼 수 있을 것으로 생각된다.
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