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문제 정의
- 임상적으로 만성신부전 치료에 효과가 있다고 보고한 바 있으나, 당뇨병성 신증에 대한 실험적 보고는 아직까지 없었다. 이에 저자는 streptozotocin(STZ)을 이용하여 흰쥐에 당뇨병성 신증을 유발시킨 후 蔘茂地黃湯을투여하여 蔘茂地黃湯이 당뇨병성 신증에 나타내는 영향을 알아보고자 혈청 creatinine, 혈청 BUN, 뇨중 albumin 배설량, 뇨중 glucose 함량, 신장 피질의 malondialdehyde(MDA) 와 glutathione(GSH) 등을 측정한 후 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 밝혀져 있으므로%).혈청 내 지질 과산화물의 생성을 억제할 수 있다면 질병의 예방과 치료에 효과적일 것이다. 그리하여 STZ 투여군의 신장 세포 손상정도와 SJT의 세포손상 방어효과를 측정하기 위하여 신장조직중의 과산화지질량을 MDA 량을 측정하여 알아보았다.
- 2. SJTR과 SJTRP 투여군은 혈청 중 BUN 함량에 대하여 영향을 미치지 못하였다.
제안 방법
- 정선하였으며 처방의 내용은 Table 1과 같다. 처방 중 熟地黃을 그대로 이용한 처방(SJTRP) 과 生地黃으로 대체한 처방(SJTR)을 이용하여 동일한 실험을 수행하였다.
- SJTRP와 SJTR의 원재료 2첩 분량인 128g에 증류수 2,000畝를 각각 가하고 대웅 약탕기(DWP- 1800T, 한국)로 2시간 동안 전탕한 후 여과하고 상층 액을 감압, 농축, 건조하여 추출물을 얻었다. 최후의 건조물은 각각 21.
- 실험은 정상군, 당뇨병성 신증을 유도한 대조군, 당뇨병성 신증 유도 후 검액인 SJTR과 SJTRP 를 투여한 두 가지의 실험군으로 나누어 시행하였다. 대조군과 실험군은 STZ 를 10mM citrate bufffer 에녹여 pH를 4.
- 시행하였다. 대조군과 실험군은 STZ 를 10mM citrate bufffer 에녹여 pH를 4.5에 맞추고, 60㎎/㎏ weight 되도록 각 동물에 복강 주사하였다. 동일한 날을 시작으로 SJTR과 SJTRP를 투여하였는데, 실험동물의 체중에 대해 100㎎/㎏ 농도로 10일간 투여하였으며, 대조군은 동량의 음용수를 투여하였다.
- 5에 맞추고, 60㎎/㎏ weight 되도록 각 동물에 복강 주사하였다. 동일한 날을 시작으로 SJTR과 SJTRP를 투여하였는데, 실험동물의 체중에 대해 100㎎/㎏ 농도로 10일간 투여하였으며, 대조군은 동량의 음용수를 투여하였다. 실험동물은 희생 전 16시간 동안은 물만 섭취토록 하고 절식시켰다.
- STZ 및 SJT 투여 시작 10일째에 흰쥐를 에테르로 가볍게 마취시키고 5i戒 용량의 일회용 주사기(삼우, 한국)로 혈액을 심장으로부터 3.0碱 이상 취하여 실온에 30분 방치한 후 냉장원심분리기 (VS6000CFN, Vision, 한국)로 ], 300xg로 20분간 원심 분리시켜 상층의 혈청을 얻었다. 혈청 중 creatinine 등의 함량은 각각의 측정용 kit(아산제약 주식회사, Korea)과 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
- 0碱 이상 취하여 실온에 30분 방치한 후 냉장원심분리기 (VS6000CFN, Vision, 한국)로 ], 300xg로 20분간 원심 분리시켜 상층의 혈청을 얻었다. 혈청 중 creatinine 등의 함량은 각각의 측정용 kit(아산제약 주식회사, Korea)과 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
- STZ 및 SJT 투여 9일째에 대사 케이지에서 24 시간 뇨를 수집하고 이로부터 albumin 배설량 및 glucose 함량을 각각의 측정용 kit(아산제약 주식회사, Korea)과 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
- 신장 피질의 지질의 과산화는 그 산물인 MDA 를 측정하여 평가하였다. MDA 함량은 Uchiyama 와 Mihara의 방법园으로 측정하였는데, 간단히 설명하면 혈액을 채취한 직후 신장을 들어내어 WOmM NaCl, 10mM KC1, 1.
- 측정하여 평가하였다. MDA 함량은 Uchiyama 와 Mihara의 방법园으로 측정하였는데, 간단히 설명하면 혈액을 채취한 직후 신장을 들어내어 WOmM NaCl, 10mM KC1, 1.5mM CaCl2, 40mM Tris- HCl(pH, 7.5)로 된 차가운 용액을 신장 동맥 내에 주입하여 혈액을 제거한 다음 Stadie-Riggs microtome 으로 약 0.3~0.5 mm 두께의 신장 피질 절편을 만든 다음 절편을 차가운 1.15% KC1 용액 (5% wt/vol) 속에서 파쇄하였다. 이 조직 파쇄 균질액 0.
- 6% thiobarbituric acid 용액 1砒을 첨가하여 끓는 물에서 45분간 가열하였다. n-butanol 4祝을 첨가하여 완전히 섞은 다음 2, 000xg에서 20분간 원심분리한 후, 상층액의 흡광도를 536와 520nm에서 측정하였다. MDA 값은 단백질 Img 당 pmoles로 표시 하였다.
- 측정하였다. 0.248mg/m£ NADPH(143 mM sodium phosphate, 6.3 mM Na4-EDTA(pH. 7.5)를 함유하고 있는) 용액 700鴻 6mM 5, 5'-dithiobis-2- nitrobenzoic acid(DTNB) 용액 1(凡以와 증류수 198以를 cuvette 에 넣어 30oC에서 15분간 데운 후 시료 2以를 넣고 섞은 다음 266U/m£ GSSG reductase 10必를 첨가하여 412nm에서 흡광도의 변화를 관찰하였고 단위는 /zg/mg protein으로 나타내었다.
- 이에 저 자는 糖尿病性 腎症의 발병원 인이 고혈당이며, 발병초기에 혈당조절을 엄격하게 하면 신기능이 정상으로 돌아올 수 있다는 이론과 糖尿病 性 腎症이 만성적으로 이환된 질병이며 만성적으로 진행하였을 경우 신부전이 발생한다는 사실에 근거하여, 본 실험에 사용될 약물을 蔘民地黃湯으로 선택하였다.
- 혈액 . 생화학적 검사를 통하여 신장 기능의 이상과 신장조직의 손상 유무를 알아보기 위하여 신장 기능을 나타내는 대표적인 혈액인자인 BUN 치와 혈중 creatinine, 24시간 뇨중 albumin 배설량, 뇨중 이ucose와 세포막의 지질이 과산화되어 신장조직의 손상이 일어남을 나타내는 산물인 MDA 와 환원성 Glutathione인 GSH를 측정하여 보았다. BUNe 혈중요소질소로 BUN중의 urea는 단백과 아미노산의 주요 최종산물로서 간의 urea cycle에 의해 생성되어 신장으로 배출되기 때문에 신장기능의 이상시 BUT"] 증가되어 나타난다.
- 당뇨병성 신증이 진행되면 단백뇨와 저albumin 혈증이 나타나게 되므로 뇨중 albumin 배설량을 관찰하였다. 정상군에 비하여 대조군에서는 유의한 증가를 보였으나 실험군인 SJTR과 SJTRP 투여군 모두 유의한 변화를 나타내지 않았다(Fig.
- 혈청 내 지질 과산화물의 생성을 억제할 수 있다면 질병의 예방과 치료에 효과적일 것이다. 그리하여 STZ 투여군의 신장 세포 손상정도와 SJT의 세포손상 방어효과를 측정하기 위하여 신장조직중의 과산화지질량을 MDA 량을 측정하여 알아보았다. 본 실험에서 SJTR 투여군은 대조군에 비해 STZ에 의해 증가되는 신장 피질 조직 내 과산화 지질을 유의성 있게 억제하였으나 SJTRP 투여군은 유의성 있는 변화를 보이지 않았는데, 이는 SJTR 투여군이 혈청 내 지질과산화물의 생성을 억제하여 신장의 독성을 방어하고 있는 것으로 사료된다.
- 흰쥐에 Streptozotocin을 이용하여 당뇨병성 신증을 유발 시킨 후 蔘萬地黃湯이 당뇨병성 신증에나타내는 효능을 알아보고자 혈청 creatinine, 혈청 BUN, 뇨중 albumin 배설량, 뇨중 glucose 함량측정, 신장피질의 MDA와 GSH 등을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 동물은 체중 200g 정도의 Sprague-Dawley계수컷 흰쥐(대한실험동물센터, Korea)를 사용하였으며, 2주 이상 실험실 환경에 적응시키는 동안 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 삼양유지사료, Korea)와 물을 충분히 공급하면서, 2주 이상 실험실 환경(온도, 22±2℃; 밤候, 12hrs)에 적응시킨 후 사용하였다.
- 실험약물은 蔘茂地黃湯을 재료로 하였고 이를 구성하는 약재는 동신대학교 목포한방병원에서구입 . 정선하였으며 처방의 내용은 Table 1과 같다.
- 혈청 중 creatinine 및 BUNe 시중에서 국산측정용 kit(아산제약, 한국)을 구입하여 사용하였다. 기타 시약은 Sigma(St.
- Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다. 측정을 위해 사용된 기기는 분광광도계(U-2800, Hitachi, Japan), 분쇄기(DIAX 600, Heidolph, Germany), 원심분리기(VS-15000CFN, Vision, 한국), 동결건조기 (E20, Eyela, Japan), 전자저울(AR2140, OHAUS, USA) 등이었다.
데이터처리
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SAS(The SAS System for Windows, ver. 6.12, SAS Institute, USA.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균士표준오차(mean土S.
이론/모형
- MDA 값은 단백질 Img 당 pmoles로 표시 하였다. 단백질 농도는 Bradford의 방법〃으로 측정하였다.
- GSH 함량은 Anderson의 방법으로 측정하였다. 0.
성능/효과
- 얻었다. 최후의 건조물은 각각 21.0g 및 13.9g으로 熟地黃 을 구성 약물로 했을 때의 추출률이 더 높은 것으로 나타났다. SJTRP 와 SJTR을 사용치 않을 때는 냉동 보관해 두었다가 실험 직전에 필요한 농도에 맞춰 희석하여 신선하게 사용하였다.
- 있게 증가하였다. SJTR을 경구 투여한 결과 혈청 creatinine 수치가 유의성 있게 감소하였으며, SJTRP를 투여한 경우에는 감소의 경향은 나타났으나 유의성은 없었다(Fig. 1).
- 24시간 뇨중 albumin 배설량은 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있게 증가하여 당뇨병성 신증의 전형적인 검사 소견이 나타났다. 그러나 SJT 를 투여한 실험군은 대조군에 비해 차이가 나타나지 않았다(Fig.
- 이러한 creatine의 최종대사산물이 creatinine이며 creatininee 신장의 사구체를 통하여만 배설되기 때문에 BU爪에 비하여 신질환에 더욱 특이적이고 예민하게 나타난다. 실험에서 흰쥐에 STZ를 투여하였을 때, 정상군에 비해 대조군에서 혈청 중 creatinine 및 BUN 수치가 유의하게 증가하여(Fig. 1, 2), STZ에 의해 신증이 유발되었음을 확인하였다. SJTR 투여군은 혈청 creatinine 수치가 유의하게 감소하였으나 BUN 수치에는 유의성 있는 변화를 보이지 않았으며, SJTRP 투여군은 위의 두 측정 항목에 대조군와의 차이를 보이지 않았다.
- 1, 2), STZ에 의해 신증이 유발되었음을 확인하였다. SJTR 투여군은 혈청 creatinine 수치가 유의하게 감소하였으나 BUN 수치에는 유의성 있는 변화를 보이지 않았으며, SJTRP 투여군은 위의 두 측정 항목에 대조군와의 차이를 보이지 않았다. 그러므로 신사구체 손상회복에 SJTR 투여가 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 정상군에 비하여 대조군에서는 유의한 증가를 보였으나 실험군인 SJTR과 SJTRP 투여군 모두 유의한 변화를 나타내지 않았다(Fig. 3). 당뇨의 상태를 알기위해 뇨중 glucose 함량 변화를 관찰한 결과 대조군에 비하여 SJTR 투여군이 효과적으로 억제하였고, SJTRP 투여군에서는 유의한 변화를 보이지 않았다.
- 3). 당뇨의 상태를 알기위해 뇨중 glucose 함량 변화를 관찰한 결과 대조군에 비하여 SJTR 투여군이 효과적으로 억제하였고, SJTRP 투여군에서는 유의한 변화를 보이지 않았다.(Fig.
- 그리하여 STZ 투여군의 신장 세포 손상정도와 SJT의 세포손상 방어효과를 측정하기 위하여 신장조직중의 과산화지질량을 MDA 량을 측정하여 알아보았다. 본 실험에서 SJTR 투여군은 대조군에 비해 STZ에 의해 증가되는 신장 피질 조직 내 과산화 지질을 유의성 있게 억제하였으나 SJTRP 투여군은 유의성 있는 변화를 보이지 않았는데, 이는 SJTR 투여군이 혈청 내 지질과산화물의 생성을 억제하여 신장의 독성을 방어하고 있는 것으로 사료된다.
- 5, 6).啊 이상의 실험결과를 요약하여 보면, 대조군에서는 혈청 BUN, 혈청 Creatinine, 뇨중 albumin과 glucose, 신장조직의 M2A량 및 신장 피질 내 GSH 함량 등이 유의성 있게 변화 하였으며, SJTR 투여군이 대조군에 비하여 혈청 creatinine을 유의성 있게 감소시키고, 신장조직의 MDA량을 유의성 있게 감소시켜 SJTR 투여군이 사구체 여과 기능과 세뇨관 재흡수 기능의 회복을 통한 혈액과 뇨의생화학적 인자의 개선에 유효할 것으로 사료된다. 아울러 SJTR투여군이 뇨중 glucose를 감소시키는 것으로 보아 혈당 강하에도 작용하는 것으로 사료된다.
- 1. SJTR 투여군은 혈청 중 creatinine의 함량에 대해 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었고 SJTRP 투여군은 유의성이 없었다.
- 3. SJTR과 SJTRP 투여군은 24시간 뇨중 albumin 배설 증가를 억제하지 못하였다.
- 4. SJTR 투여군은 뇨중 glucose함량에서 대조군에 비해 유의하게 감소시켰으나, SJTRP 투여군은 유의성이 없었다.
- 6. SJTR과 SJTRP 투여군은 GSH함량 변화에 있어서 유의성 있는 변화를 보이지 않았다.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 SJTR투여군은 혈당 강하효과와 당뇨병성 신증에서의 세포손상 억제 효과를 보여 신장손상을 회복시키는 기능이 있을 것으로 사료되며, 蔘茂地黃湯을 당뇨병성 신증에 활용할 경우 熟地黃보다 生地黃을 활용하는 것이 더욱 좋은 결과를 나타낼 수 있을 것으로 생각되어지나, 이와 관련된 명확한 작용 기전은 아직 확인할 수 없다. 약재의 가공에 따른 성분의 변화 및 처방에 배합되어 있는 약재들 상호작용으로 인한 생체 내 항산화 효소의 활성변화에 대한 추후 연구가 필요할 것이다.
- 없다. 약재의 가공에 따른 성분의 변화 및 처방에 배합되어 있는 약재들 상호작용으로 인한 생체 내 항산화 효소의 활성변화에 대한 추후 연구가 필요할 것이다.
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