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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 건조된 5 종류의 벼 품종의 낟알을 사용하여 'H NMR 스펙트럼 조사에 의한 신속한 벼 품종 구분이 가능한 지 여부와 아울러 'H NMR 스펙트럼데이터로부터 주요 당 화합물의 상대적인 정량분석이 가능한 지 여부를 조사함으로써 벼의 신속한 품종구분 체계로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- *H NMR 분석을 위해 각각의 벼 품종별로 마쇄된 낟알 가루를 각각 15 mg을 취하여Eppendorf tube (1.5 ml)로 옮긴 다음 Q 005% (w/v) TSP-d4:sodium salt of trimethylsilylpropionic acid 첨가된 1 ml의 deuterated solvent mixture (v/v, D2O: CD3OD, 80:20)를 첨가하여 잘 혼합하였다. Eppendorf tube를 50°C 수조에 넣고 H)분간 반응시킨 후 whole cell extract를 13, 000 rpm에서 5분간 상온에서 원심분리한 다음 상층액 750 ul를 5 mm NMR tube로 옮겨 각각 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다.
- *H NMR 스펙트럼으로부터 주요 당 성분 (fiuctose, glucose, sucrose, maltose) 및 아미노산 (threonine, alanine, glutamine, glutamate, asparagines, phenylalanine)들의 peak assignment# 위하여 각각의 순수화합물의 농도를 deuterated solvent mixture (DzOCD’OD, 80:20)를 이용하예 mg/ml로 조정한 다음 상기의 *H NMR 스펙트럼조사와 동일한 조건으로 각각 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다. 벼 낟알 시료의 ‘H NMR 스펙트럼상에 존재하는 proton signal과 순수 화합물의 chemical shift를 상호 비교하여 각각의 화합물의 존재를 확인하였다.
- Eppendorf tube를 50°C 수조에 넣고 H)분간 반응시킨 후 whole cell extract를 13, 000 rpm에서 5분간 상온에서 원심분리한 다음 상층액 750 ul를 5 mm NMR tube로 옮겨 각각 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 Varian Unity 500 NMR spec- trometer를 사용하여 조사하였으며 수분 peak는 presaturation pulse를 통해 제거하였다. 각 스펙트럼은 60회 반복 측정하여 평균 스펙트럼을 확보하였으며 시료에 첨가된 TSP-d4를 이용하여 'h NMR chemical shifts를 0.
- 5 ml)로 옮긴 다음 Q 005% (w/v) TSP-d4:sodium salt of trimethylsilylpropionic acid 첨가된 1 ml의 deuterated solvent mixture (v/v, D2O: CD3OD, 80:20)를 첨가하여 잘 혼합하였다. Eppendorf tube를 50°C 수조에 넣고 H)분간 반응시킨 후 whole cell extract를 13, 000 rpm에서 5분간 상온에서 원심분리한 다음 상층액 750 ul를 5 mm NMR tube로 옮겨 각각 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 Varian Unity 500 NMR spec- trometer를 사용하여 조사하였으며 수분 peak는 presaturation pulse를 통해 제거하였다.
- 각 벼 품종의 'H NMR 스펙트럼 에 나타나는 주요 당 성분(fructose, glucose, sucrose, maltose) 및 아미노산 (threonine, alanine, glutamine, glutamate, asparagines, phenylalanine)들의 peak assignment를 위해 순수 화합물의chemical shifts를 비교분석하였다. 그 결과 aliphatic region에서 glutamate (2.
- 각 벼 품종의 'h NMR 스펙트럼에 나타나는 주요 당 화합 물 (fructose, glucose, sucrose, maltose) 및 아미노산들의 정량분석을 위해 각 순수 화합물의 선형회귀분석을 실시하였다.Sucrose (Fig.
- 1H-NMR 스펙트럼은 Varian Unity 500 NMR spec- trometer를 사용하여 조사하였으며 수분 peak는 presaturation pulse를 통해 제거하였다. 각 스펙트럼은 60회 반복 측정하여 평균 스펙트럼을 확보하였으며 시료에 첨가된 TSP-d4를 이용하여 'h NMR chemical shifts를 0.00 ppm으로 조정하였다.
- 각 품종별로 3개의 반복시료를 준비하였으며 마쇄된 가루는Eppendorf tube (1.5 ml)로 옮긴 다음 -70 °C 초저온 냉동고에 보관한 다음 1H-NMR 분석을 위해 사용하였다
- 각각의 벼 품종으로부터 얻어진 'H NMR 스펙트럼은ADVASP Lite (short version of ADVASP package, UmatekInc.)를 이용하여 ASCII 파일로 전환하였으며 각 스펙트럼의 세기는 internal standard로 첨가한 TSP/4의 peak 세기를 기준으로 각 시료의 peak scale을 조정하였다. 각각의 NMR 스펙트럼의 data 간격은 12.
- 건조된 5 종류의 벼 품종 (상주 화만 심백, 심백 hetro, 동진벼, 포항공대 안진흥 교수 제공)으로부터 각 품종별로 종자 5 개를 무작위로 선발하여 막자 사발에 넣고 마쇄하였다. 각 품종별로 3개의 반복시료를 준비하였으며 마쇄된 가루는Eppendorf tube (1.
- 건조된 벼 5 품종의 whole cell extracts로부터 *H NMR 스펙트럼 조사를 통해 다변량 통계분석법을 활용하여 벼 종자의 품종 구분이 가능함을 조사하였다. 'H NMR 스펙트럼 데이터에 기초한 PCA 분석 결과 크게 3개의 그룹으로 구분이 이루어졌다.
- 5) 에도입한 다음 NIPALS algorithm (W이d 1966)에 따라 PCA (principal component analysis) 및 PCR (principal componentregression) 분석을 수행하였다. 또한 NMR 스펙트럼데이터는각각 total metabolites (0~12 ppm), carbohydrates (3-6 ppm), aliphatics (1-3 ppm), 그리고 aromatics (6-9 ppm) region으로구분하여 각각 PCA 분석을 수행하였다.
- NMR 스펙트럼을 조사하였다. 벼 낟알 시료의 ‘H NMR 스펙트럼상에 존재하는 proton signal과 순수 화합물의 chemical shift를 상호 비교하여 각각의 화합물의 존재를 확인하였다. 벼 시료에서 에서 주요 당 성분 및 아미노산의 상대적인 정량분석을 위해 먼저 deuterated solvent mixture로 각 순수 화합물의 농도를 각각 0, 0.
- 벼 낟알 시료의 ‘H NMR 스펙트럼상에 존재하는 proton signal과 순수 화합물의 chemical shift를 상호 비교하여 각각의 화합물의 존재를 확인하였다. 벼 시료에서 에서 주요 당 성분 및 아미노산의 상대적인 정량분석을 위해 먼저 deuterated solvent mixture로 각 순수 화합물의 농도를 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 5 mg/ml로 조정하여 각각의 NMR 스펙트럼 데이터를 확보하였다. 각 순수 화합물의 'H NMR 스펙트럼데이터로부터 주요 peaks의chemical shifts 범위를 결정한 다음 chemical shifts 범위내의 proton signal area를 적분하였다 각 순수 화합물의 농도별 적분 값과 실제 농도 사이의 선형회귀분석은 상용 프로그램인 Origin (version 6.
대상 데이터
- Each metabolite was quantified by integration of peak area using reference chemicals subjected to lH NMR spectro scopy. Each treatment consisted of three replicates. Vertical bars represent SD.
- 본 논문은 농촌진흥청 바이오그린21 사업, 과학기 술부의 21세기 프론티어 프로그램 작물유전체기 능 연구사업단, 과학재단 SRC의 경희대 식물대사연구센터, 한국생명공학연구원 기관고유사업의 연구비 지원으로 이루어졌다
데이터처리
- 5, 1, 5 mg/ml로 조정하여 각각의 NMR 스펙트럼 데이터를 확보하였다. 각 순수 화합물의 'H NMR 스펙트럼데이터로부터 주요 peaks의chemical shifts 범위를 결정한 다음 chemical shifts 범위내의 proton signal area를 적분하였다 각 순수 화합물의 농도별 적분 값과 실제 농도 사이의 선형회귀분석은 상용 프로그램인 Origin (version 6.0)를 사용하여 수행하였다 각각의 순수 화합물의 농도 예측 회귀모델을 이용하여 벼 시료에서 각 화합물의 상대적인 함량을 비교 분석하였다.
이론/모형
- 0 to 0 ppm으로 조정하였다. 이와 같이 가공된 'H NMR 스펙트럼 데이터는 Matlab (version 6.5) 에도입한 다음 NIPALS algorithm (W이d 1966)에 따라 PCA (principal component analysis) 및 PCR (principal componentregression) 분석을 수행하였다. 또한 NMR 스펙트럼데이터는각각 total metabolites (0~12 ppm), carbohydrates (3-6 ppm), aliphatics (1-3 ppm), 그리고 aromatics (6-9 ppm) region으로구분하여 각각 PCA 분석을 수행하였다.
성능/효과
- 5개의 벼 품종 'H NMR 스펙트럼 데이터의 total region으로부터 PCA 분석을 수행한 결과 벼 품종은 크게 3개의 그룹으로 구분이 이루어졌다 (Fig. 2). PCA plot상에서 분석에 사용된 각 품종 별 3개의 반복구가 심백벼를 제외하고는 일정한 영역을 차지하며 분포가 이루어지는 것으로 보아 PCA 분석 결과는 재현성있게 이루어진 것으로 판단되었다.
- 4C)의 회귀분석 결과 농도별 실측값과 각 화합물의peak area 적분 값 사이에는 매우 높은 상관관계를 보여 각 화합물의 정량분석이 가능하였다. PCA plot (Fig. 2)상에서 5개 벼 품종 중에서 상대적으로 다른 그룹을 형성하였던 상주벼의 경우 다른 벼 품종에 비해 sucrose 및 glucose 함량은 큰 차이가 없었으나 maltose 함량이 타 품종에 비해 약 2-4 배 높음을 알 수 있었다 (Fig. 6). 상주벼가 타품종에 비해 maltose 함량이 많은지 여부는 더 많은 품종들을 대상으로 대사산물 분석이 이루어진다면 보다 확실한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
- 2). PCA plot상에서 분석에 사용된 각 품종 별 3개의 반복구가 심백벼를 제외하고는 일정한 영역을 차지하며 분포가 이루어지는 것으로 보아 PCA 분석 결과는 재현성있게 이루어진 것으로 판단되었다. 'H NMR 스펙트럼데이터의 carbohydrate region 으로부터 PCA 분석을 수행한 결과는 total region의 결과와 유사한 패턴을 보였다.
- PCA 분석을 통한 벼 품종 구분에 중요한 역할을 하는 화합물의 종류를 조사하기 위하여 score loading plot를 조사한 결과 'H NMR 스펙트럼상에서 주요 화합물로 확인된 sucr ose, glucose, maltose 등이 PCA 분석에서 중요한 역할을 차지하고 있는 화합물임을 알 수 있었다 (Fig. 3). 이 결과는 벼의 품질 구분에서 당 화합물들이 중요한 역할을 하고 있는 사실에 비추어 볼 때 매우 흥미로운 결과라 사료된다.
- (fructose, glucose, sucrose, maltose) 및 아미노산들의 정량분석을 위해 각 순수 화합물의 선형회귀분석을 실시하였다.Sucrose (Fig. 4A), glucose (Fig. 4B), 그리고 maltose (Fig. 4C)의 회귀분석 결과 농도별 실측값과 각 화합물의peak area 적분 값 사이에는 매우 높은 상관관계를 보여 각 화합물의 정량분석이 가능하였다. PCA plot (Fig.
- 1). 각 벼 품종의 grain으로부터얻어진 NMR 스펙트럼을 보면carbohydrate region (3-6 ppm) 에서는 sucrose, glucose, maltose 그리고 aliphatic region(l-3 ppm)에서는 glutamate 가 주요peak로 관찰되었으며 양적인 변화가 이루어짐을 알 수 있었다 (Fig. 1). 그러나 'H NMR 스펙트럼 의 aromatic region (6-9 ppm)에서는 주요 peak들이 관찰되지 않았다 (Fig.
- 그 결과 aliphatic region에서 glutamate (2.05, 2.35 ppm) 그리고 carbohydrates region에서如ctose (4.05 ppm), a -glucose (5.15 ppm), 3-glucose (4.53 ppm), maltose (5.38 ppm) 그리고 sucrose (5.39 ppm)의 peak를 확인하였다 (Fig. 1). 각 벼 품종의 grain으로부터얻어진 NMR 스펙트럼을 보면carbohydrate region (3-6 ppm) 에서는 sucrose, glucose, maltose 그리고 aliphatic region(l-3 ppm)에서는 glutamate 가 주요peak로 관찰되었으며 양적인 변화가 이루어짐을 알 수 있었다 (Fig.
- 스펙트럼 영역에 있어서는 carbohydrate region이 품종에 따라 크게 달라지는 것으로 보아 탄수화물의 정량정성적 차이가 metabolic profiling에 의한 품종 구분에 중요한 역할을 하는 것으로 추론된다. 또한 'H NMR 스펙트럼 데이터에 기초하여주요 당 화합물 (sucrose, glucose, maltose 등)의 상대적인 정량분석을 조사한 결과 상주벼의 경우 다른 벼 품종에 비해 sucrose 및 glucose 함량은 큰 차이가 없었으나 maltose 함량이 타 품종에 비해 약 2-4배 높음을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서 확립한 벼 종자의 whole cell extracts로부터 'H NMR 스펙트럼을 이용한 metabolic profiling 방법은 다양한 벼 종자의 신속한 품종구분은 물론 주요 carbohydrates 의 간편한 정량분석 체계로 활용이 가능할 것으로 예상된다.
- 즉, 상주벼가 나머지 4 품종의 벼와 크게 다르게 구분이 이루어졌으며 동진벼와 심백벼, 그리고 화만벼와 심백hetero 품종이 각각 하나의 소그룹으로 구분이 이루어졌다. 스펙트럼 영역에 있어서는 carbohydrate region이 품종에 따라 크게 달라지는 것으로 보아 탄수화물의 정량정성적 차이가 metabolic profiling에 의한 품종 구분에 중요한 역할을 하는 것으로 추론된다. 또한 'H NMR 스펙트럼 데이터에 기초하여주요 당 화합물 (sucrose, glucose, maltose 등)의 상대적인 정량분석을 조사한 결과 상주벼의 경우 다른 벼 품종에 비해 sucrose 및 glucose 함량은 큰 차이가 없었으나 maltose 함량이 타 품종에 비해 약 2-4배 높음을 알 수 있었다.
- 1). 이 결과는 벼 낟알내의 대사산물은 carbohydrate 성분이 주요 성분이며 그리고 소량의 aliphatic 아미노산 성분들이 존재하며 aromatic 아미노산 성분들은 상대적으로 거의 존재하지 않음을 의미하는 것으로 벼 낟알내의 모든 대사산물에 대한 분석이 이루어져 상호 비교가 이루어진다면 매우 흥미로울 것으로 사료된다.
후속연구
- 1998) 등 다양한 유전자 지문분석 방법이 개발되어 활용되고 있다 따라서 대사산물의 지문분석법과 유전자 지문분석법 에 의한 벼 품종의 유연관계 결과와 상호비교는 매우 흥미로울 것으로 사료된다. 그러나 본 연구 결과에서는 제한된 소수의 품종시료만을 대상으로 대사산물 지문분석이 이루어져 벼 품종의 계통분류학적 유연관계 규명은 이루어지지 않았다.
- 또한 'H NMR 스펙트럼 데이터에 기초하여주요 당 화합물 (sucrose, glucose, maltose 등)의 상대적인 정량분석을 조사한 결과 상주벼의 경우 다른 벼 품종에 비해 sucrose 및 glucose 함량은 큰 차이가 없었으나 maltose 함량이 타 품종에 비해 약 2-4배 높음을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서 확립한 벼 종자의 whole cell extracts로부터 'H NMR 스펙트럼을 이용한 metabolic profiling 방법은 다양한 벼 종자의 신속한 품종구분은 물론 주요 carbohydrates 의 간편한 정량분석 체계로 활용이 가능할 것으로 예상된다.
- 따라서 본 연구에서 확립한 벼 종자의 whole cell extracts로부터 *H NMR 스펙트럼을 이용한 metabolic profiling 방법을기반으로 더 많은 품종을 대상으로 표본 분석 데이터가 구축되어 활용이 이루어진다면 벼 품종구분에 사용될 수 있는 대사산물 수준에서 마커 탐색이 가능할 것으로 사료된다. 아울러 다양한 carbohydrates 및 alphatic 아미노산 성분들의 품종 간 비교를 위한 간편한 정량분석 체계로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 6). 상주벼가 타품종에 비해 maltose 함량이 많은지 여부는 더 많은 품종들을 대상으로 대사산물 분석이 이루어진다면 보다 확실한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
- 아울러 다양한 carbohydrates 및 alphatic 아미노산 성분들의 품종 간 비교를 위한 간편한 정량분석 체계로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 이 결과는 벼의 품질 구분에서 당 화합물들이 중요한 역할을 하고 있는 사실에 비추어 볼 때 매우 흥미로운 결과라 사료된다. 즉 벼의 품종 구분에 유전학적 마커는 물론 대사산물 마커 역시 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
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