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문제 정의
- 지금까지의 metabolomics 연구들은 대부분이 인체대사물질 변화에 관한 연구와 식물의 표현형 차이에 대한 연구들로 국한되어 있고 어류에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구는 1H-NMR spectroscopy와 다변량통계분석을 통해 넙치의 대사 물질 변화를 분석하기 위해 고안되었다.
- , 2009). 본 연구는 넙치의 백신 접종에 따른 대사물질의 변화를 분석하기 위한 실험으로 백신 접종 전 후의 대사물질을 비교 분석하고 백신에 반응하는 물질(vaccine-response substance; VRS)을 분석하여 indicator로서 선정하고자 하는 것이 그 목적이다. 대사물질의 변화분석을 위해서는 수소 핵자기공명분석(1H-nuclear magnetic resonance: 1H-NMR)과 주성분분석(principal components analysis: PCA) 및 부분 최소제곱 분석(partial least square: PLS)을 실시하였다.
제안 방법
- 13C-NMR을 통해 14.0과 14.1 ppm 사이에서 3개의 지방산 methyl carbon (C-18, 18´18´´), 22.8-29.1 ppm 사이의 9개의 methylene carbon (C-(3´,4´,17´)×2, C-3´´, 4´´, 17´´), 29.4-30 ppm 사이의 18개의 methylene carbon (C-(5´, 6´,7´,12´-15´´)×2, C-5´´, 6´´,7´´,12´´-15´´), 31.9- 33.9 ppm 사이의 12개의 methylene carbon (C-(2´,8´, 10´,11´)×2, C-2´´,8´´,10´´,11´´)을 확인하였고, 130.5 ppm에 6개의 methine carbon (C-(9´, 10´)×2, C-9´´, 10´´)을 확인하였다.
- 1H-NMR spectra의 측정은 Jeol JNM ECP 500 NMR spectrometer를 사용하여 500 MHz에서 측정하였다. NMR분석은 nt 32, 63, 128 scan 으로 실시하여 최적의 분석조건을 확인하였으며 온도에 따른 peak pattern의 변화를 알아보기 위하여 128 scan을 기준으로 하여 온도 20℃, 25℃, 30℃로 설정하여 실행하였으며 splitting이 가장 많은 3.
- 1H-NMR 분석과 다변량통계분석을 통해 백신을 첨가한 경우와 그렇지 않은 경우에 지질함량이 차이가 나는 것을 확인하였고 혈청으로부터 VRS 성분을 분리하기 위해 우선 hexane을 이용하여 지질층(total lipid)을 분리하였다. Hexane 추출층에 메탄올을 첨가하여 극성성분을 완전히 제거하였고, 비극성 층을 TLC(thin layer chromatography)를 이용하여 전개용매 hexane/ether (6:1)로 분리하였다.
- 1H-NMR 분석과 다변량통계분석을 통해 백신처리를 통한 넙치의 혈청성분 중 지질성분의 함량에 차이가 나는 것을 확인할 수 있었고 TLC를 통해 대조군과 구별되는 band를 분리하여 구조분석을 실시하였다. 물질은 FAB-MS 분석결과 분자량이 885.
- 두 실험구의 NMR spectra는 methine 부분은 유사한 형태로 나타나고 있으며 methylene 부분의 peak 값의 변화를 확인할 수 있다. 1H-NMR을 통하여 얻은 metabolite profiling 의 다변량분석을 위해 PCA와 PLS-DA분석을 실시하였다. PCA분석의 loading plot과 scores plot을 나타냈으며 sample 1-5는 대조구의 sample이며 sample 6-10은 실험구(백신접종후 얻은 혈청)의 sample로 나타내었다.
- E. tarda를 1% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion broth(BHIB)에 접종하여 25℃에서 24시간 동안 배양하였으며 세균 배양액에 포르말린(37% formaldehyde)을 최종적으로 0.3%농도가 되도록 처리하여 실온에서 1시간 정치한 후 4℃에서 24시간 동안 두어 불활화 시켰다. 불활화된 세균 배양액은 6,520 rcf에서 20분 동안 원심분리하여 수확하였고 0.
- 5 s의 relaxation delay로 실시하였다. NMR spectra는 0-12 ppm까지 scan 하였고 X-WINNMR (version 2.1, Bruker Gmbh, Germany)을 이용하여 calibration을 실시하였다.
- 1H-NMR spectra의 측정은 Jeol JNM ECP 500 NMR spectrometer를 사용하여 500 MHz에서 측정하였다. NMR분석은 nt 32, 63, 128 scan 으로 실시하여 최적의 분석조건을 확인하였으며 온도에 따른 peak pattern의 변화를 알아보기 위하여 128 scan을 기준으로 하여 온도 20℃, 25℃, 30℃로 설정하여 실행하였으며 splitting이 가장 많은 3.5-4.0 ppm 영역의 peak들을 비교하였다. 모든 실험은 5반 복구로 실행하였다.
- 2003). PLS는 작은 변이를 설명하는 변수를 제외시킴으로써 차원축소를 통해 안정적인 결과를 얻을 수 있는 방법으로 PLS분석을 통하여 score plot에서 clusting을 확인하고 loading plot에서 indicator로 추측되는 인자를 탐색하며 VIP value를 이용하여 인자의 중요도를 확인하였다. PCA와 PLS-DA 분석에서 component는 7로 설정하였으며 non-linear iterative partial square algorithm(NIPALS)으로 실행하였다.
- Pulse sequence는 RD-90°-t1-90°-tm90°-FID로 하였으며 1.5 s의 relaxation delay로 실시하였다.
- 각각의 혈청으로부터 얻어진 1H-NMR 스펙트럼은 peak의 chemical shift와 split pattern 그리고 integral 값을 이용하여 정리하였고 data 간격은 0 ppm부터 12 ppm으로 조정하였다. 1H-NMR 스펙트럼 데이터는 Matlab (version 6.
- 넙치 혈청성분의 변화를 분석하고 health indicator를 찾기 위해 E. tarda 불활화 백신을 넙치의 복강 내 주사하였다. 백신접종 14일 후 혈청을 분리하여 응집가 반응을 통해 불활화 백신에 대한 항체가 형성되었음(210 antibody titer) 을 확인하였고 1H-NMR 분석에 사용하였다.
- Hexane 추출층에 메탄올을 첨가하여 극성성분을 완전히 제거하였고, 비극성 층을 TLC(thin layer chromatography)를 이용하여 전개용매 hexane/ether (6:1)로 분리하였다. 대조군에 비해 함량에 차이를 보이는 band (Rf 0.7)를 1H-NMR과 13C-NMR, FAB-MS를 이용하여 구조분석을 실시하였다.
- 0 ppm 영역의 peak들을 비교하였다. 모든 실험은 5반 복구로 실행하였다. Pulse sequence는 RD-90°-t1-90°-tm90°-FID로 하였으며 1.
- 1 mL를 주사하였다. 백신 효능검증의 어체 크기는 직경 15 cm, 무게 50 g으로 주사가 가능한 가장 작은 크기의 어체로 선택하여 실험을 진행하였으며 백신의 농도는 10 mg/kg bodyweight로 실험을 진행하였다. 응집가반응(Kim et al.
- tarda 불활화 백신을 넙치의 복강 내 주사하였다. 백신접종 14일 후 혈청을 분리하여 응집가 반응을 통해 불활화 백신에 대한 항체가 형성되었음(210 antibody titer) 을 확인하였고 1H-NMR 분석에 사용하였다. 온도에 따른 1H-NMR peak의 pattern을 확인하기 위해 온도조건을 20, 25, 30℃로 설정하여 splitting이 가장 많은 3.
- 실험어는 양식장(극동수산, 경북 포항)에서 생산된 넙치(평균 50±7 g)를 사용하였고 200리터 원형수조에 동일한 사육밀도로 30마리씩 수용을 하였다. 사료는 배합사료(조단백질 52% 이상)를 사용하였으며 사료공급량은 어체중의 0.1-3.5%를 1일 1회 공급하였으며 급이 횟수, 수온, 환수량 등 모든 양식 조건을 동일하게 사육하였다. 실험 기간 중의 사육 수온은 22±1℃를 유지하였다.
- 백신접종 14일 후 혈청을 분리하여 응집가 반응을 통해 불활화 백신에 대한 항체가 형성되었음(210 antibody titer) 을 확인하였고 1H-NMR 분석에 사용하였다. 온도에 따른 1H-NMR peak의 pattern을 확인하기 위해 온도조건을 20, 25, 30℃로 설정하여 splitting이 가장 많은 3.5-4.0 ppm 영역의 peak들을 비교하였다. Peak pattern은 같았으며 온도변화에 따른 peak pattern에 변화가 없는 것으로 판단되어 분석온도는 25℃로 설정하였다.
- 포르말린으로 불활화시킨 E. tarda를 멸균 생리식염수로 희석한 후 MS-222로 마취된 넙치의 복강 내에 0.1 mL를 주사하였다. 백신 효능검증의 어체 크기는 직경 15 cm, 무게 50 g으로 주사가 가능한 가장 작은 크기의 어체로 선택하여 실험을 진행하였으며 백신의 농도는 10 mg/kg bodyweight로 실험을 진행하였다.
대상 데이터
- 실험어는 양식장(극동수산, 경북 포항)에서 생산된 넙치(평균 50±7 g)를 사용하였고 200리터 원형수조에 동일한 사육밀도로 30마리씩 수용을 하였다.
데이터처리
- 본 연구는 넙치의 백신 접종에 따른 대사물질의 변화를 분석하기 위한 실험으로 백신 접종 전 후의 대사물질을 비교 분석하고 백신에 반응하는 물질(vaccine-response substance; VRS)을 분석하여 indicator로서 선정하고자 하는 것이 그 목적이다. 대사물질의 변화분석을 위해서는 수소 핵자기공명분석(1H-nuclear magnetic resonance: 1H-NMR)과 주성분분석(principal components analysis: PCA) 및 부분 최소제곱 분석(partial least square: PLS)을 실시하였다.
이론/모형
- 1H-NMR 스펙트럼 데이터는 Matlab (version 6.5)에 도입하였고 Unscramber (version X1.0) 이용하여 total metabolite에 대한 주성분분석(PCA)과 부분최소 제곱법(PLS)을 실시하였다. PCA는 자료의 변수들이 가진 정보를 최대한 확보 할수 있는 적은 수의 새로운 변수를 생성하는 것으로 새로운 변수를 주성분(principal component)이라 하며 자료가 보여주는 변이를 최대한 설명할 수 있는 주성분을 선택한다(Massart and Vandeginste 1988; Joo and Cho 2005).
- PLS는 작은 변이를 설명하는 변수를 제외시킴으로써 차원축소를 통해 안정적인 결과를 얻을 수 있는 방법으로 PLS분석을 통하여 score plot에서 clusting을 확인하고 loading plot에서 indicator로 추측되는 인자를 탐색하며 VIP value를 이용하여 인자의 중요도를 확인하였다. PCA와 PLS-DA 분석에서 component는 7로 설정하였으며 non-linear iterative partial square algorithm(NIPALS)으로 실행하였다.
- 백신 효능검증의 어체 크기는 직경 15 cm, 무게 50 g으로 주사가 가능한 가장 작은 크기의 어체로 선택하여 실험을 진행하였으며 백신의 농도는 10 mg/kg bodyweight로 실험을 진행하였다. 응집가반응(Kim et al., 2009)을 통해 항체가 형성여부를 확인하였다.
성능/효과
- 1H-NMR에서는 13C-NMR에 상보되는 3개의 지방산 methyl proton과 42개의 methylene proton, 6개의 methine proton을 나타냈으며 2개의 glycerol methylene proton과 1개의 glycerol methane proton 을 확인하였다. NMR과 MS의 data 분석결과 glycerolipid로 확인되었으며 Ramsewak et al. (2001)가 보고한 문헌의 자료와 비교한 결과 triolein으로 확인되었다(Fig. 4).
- 2-b). PLS분석에서는 PCA 에서 보다 대조구와 실험구의 샘플이 더욱 명확하게 구분되는 것을 확인할 수 있어 regression coefficients의 VIP value를 확인한 결과 0.65, 1.53, 2.05, 2.22 ppm의 peak가 가장 두드러지게 구분되었으며 이 peak들은 지질성분의 나타내는 methylene과 methyl기로 확인되었다(Fig. 3).
- PCA분석의 loading plot과 scores plot을 나타냈으며 sample 1-5는 대조구의 sample이며 sample 6-10은 실험구(백신접종후 얻은 혈청)의 sample로 나타내었다. Scores plot에서 실험구와 대조구 sample의 확연한 차이를 보이며(Fig. 2-a) loading plot의 correlation 결과 0.65, 1.53, 1.64, 2.05, 2.22, 5.21ppm의 peak가 중앙값에서 가장 멀리 나타나 다른 peak들과 구분되는 것을 확인할 수 있다(Fig. 2-b). PLS분석에서는 PCA 에서 보다 대조구와 실험구의 샘플이 더욱 명확하게 구분되는 것을 확인할 수 있어 regression coefficients의 VIP value를 확인한 결과 0.
- H-NMR 분석과 다변량통계분석을 통해 백신처리를 통한 넙치의 혈청성분 중 지질성분의 함량에 차이가 나는 것을 확인할 수 있었고 TLC를 통해 대조군과 구별되는 band를 분리하여 구조분석을 실시하였다. 물질은 FAB-MS 분석결과 분자량이 885.43로 나타났으며 NMR (1H, 13C)과 MS를 통해 분자식은 C57H104O6로 확인되었다. 13C-NMR을 통해 14.
- , 1995) 혈청내에서의 변화는 이화작용의 결과로 나타난 것으로 볼 수 있다. 본 연구를 통해 넙치에 백신을 접종한 경우 항체가는 증가하였고 triglyc eride의 함량은 감소하는 것으로 나타났고 그 성분은 triolein으로 확인되었다. 본 연구를 통해 확인된 triolein는 향후 백신개발 및 면역보강제 개발 연구에서 효능을 확인하는 indicator로 활용하고자 한다.
후속연구
- 본 연구를 통해 넙치에 백신을 접종한 경우 항체가는 증가하였고 triglyc eride의 함량은 감소하는 것으로 나타났고 그 성분은 triolein으로 확인되었다. 본 연구를 통해 확인된 triolein는 향후 백신개발 및 면역보강제 개발 연구에서 효능을 확인하는 indicator로 활용하고자 한다.
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