본 연구는 흰잎마름병 K1 레이스에 감수성인 상주찰벼와 저항성인 HR13721-53-3-1-3-3-2-2를 인공교배하여 육성된 F2, F3를 재료로 하천 Kl 레이스에 대한 저항성 검정과 SNP마커를 이용한 유전자형 분석 및 저항성과의 연관성을 분석하였다. Kl 레이스에 대한 저항성 검정 결과 $F_2,\;F_3$에서 각각 이론적 분리비인 3:1, 1:1의 분리비를 나타냈으며 SNP 마커를 이용한 유전자형 분석은 16PFXa1 primer를 이용하여 유전자를 증폭한 후 Eco RV 제한효소 처리하여 다형성을 분석하여 저항성 및 유전자형을 확인할 수 있었다. K1 레이스에 대한 저항성 검정과SNP마커를 이용한 유전자형의 연관분석 결과 저항성과 마커간에 연관성이 일치하였으며, 특히 SNP 마커를 이용한 유전자형 분석에서는 K1 레이스에 대한 저항성 검정에서 알 수 없었던 $F_2$ 개체가 동형접합체인지 이형접합체인지를 판별할 수 있어 저항성 품종 육종을 위한 선발 효율을 높일 수 있었다.
본 연구는 흰잎마름병 K1 레이스에 감수성인 상주찰벼와 저항성인 HR13721-53-3-1-3-3-2-2를 인공교배하여 육성된 F2, F3를 재료로 하천 Kl 레이스에 대한 저항성 검정과 SNP 마커를 이용한 유전자형 분석 및 저항성과의 연관성을 분석하였다. Kl 레이스에 대한 저항성 검정 결과 $F_2,\;F_3$에서 각각 이론적 분리비인 3:1, 1:1의 분리비를 나타냈으며 SNP 마커를 이용한 유전자형 분석은 16PFXa1 primer를 이용하여 유전자를 증폭한 후 Eco RV 제한효소 처리하여 다형성을 분석하여 저항성 및 유전자형을 확인할 수 있었다. K1 레이스에 대한 저항성 검정과SNP마커를 이용한 유전자형의 연관분석 결과 저항성과 마커간에 연관성이 일치하였으며, 특히 SNP 마커를 이용한 유전자형 분석에서는 K1 레이스에 대한 저항성 검정에서 알 수 없었던 $F_2$ 개체가 동형접합체인지 이형접합체인지를 판별할 수 있어 저항성 품종 육종을 위한 선발 효율을 높일 수 있었다.
Discovery of single nucleotide polymorphisms (SNPs), including small insertions and deletions, is one of the hot topics in genetic research. The most common type of sequence variant consists of single base differences or small insertions and deletions at specific nucleotide positions. Significance o...
Discovery of single nucleotide polymorphisms (SNPs), including small insertions and deletions, is one of the hot topics in genetic research. The most common type of sequence variant consists of single base differences or small insertions and deletions at specific nucleotide positions. Significance of SNPs in rice is increasing for genetic research, positional cloning and molecular breeding. $F_2$ 170 lines and $F_3$ 194 lines derived from Sangjuchalbyeo/HR13721-53-3-1-3-3-2-2 Were used for Searching SNP markers related to bacterial blight resistance. Sangjuchalbyeo is susceptible to bacterial blight, but HR13721-53-3-1-3-3-2-2 has Xa1 gene resistant to bacterial blight. Individual lines were inoculated with $K_1$ race of bacterial blight and resistant or susceptible was evaluated after 3 weeks from inoculation. The genotypes of population were analysed by PCR-RFLP for SNP marker developing. The segregation of $F_2\;and\;F_3$ population showed almost 3:1, 1:1 ratio, respectively. Analysis of genotype using SNP marker is capable of confirming resistance for $K_1$ race and genotype through amplifying the gene using 16PFXal primer and digested the PCR product with Eco RV. There were close relation between resistance test for $K_1$ race and SNP marker genotype. Especially, DNA analysis using SNP marker is capable of judging homozygote/heterozygote in $F_2$ population compared with resistant test for Kl race. So, it seems to improve the selection efficiency in disease resistant breeding.
Discovery of single nucleotide polymorphisms (SNPs), including small insertions and deletions, is one of the hot topics in genetic research. The most common type of sequence variant consists of single base differences or small insertions and deletions at specific nucleotide positions. Significance of SNPs in rice is increasing for genetic research, positional cloning and molecular breeding. $F_2$ 170 lines and $F_3$ 194 lines derived from Sangjuchalbyeo/HR13721-53-3-1-3-3-2-2 Were used for Searching SNP markers related to bacterial blight resistance. Sangjuchalbyeo is susceptible to bacterial blight, but HR13721-53-3-1-3-3-2-2 has Xa1 gene resistant to bacterial blight. Individual lines were inoculated with $K_1$ race of bacterial blight and resistant or susceptible was evaluated after 3 weeks from inoculation. The genotypes of population were analysed by PCR-RFLP for SNP marker developing. The segregation of $F_2\;and\;F_3$ population showed almost 3:1, 1:1 ratio, respectively. Analysis of genotype using SNP marker is capable of confirming resistance for $K_1$ race and genotype through amplifying the gene using 16PFXal primer and digested the PCR product with Eco RV. There were close relation between resistance test for $K_1$ race and SNP marker genotype. Especially, DNA analysis using SNP marker is capable of judging homozygote/heterozygote in $F_2$ population compared with resistant test for Kl race. So, it seems to improve the selection efficiency in disease resistant breeding.
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문제 정의
2005). 본 연구는 벼 흰잎마름병저항성 유전자인 Xal 유전자를 가진 분리집단을 육성하고 분 리집단에 대한 개체별 저항성 검정 및 유전정보를 획득한 후 흰잎마름병 저항성 관련 SNP 마커를 탐색하고 육종현장에서 흰잎마름병 저항성 계통을 과학적이고 보다 편리하게 대량검 정 할 수 있는 체계를 확립하는데 그 목적을 두고 연구를 수 행하였다.
제안 방법
7 volume의 isopropancl을 넣어 잘 섞은 다음 원심분리하여 상층액을 버리고, 70% 에탄올로 2번 씻어주었다. DNA를 건조한 후 0.1 X TE buffer에 DNA를 녹였다 벼 흰잎마름병 K1 레이스에 대한 저항성고 SNP 마커를 이용한 PCR-RFLP 분석 결과와의 연관성을 탐색하기 위한 16PFXal 프라이머(5, -ACG
Extension) 방법을 이용하여 벼 12개 염색체를 대상으로 평균 50 kb 간격을 갖는 95, 887 primer를 설계하였으며, 이 중 평균 1 Mb 간격을 갖는 363 SNP 마커를 탐색하고 염기서열을 분 석하였다. 식물체의 genomic DNA는 CTAB 방법 (Rogers and Bendich 1988)을 이용하여 추출하였다.
GGT TTA AG3)는 농업생명공학연구원에서 분양 받아 사 용하였다. PCR 반응은 94℃ 에서 5분간 DNA를 변성시키고, 증폭반응 (94℃ 에서 30초 60℃ 에서 30초 72℃ 에서 1분)을 35회 진행하였으며, 최종 신장반응은 72℃ 에서 7분간 수행하 였다. PCR 산물은 Eco RV 제한효소로 2시간 처리한 후 전기 영동하여 다형성을 조사하였으며 포장에서의 Ki 레이스 검 정 결과와 비교하였다.
PCR 반응은 94℃ 에서 5분간 DNA를 변성시키고, 증폭반응 (94℃ 에서 30초 60℃ 에서 30초 72℃ 에서 1분)을 35회 진행하였으며, 최종 신장반응은 72℃ 에서 7분간 수행하 였다. PCR 산물은 Eco RV 제한효소로 2시간 처리한 후 전기 영동하여 다형성을 조사하였으며 포장에서의 Ki 레이스 검 정 결과와 비교하였다.
SNP 마커를 이용한 PCR-RFLP# 수행하기 위한 SNP 마커 탐색과 염기서열 분석은 농업생명공학연구원에서 수행하였다 북경 유전체 연구소(BGI)와 국제 쌀 게놈 프로젝트(IRGSP) 에 의해 indica (93-11)와 japonica (Nipponbare)의 염기서열이 발표됨에 따라 이 두 염기서열을 비교 분석하여 총 15, 303, 476개의 mismatch site가 탐색되었으며, DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)와 SBE (Single Base
SNP 마커를 이용한 PCR-RFLP를 수행하기 위한 SNP 마커 탐색과 염기서열 분석은 농업생 명공학연구원에서 수행하였다. 이미 발표된 indica와 japonica의 염기서열 분석 DB를 토대로 대청벼, 탐진벼 등 6개의 흰잎마름병 저항성인 품종과 신선찰벼, 동진벼, 만금벼 등 10개의 흰잎마름병 감수성 품종을 대상으로 4번 염색체에 존재하는 유전자 주변의 염기
접종에 사용된 K1 레이스는 호남농업연구소 식물환경과에서 분양받은 HB01013이었으며 PSA 배지에서 28℃에서 3일간 배양한 후, 최고분얼기에 엽선단 5 cm 부위에 절엽 접종 하였다. 접종 3주 후에 병반장의 진전 정도에 따라 저항성과 이병성을 판단하였다.
대상 데이터
GGT TTA AG3)는 농업생명공학연구원에서 분양 받아 사 용하였다. PCR 반응은 94℃ 에서 5분간 DNA를 변성시키고, 증폭반응 (94℃ 에서 30초 60℃ 에서 30초 72℃ 에서 1분)을 35회 진행하였으며, 최종 신장반응은 72℃ 에서 7분간 수행하 였다.
본 연구에 사용된 분리집단은 MAS (Marker assisted selec tion)를 이용한 흰잎마름병 저항성 품종의 분자육종 실용화를 위하여 2001년에 K1 레이스에 감수성 품종인 상주찰벼와 Xal 유전자를 가지고 있는 HR13721-53-3-1-3-3-2-2를 인공교배하여 육성되었다. HR13721 은 Asominori에서 유래된 Xal 유전자를 가진 대청벼를 K1 레이스에 감수성인 이리 390호에 6회 여교잡하여 육성되었다. 본 연구에서는 F2 170개체, F3 194 계통을 흰잎마름병 K1 레이스 저항성 검정 및 SNP 마커를 이용한 유전분식에 사용하였다.
벼 흰잎마름병균 K1 레이스에 감수성인 상주찰벼와 유전자를 가지고 있으며 K1 레이스에 저항성을 보이는 HR13721- 53-3-1-3-3-2-2를 인공교배하여 R 10개체, F2 293개체, F3 198계 통을 육성하였으며, 이 중 F2 170개체, F3 194계통을 K1 레이 스 저항성 및 SNP marker를 이용한 유전 분석에 이용하였다.
본 연구에 사용된 분리집단은 MAS (Marker assisted selec tion)를 이용한 흰잎마름병 저항성 품종의 분자육종 실용화를 위하여 2001년에 K1 레이스에 감수성 품종인 상주찰벼와 Xal 유전자를 가지고 있는 HR13721-53-3-1-3-3-2-2를 인공교배하여 육성되었다. HR13721 은 Asominori에서 유래된 Xal 유전자를 가진 대청벼를 K1 레이스에 감수성인 이리 390호에 6회 여교잡하여 육성되었다.
HR13721 은 Asominori에서 유래된 Xal 유전자를 가진 대청벼를 K1 레이스에 감수성인 이리 390호에 6회 여교잡하여 육성되었다. 본 연구에서는 F2 170개체, F3 194 계통을 흰잎마름병 K1 레이스 저항성 검정 및 SNP 마커를 이용한 유전분식에 사용하였다.
접종에 사용된 K1 레이스는 호남농업연구소 식물환경과에서 분양받은 HB01013이었으며 PSA 배지에서 28℃에서 3일간 배양한 후, 최고분얼기에 엽선단 5 cm 부위에 절엽 접종 하였다. 접종 3주 후에 병반장의 진전 정도에 따라 저항성과 이병성을 판단하였다.
이론/모형
Extension) 방법을 이용하여 벼 12개 염색체를 대상으로 평균 50 kb 간격을 갖는 95, 887 primer를 설계하였으며, 이 중 평균 1 Mb 간격을 갖는 363 SNP 마커를 탐색하고 염기서열을 분 석하였다. 식물체의 genomic DNA는 CTAB 방법 (Rogers and Bendich 1988)을 이용하여 추출하였다. 벼 잎 2 g을 액체질소에 급속 냉동시켜 유발로 최대한 마쇄한 후 15 I falcone tube로 옮긴 후 65℃로 데워진 2 x CTAB 2을 첨가하고 30분간 배양하였다.
성능/효과
서열을 분석한 결과 lOPFXa, 16PFXa, 17PFXa 등 3개의 SNP 마커를 발견흐]-였으며, 이 중 16PFXal은 EcRV 제한효소 자리를 포함하고 있어 PCR-RFLP 분석에 적합한 마커로 판단되었다. F2 개체의 genomic DNA를 추출하여 PCR 반응 후 PCR 산물 1를 전기 영동한 결과 361 bp size의 band가 증폭됨을 확인할 수 있었다 (Figure 1). PCR 산물을 2시간 동안 Eco RV 제한효소를 처리하여 전기 영동한 결과 저항성인 개체는 lane 1, 5, 8, 10에서 보는 바와 같이 제한효소에 의해 201 bp와 155 bp의 두 band로 분리되는 것을 확인할 수 있었으며, 감수성인 개체는 lane 2, 3, 12, 13에서 보는 바와 같이 Eco RV 제한효소처리에 의한 절단되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
F2 개체의 genomic DNA를 추출하여 PCR 반응 후 PCR 산물 1를 전기 영동한 결과 361 bp size의 band가 증폭됨을 확인할 수 있었다 (Figure 1). PCR 산물을 2시간 동안 Eco RV 제한효소를 처리하여 전기 영동한 결과 저항성인 개체는 lane 1, 5, 8, 10에서 보는 바와 같이 제한효소에 의해 201 bp와 155 bp의 두 band로 분리되는 것을 확인할 수 있었으며, 감수성인 개체는 lane 2, 3, 12, 13에서 보는 바와 같이 Eco RV 제한효소처리에 의한 절단되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그러나lane 4, 6, 7, 9, 11에서와 같이 Eco RV 제한효소 처리에 PCR 산물의 일부분만이 반응하여 3개의 band가 나타나는 경우가 있어 24시간 제한효소 처리한 결과 동일한 결과를 얻었다.
따라서 이러한 결과로 3개의 band가 나타나는 개체는 실험 오류가 아닌 유전자형이 이형접합체임을 확인할 수 있었다 이러한 K1 레이스에 대한 저항성 검정과 SNP 마커를 이용한 PCR-RFLP 분석 결과는 Table 2와 같다. 분리 집단의 F2, F3 세대에서 K1 레이스에 대한 저항성 검정과 PCR-RFLP 분석 결과 모두 각각 3:1, 1:1의 분리비를 나타냈으며, 이는 이론상 분리비에 적합하였다. 특히 PCR-RFLP 분석을 통하여 K1 레이스에 대한 저항성 검정에서는 알 수 없었던 저항성 유전자의 유전자형을 알 수 있다는 장점이 있었다.
서열을 분석한 결과 lOPFXa, 16PFXa, 17PFXa 등 3개의 SNP 마커를 발견흐]-였으며, 이 중 16PFXal은 EcRV 제한효소 자리를 포함하고 있어 PCR-RFLP 분석에 적합한 마커로 판단되었다. F2 개체의 genomic DNA를 추출하여 PCR 반응 후 PCR 산물 1를 전기 영동한 결과 361 bp size의 band가 증폭됨을 확인할 수 있었다 (Figure 1).
분리 집단의 F2, F3 세대에서 K1 레이스에 대한 저항성 검정과 PCR-RFLP 분석 결과 모두 각각 3:1, 1:1의 분리비를 나타냈으며, 이는 이론상 분리비에 적합하였다. 특히 PCR-RFLP 분석을 통하여 K1 레이스에 대한 저항성 검정에서는 알 수 없었던 저항성 유전자의 유전자형을 알 수 있다는 장점이 있었다. 이는 Figure 2에 서 보는 바와 같이 F3 세대에 대한 K1 레이스 검정 결과 감수성 개체가 '없을 경우 이형접합체임에도 불구하고 이를 동형 접합체로 잘못 판단할 가능성이 있다.
후속연구
1995; 2003). 이러한 유전자중에서 Xal 유 전자는 K1 레이스에, Xa3 유전자는 KI, K2, K3 레이스에 저 항성을 나타내는 것으로 알려져 있으며 (Lin et al. 1996), 이 유전자들은 단순 우성 유전을 한다고 하여 본 연구 결과와 일 치하였다 최근에는 KI, K2, K3 및 K3a 레이스에 모두 저항 성을 보이는 Xa7 유전자를 가진 익산478호가 개발되어 앞으 로 저항성 유전자 다양화에 크게 기여 할 것으로 생각된다. 한편 최근 벼 흰잎마름병 저항성 유전자와 연관된 DNA 표지인자들이 밝혀졌는데, Yoshimura 등(1998)은 유전자는 4번 염색체에 위치하고 있으며 4개의 exon과 3개의 intron으로 구성되어 있으며 5.
이는 Figure 2에 서 보는 바와 같이 F3 세대에 대한 K1 레이스 검정 결과 감수성 개체가 '없을 경우 이형접합체임에도 불구하고 이를 동형 접합체로 잘못 판단할 가능성이 있다. 이러한 이유로 PCR- RFLP 분석과 K1 레이스에 대한 저항성 검정 결과 간에 동형접합체와 이형접합체의 차이가 발생한 것으로 생각되며, 이러한 SNP 마커를 이용하여 저항성 품종 육성을 위한 선발 효율을 높일 수 있을 것이다.
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