GWAS 분석을 이용한 벼 지엽각 관련 SNP 동정 및 발현 분석 Gene expression and SNP identification related to leaf angle traits using a genome-wide association study in rice (Oryza sativa L.)원문보기
본 연구에서는 국내외에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 벼의 지엽각 특성에 대한 조사를 수행하였고, GWAS를 이용하여 지엽각 연관 유전자를 추출 및 분석하였다. 표현형 데이터를 이용한 GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 표현형과 통계적 유의성을 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다. 지엽각 관련 특성에 대하여 선행 연구된 QTL region과의 비교를 통하여 본 연구에서 발굴된 SNP간의 유의성을 조사한 결과, 지엽각과 유의성이 있는 SNP (S8-19815442)가 이미 확인된 QTL region에 위치하는 것으로 나타났으며, 후보유전자 Os08g31950 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 형질 특이적 품종군 간의 염기서열을 비교한 결과 1개의 지역에서 단일염기변이가 검출되었다. Os08g31950의 조직별 RNA의 상대적 발현량 수준을 비교한 결과, Os08g31950 유전자는 모든 조직에서 높은 발현량을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 모두 직립형 품종군에서 상대적으로 발현량이 높게 나타났으며 뿌리보다 잎에서의 발현율이 높게 나타났다. 본 연구를 통해 동정된 지엽각 연관 후보유전자 Os08g31950는 벼 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 마커제작 및 육종의 기초자료가 될 것으로 기대된다.
본 연구에서는 국내외에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 벼의 지엽각 특성에 대한 조사를 수행하였고, GWAS를 이용하여 지엽각 연관 유전자를 추출 및 분석하였다. 표현형 데이터를 이용한 GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 표현형과 통계적 유의성을 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다. 지엽각 관련 특성에 대하여 선행 연구된 QTL region과의 비교를 통하여 본 연구에서 발굴된 SNP간의 유의성을 조사한 결과, 지엽각과 유의성이 있는 SNP (S8-19815442)가 이미 확인된 QTL region에 위치하는 것으로 나타났으며, 후보유전자 Os08g31950 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 형질 특이적 품종군 간의 염기서열을 비교한 결과 1개의 지역에서 단일염기변이가 검출되었다. Os08g31950의 조직별 RNA의 상대적 발현량 수준을 비교한 결과, Os08g31950 유전자는 모든 조직에서 높은 발현량을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 모두 직립형 품종군에서 상대적으로 발현량이 높게 나타났으며 뿌리보다 잎에서의 발현율이 높게 나타났다. 본 연구를 통해 동정된 지엽각 연관 후보유전자 Os08g31950는 벼 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 마커제작 및 육종의 기초자료가 될 것으로 기대된다.
This study was conducted to investigate a morphological trait in 294 rice accessions including Korean breeding lines. We also carried out a genome-wide association study (GWAS) to detect significant single nucleotide polymorphism markers and candidate genes affecting major agronomic traits. A Manhat...
This study was conducted to investigate a morphological trait in 294 rice accessions including Korean breeding lines. We also carried out a genome-wide association study (GWAS) to detect significant single nucleotide polymorphism markers and candidate genes affecting major agronomic traits. A Manhattan plot analysis of GWAS using morphological traits showed that phenotypic and statistical significance was associated with a chromosome in each group. The significance of SNPs that were detected in this study was investigated by comparing them with those found previously studied QTL regions related to agronomic traits. As a result, SNP (S8-19815442), which is significant with regard to leaf angle, was located in the known QTL regions. To observe gene mutations related to leaf angle in a candidate gene, Os08g31950, its sequences were compared with sequences in previously selected rice varieties. In Os08g31950, a single nucleotide mutation occurred in one region. To compare relative RNA expression levels of candidate gene Os08g31950, obtained from GWAS analysis of 294 rice accessions and related to lateral leaf angle, we investigated relative levels by selecting 10 erect leaf angle varieties and 10 horizontal leaf angle varieties and examining real-time PCR. In Os08g31950, a high level of expression and various expression patterns were observed in all tissues. Also, Os08g31950 showed higher expression levels in the erect leaf angle variety group and higher expression rates in the leaf than in the root. The candidate gene detected through GWAS would be useful in developing new rice varieties with improved yield potential through future molecular breeding.
This study was conducted to investigate a morphological trait in 294 rice accessions including Korean breeding lines. We also carried out a genome-wide association study (GWAS) to detect significant single nucleotide polymorphism markers and candidate genes affecting major agronomic traits. A Manhattan plot analysis of GWAS using morphological traits showed that phenotypic and statistical significance was associated with a chromosome in each group. The significance of SNPs that were detected in this study was investigated by comparing them with those found previously studied QTL regions related to agronomic traits. As a result, SNP (S8-19815442), which is significant with regard to leaf angle, was located in the known QTL regions. To observe gene mutations related to leaf angle in a candidate gene, Os08g31950, its sequences were compared with sequences in previously selected rice varieties. In Os08g31950, a single nucleotide mutation occurred in one region. To compare relative RNA expression levels of candidate gene Os08g31950, obtained from GWAS analysis of 294 rice accessions and related to lateral leaf angle, we investigated relative levels by selecting 10 erect leaf angle varieties and 10 horizontal leaf angle varieties and examining real-time PCR. In Os08g31950, a high level of expression and various expression patterns were observed in all tissues. Also, Os08g31950 showed higher expression levels in the erect leaf angle variety group and higher expression rates in the leaf than in the root. The candidate gene detected through GWAS would be useful in developing new rice varieties with improved yield potential through future molecular breeding.
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문제 정의
본 연구에서는 국내외에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 벼의 지엽각 특성에 대한 조사를 수행하였고, GWAS를 이용하여 지엽각 연관 유전자를 추출 및 분석하였다. 표현형 데이터를 이용한 GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 표현형과 통계적 유의성을 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다.
본 연구에서는 전세계에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 엽 형태 특성에 대한 조사를 수행하였고 GWAS 분석을 실시하여 형질 관련 SNP 마커를 탐색하고, 벼의 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 유전자원들을 탐색하여 유전체 육종에 필요한 기초자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
벼 resequencing 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 후보유전자에 대하여 hyplotype 분석을 실시하였으며, haplotype 분석 시 Nipponbare (Tempera Japonica) 염기서열을 기준으로 하였다. Hyplotype 분석결과 및 표현형 데이터를 비교 분석하여 벼 농업 형질과 후보유전자 간의 관련 여부에 대해 검정하였다.
PCR은 SYBR® Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Japan)와 Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)를 사용하였다.
RT-PCR을 통하여 목표유전자의 증폭량을 확인한 후, mRNA 발현량을 분석하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였다(Table 2). PCR은 SYBR® Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Japan)와 Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)를 사용하였다.
모든 표본들은 실험의 정확성을 높이기 위하여 3 반복으로 진행하였으며 PCR 반응은 95°C에서 3분간 pre-denaturation을 시행한 후 95°C에서 10초간 denaturation, 55°C에서 20초간 annealing, 72°C에서 30초간 extension하고, scanning하는 과정을 50회 반복하였으며, melting curve 분석은 65 ~ 95°C에서 0.5°C씩 5초간 실행하였다.
50%)의 SNP를 확인할 수 있었다. 벼 273점에 대한 지엽각 표현형 데이터를 이용하여 GWAS를 실시하였으며, GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 지엽각과 통계적 유의도를 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다.
벼 resequencing 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 후보유전자에 대하여 hyplotype 분석을 실시하였으며, haplotype 분석 시 Nipponbare (Tempera Japonica) 염기서열을 기준으로 하였다. Hyplotype 분석결과 및 표현형 데이터를 비교 분석하여 벼 농업 형질과 후보유전자 간의 관련 여부에 대해 검정하였다.
벼 resequencing 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 후보유전자의 형질별 유전적 변이 및 연관성을 분석하기 위하여, 본 연구를 통해 조사된 직립형 지엽각 품종군과 수평형 지엽각 품종군을 각각 10개씩 선정하여 염기서열 분석을 수행하였다. 지엽각 형질 연관 후보유전자 Os08g31950에 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 직립형 지엽각 품종군과 수평형 지엽각 품종간 사이의 염기서열을 비교한 결과 는 Figure 5와 같다.
벼 resequencing 유전자원 294점에 대한 형질 관련 특이적 SNP들의 선별을 위한 기준을 선정하기 위하여 quality control을 수행하였다. 총6,243,699개의 SNP들 중, read depth가 4× 이상, 200× 이하이며 MAF > 0.
본 연구에서 발굴된 유의적인 SNP들 중 –logP > 8 에 해당하는 SNP들에 대해 주변 지역에서 NCBI data base를 통하여 후보유전자를 탐색하였고, 그 중 관련 있는 후보유전자들을 선발하였다.
2016). 생성된 fastq형식의 raw data 파일은 Cutadapt, sickle 등의 분석 프로그램을 이용하여 adaptor, low quality reads를 제거하였으며, 변이분석은 벼의 표준유전체 염기서 열인 IRSGP1.0 (International Rice Genome Sequencing Project)와 비교하여 분석을 수행하였다.
전체 벼 유전체재분석 집단 294점 중 국내 육성종(Korean breeding line)은 225점으로 인디카(Indica) 38점, 자포니카(Japonica) 178점, 열대자포니카(Tropicial Japonica) 9점으로 구성되어 있다(Table 1). 선발된 전체 294점의 벼 유전체재분석 집단은 2015년과 2017년에 충북대학교 실험농장에 재배하여 특성 조사 및 종자 증식을 수행하였으며, 엽 형태 특성에 대한 조사를 위하여 5반복으로 농촌진흥청 조사기준 및 국립종자원에서 규정한 벼 표준조사법에 따라 조사하였다.
본 연구에서는 국내외에서 수집한 벼 294개 유전자원 핵심집단을 대상으로 벼의 지엽각 특성에 대한 조사를 수행하였고, GWAS를 이용하여 지엽각 연관 유전자를 추출 및 분석하였다. 표현형 데이터를 이용한 GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 표현형과 통계적 유의성을 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다. 지엽각 관련 특성에 대하여 선행 연구된 QTL region과의 비교를 통하여 본 연구에서 발굴된 SNP간의 유의성을 조사한 결과, 지엽각과 유의성이 있는 SNP (S8-19815442)가 이미 확인된 QTL region에 위치하는 것으로 나타났으며, 후보유전자 Os08g31950 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 형질 특이적 품종군 간의 염기서열을 비교한 결과 1개의 지역에서 단일염기변이가 검출되었다.
2010)을 이용하여 분석하였다. 후보유전자 영역에서 발견된 유전자들을 후 보유전자로 선정하고, 각각의 유전자의 mRNA 전사체에 대한 cDNA 서열과 genomic DNA 서열을 Rice Genome Annotation Project와 NCBI database에서 검색하여 추출하였다. 선발된 위치상 후보유전자 내 SNP 마커들 간의 연관성을 보기 위해 Haploview version 4.
대상 데이터
지엽각에 대하여 유의성이 높은 SNP S8_19815381 및 SNP S8_19879513 사이의 약 64 Kb 구간에서 13개의 유전자가 관찰되었다. 그 부위에서 Os08g31950.1 (Basic helix-loop-helix proteins (bHLHs)) 및 Os08g31970.1 (NHL(Ncl-1, HT2A, Lin-41)-repeat-containing protein), Os08g31970.2 (NHL(Ncl-1, HT2A, Lin-41)-repeat-containing protein), Os08g31980.1 (Trehalose-6-phosphate synthase) 등 4개의 후보유전자가 선발되었다(Table 5).
본 연구에서 이용한 벼 유전자원은 세계 각국에서 수집된 24,000여점의 유전자원 중 도입종(introduced), 국내에서 수집된 유전자원 중 육성종(breeding line), 잡초성벼(weedy) 및 IRRI(International Rice Research Institute) 자원을 이용하여 166점의 핵심집단을 선발하였다. 일부 국내에서 유래된 벼의 출수되지 않는 자원을 제외한, 실제 국내에서 육성되고 이용가치가 큰 육성종을 추가로 선발하여 최종적으로 294점의 벼 유전체재분석 집단을 공주대학교 박용진 교수팀에서 선발하여 resequencing에 사용하였다(Kim et al.
본 연구에서 이용한 벼 유전자원은 세계 각국에서 수집된 24,000여점의 유전자원 중 도입종(introduced), 국내에서 수집된 유전자원 중 육성종(breeding line), 잡초성벼(weedy) 및 IRRI(International Rice Research Institute) 자원을 이용하여 166점의 핵심집단을 선발하였다. 일부 국내에서 유래된 벼의 출수되지 않는 자원을 제외한, 실제 국내에서 육성되고 이용가치가 큰 육성종을 추가로 선발하여 최종적으로 294점의 벼 유전체재분석 집단을 공주대학교 박용진 교수팀에서 선발하여 resequencing에 사용하였다(Kim et al. 2016). 전체 벼 유전체재분석 집단 294점 중 국내 육성종(Korean breeding line)은 225점으로 인디카(Indica) 38점, 자포니카(Japonica) 178점, 열대자포니카(Tropicial Japonica) 9점으로 구성되어 있다(Table 1).
이론/모형
GWAS분석은 코넬대학교에서 개발한 식물의 양적 형질에 적용할 수 있으며 대용량의 데이터를 처리할 수 있는 GAPIT(Genomic Association and Prediction Integrated Tool) (Lipka et al. 2012) 및 GAPIT의 혼합선형모형(Zhang et al. 2010)을 이용하여 분석하였다. 후보유전자 영역에서 발견된 유전자들을 후 보유전자로 선정하고, 각각의 유전자의 mRNA 전사체에 대한 cDNA 서열과 genomic DNA 서열을 Rice Genome Annotation Project와 NCBI database에서 검색하여 추출하였다.
벼 294점의 DNA 추출은 이앙 후 15일된 어린잎으로부터 0.5g의 조직을 채취하여 CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide)법을 이용하였다(Kump and Javomik 1996; Cho et al. 1998). 추출한 DNA는 λDNA (100 ng/ul)와 함께 1% agarose gel에서 확인하였고 20 ng/ul로 정량하여 실험에 사용하였다(Abdula et al.
후보유전자 영역에서 발견된 유전자들을 후 보유전자로 선정하고, 각각의 유전자의 mRNA 전사체에 대한 cDNA 서열과 genomic DNA 서열을 Rice Genome Annotation Project와 NCBI database에서 검색하여 추출하였다. 선발된 위치상 후보유전자 내 SNP 마커들 간의 연관성을 보기 위해 Haploview version 4.2를 이용하였다.
성능/효과
Manhattan plot에서 –logP > 8을 기준으로 볼 때 유의적인 SNP가 탐지됨을 확인할 수 있었으며 벼 염색체 8번에 위치한 해당 SNP(S8_19815442)가 어떤 SNP보다도 유의적인 SNP임을 알 수가 있었다(Table 4).
Os08g31950-Hap1 그룹에 속하는 품종은 220개로 지엽각의 범위가 6° ~ 86.5°의 범위였으며, Os08g31950-Hap2 그룹에 속하는 품종은 72개로 지엽각의 범위가 5° ~ 75°로 나타났다(Fig. 3).
Os08g31950의 직립형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 봉광 및 큰섬, Yusin, 수원 347호, 영덕 등 총5개 품종에서 단일염기서열이 치환된 것을 확인할 수 있었으며 이들 중 대부분은 인티카(Indica) 생태형을 지닌 것으로 나타났다. Os08g31950의 수평형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 직립형 지엽각 품종군과는 다르게 TAI MOCHITO 1개 품종에서만 단일염기치환이 관찰되었으며 TAI MOCHITO의 생태형은 열대자포니카(Tropical Japonica)인 것으로 관찰되었다. 상기와 같이 발굴된 1개 SNP(S8_19814759)는 아미노산 합성에 직접적인 영향을 주는 coding 영역에 위치하는 것으로 확인되었다.
직립형 지엽각 품종군 및 수평형 지엽각 품종군의 모든 조직에서 Os08g31950의 발현을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. Os08g31950의 잎에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군이 수평형 지엽각 품종군보다 유전자의 발현량이 상대적으로 높았으며 가장 높은 발현율을 나타낸 품종은 Yusin으로 나타났고 가장 낮은 발현율을 나타낸 품종은 동안벼로 나타났으며 두 품종 모두 직립형 지엽각 품종군에 포함되어 있는 것으로 관찰되었다. 한편, Os08g31950의 뿌리에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군에 속해 있는 대부분의 품종이 수평형 지엽각 품종군에 속해 있는 품종들보다 높은 발현량을 나타내었다.
Os08g31950의 조직간 발현 양상을 보면, 잎에서의 유전자 발현량이 뿌리에서의 발현량보다 전체적으로 높게 나타났으며 잎에서 최고 발현량을 나타낸 Yusin의 발현율이 뿌리에서 최고 발현량을 나타낸CARTUNA의 발현율보다 약 2배 가량 높게 나타났다. 또한 Os08g31950 유전자의 품종간 발현 양상을 보면, 수원347호 및, 영덕, 동안, 새누리, TUN SART, CARTUNA, VICTORIA F.
지엽각 관련 특성에 대하여 선행 연구된 QTL region과의 비교를 통하여 본 연구에서 발굴된 SNP간의 유의성을 조사한 결과, 지엽각과 유의성이 있는 SNP (S8-19815442)가 이미 확인된 QTL region에 위치하는 것으로 나타났으며, 후보유전자 Os08g31950 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 형질 특이적 품종군 간의 염기서열을 비교한 결과 1개의 지역에서 단일염기변이가 검출되었다. Os08g31950의 조직별 RNA의 상대적 발현량 수준을 비교한 결과, Os08g31950 유전자는 모든 조직에서 높은 발현량을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 모두 직립형 품종군에서 상대적으로 발현량이 높게 나타났으며 뿌리보다 잎에서의 발현율이 높게 나타났다.
염기서열 비교를 통하여 특정 염기의 삽입(Insert), 결실(Deletion), 치환(Substitution)을 확인한 결과, 직립형 지엽각 품종군과 수평형 지엽각 품종군의 특정 염기서열 부위에 염기치환이 확인되었다. Os08g31950의 직립형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 봉광 및 큰섬, Yusin, 수원 347호, 영덕 등 총5개 품종에서 단일염기서열이 치환된 것을 확인할 수 있었으며 이들 중 대부분은 인티카(Indica) 생태형을 지닌 것으로 나타났다. Os08g31950의 수평형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 직립형 지엽각 품종군과는 다르게 TAI MOCHITO 1개 품종에서만 단일염기치환이 관찰되었으며 TAI MOCHITO의 생태형은 열대자포니카(Tropical Japonica)인 것으로 관찰되었다.
구간별 분포도 조사 결과, 15°＜ x ≤ 20° 이하의 지엽각 구간에서 가장 높은 분포도를 보였으며, 273개 품종 중 베트남에서 기원된 TUN SART이 83.5°로 가장 큰 지엽각을 나타냈고 큰섬이 5°로 가장 작은 지엽각을 나타내었다(Fig. 1).
00 °으로 나타났다. 높은 지엽각을 보인 Os08g31950-Hap1과 Os08g31950-Hap3 그룹은 exon 부분에서 Nipponbare와 유사한 염기를 갖는 반면, 낮은 지엽각을 보인 Os08g31950-Hap2 그룹은 exon 부분에서 Nipponbare의 염기와 비교하였을 때 해당 exon부위가 위치하는 벼 8번 염색체 상의 19,814,759번 위치에서 C에서 T로 변환되었으며 Alanine(GCG)에서 Valine(GTG)으로 아미노산 서열이 바뀌었다. Os08g31950-Hap1 그룹에 속하는 품종은 220개로 지엽각의 범위가 6° ~ 86.
Os08g31950의 조직간 발현 양상을 보면, 잎에서의 유전자 발현량이 뿌리에서의 발현량보다 전체적으로 높게 나타났으며 잎에서 최고 발현량을 나타낸 Yusin의 발현율이 뿌리에서 최고 발현량을 나타낸CARTUNA의 발현율보다 약 2배 가량 높게 나타났다. 또한 Os08g31950 유전자의 품종간 발현 양상을 보면, 수원347호 및, 영덕, 동안, 새누리, TUN SART, CARTUNA, VICTORIA F.A, KENG CHI FU 등 총 8개 품종을 제외한 나머지 12개 품종은 모두 잎에서 유전자의 발현량이 높게 나타났다.
Manhattan plot에서 –logP > 8을 기준으로 볼 때 유의적인 SNP가 탐지됨을 확인할 수 있었으며 벼 염색체 8번에 위치한 해당 SNP(S8_19815442)가 어떤 SNP보다도 유의적인 SNP임을 알 수가 있었다(Table 4). 또한, QQ plot에서는 x축의 기대값 P-value보다 유의적으로 나타난 SNP들에서 관측된 P-value가 더 높은 형태를 취하고 있었으며 이는 발굴된 SNP들이 유의적이라고 볼 수 있으며 해당 형질을 잘 표현하고 있다는 것을 의미한다.
Os08g31950의 조직별 RNA의 상대적 발현량 수준을 비교한 결과, Os08g31950 유전자는 모든 조직에서 높은 발현량을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 모두 직립형 품종군에서 상대적으로 발현량이 높게 나타났으며 뿌리보다 잎에서의 발현율이 높게 나타났다. 본 연구를 통해 동정된 지엽각 연관 후보유전자 Os08g31950는 벼 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 마커제작 및 육종의 기초자료가 될 것으로 기대된다.
한편, Os08g31950의 뿌리에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군에 속해 있는 대부분의 품종이 수평형 지엽각 품종군에 속해 있는 품종들보다 높은 발현량을 나타내었다. 반면 잎에서와는 다르게 가장 높은 발현율을 나타내는 품종은 CARTUNA로 나타났고 가장 낮은 발현율을 나타내는 품종은 BIKOM으로 나타났으며 두 품종 모두 수평형 지엽각 품종군에 포함되어 있는 것으로 관찰되었다.
벼 273점 유전자원 중에서 인디카(Indica) 14점, 자포니카(Japonica) 25점으로 총39개 품종이 직립형으로 나타났고, 열대자포니카(Tropocial Japonica) 9점을 포함한 209개 품종이 반직립형으로 나타났으며, 수평형을 나타내는 품종은 46개 품종이 조사되었다(Table 3). 구간별 분포도 조사 결과, 15°＜ x ≤ 20° 이하의 지엽각 구간에서 가장 높은 분포도를 보였으며, 273개 품종 중 베트남에서 기원된 TUN SART이 83.
벼 염색체 8번체의 high peak 위치를 기준으로 하여 선발된 후보유전자는 Os08g31950으로 haplotype 분석을 실시한 결과, Os08g31950 유전자는 3개의 그룹으로 나뉘었으며 각 그룹의 지엽각 평균은 22.94 °, 21.15 °, 43.00 °으로 나타났다.
본 연구에서 지엽각과 연관성을 보이는 SNP를 탐색한 결과 벼 염색체 8번에 위치한 SNP(S8_19815442)가 지엽 형질과 관련이 있는 QTL region에 유사하게 위치하는 것을 확인하였다(Kobayashi et al. 2003; Cai et al. 2015). 또한, Hu et al.
본 연구에서 지엽각과 연관성을 보이는 SNP를 탐색한 결과 벼 염색체 8번에 위치한 SNP(S8_19815442)가 지엽각의 발현과 연관이 있는 유의적인 SNP로 밝혀졌다(Fig. 3). 이 결과와 관련하여 Kobayashi 등(2003)에 따르면 RIL 집단의 지엽 형질과 관련한 QTL 분석 결과, 9번 염색체를 제외한 11개 염색체에서 총 64개의 QTL이 탐색되었으며 그 중 8번 염색체에서 LOD 4.
Os08g31950의 수평형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 직립형 지엽각 품종군과는 다르게 TAI MOCHITO 1개 품종에서만 단일염기치환이 관찰되었으며 TAI MOCHITO의 생태형은 열대자포니카(Tropical Japonica)인 것으로 관찰되었다. 상기와 같이 발굴된 1개 SNP(S8_19814759)는 아미노산 합성에 직접적인 영향을 주는 coding 영역에 위치하는 것으로 확인되었다. 이와 같이 coding 영역에 위치한 SNP는 아미노산 합성뿐만 아니라 RNA splicing, nucleosome 형태, requlatory motif 등에 영향을 주어 유전자 발현을 조절하며(Castillo-Davis et al.
염기서열 비교를 통하여 특정 염기의 삽입(Insert), 결실(Deletion), 치환(Substitution)을 확인한 결과, 직립형 지엽각 품종군과 수평형 지엽각 품종군의 특정 염기서열 부위에 염기치환이 확인되었다. Os08g31950의 직립형 지엽각 품종군에서의 염기서열 비교를 보면, 봉광 및 큰섬, Yusin, 수원 347호, 영덕 등 총5개 품종에서 단일염기서열이 치환된 것을 확인할 수 있었으며 이들 중 대부분은 인티카(Indica) 생태형을 지닌 것으로 나타났다.
이러한 결과들을 종합해 볼 때 벼 resequencing 294점에 대한 GWAS 분석 결과를 통해 얻은 후보유전자 Os08g31950의 exon 영역의 SNP 유저자형은 지엽의 형태 발달에 관여하는 QTL 좌위와 유의적 연관성이 있는 것으로 추정되고 있으며, 직립형 지엽각 품종군 및 수평형 지엽각 품종군에서 Os08g 31950의 서로 다른 발현 양상으로 미루어 볼 때 품종간 지엽각 차이에 상당한 영향을 줄 가능성이 있다고 판단된다.
이와 관련하여 본 연구에서는 ‘S8-19815442’ SNP가 이미 확인된 QTL region(17.44 Mbp ~ 26.91 Mbp)에 유사하게 위치하는 것을 확인하였다.
표현형 데이터를 이용한 GWAS의 Manhattan plot 결과 분석을 통해, 각 집단에서 염색체를 대상으로 표현형과 통계적 유의성을 나타내 연관성을 보이는 SNP를 발굴하였다. 지엽각 관련 특성에 대하여 선행 연구된 QTL region과의 비교를 통하여 본 연구에서 발굴된 SNP간의 유의성을 조사한 결과, 지엽각과 유의성이 있는 SNP (S8-19815442)가 이미 확인된 QTL region에 위치하는 것으로 나타났으며, 후보유전자 Os08g31950 대해 연관 유전자 변이를 관찰하기 위해서 형질 특이적 품종군 간의 염기서열을 비교한 결과 1개의 지역에서 단일염기변이가 검출되었다. Os08g31950의 조직별 RNA의 상대적 발현량 수준을 비교한 결과, Os08g31950 유전자는 모든 조직에서 높은 발현량을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다.
본 연구에서 발굴된 유의적인 SNP들 중 –logP > 8 에 해당하는 SNP들에 대해 주변 지역에서 NCBI data base를 통하여 후보유전자를 탐색하였고, 그 중 관련 있는 후보유전자들을 선발하였다. 지엽각에 대하여 유의성이 높은 SNP S8_19815381 및 SNP S8_19879513 사이의 약 64 Kb 구간에서 13개의 유전자가 관찰되었다. 그 부위에서 Os08g31950.
직립형 지엽각 품종군 및 수평형 지엽각 품종군의 모든 조직에서 Os08g31950의 발현을 확인할 수 있었으며 조직별로 다양한 발현 양상을 관찰할 수 있었다. Os08g31950의 잎에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군이 수평형 지엽각 품종군보다 유전자의 발현량이 상대적으로 높았으며 가장 높은 발현율을 나타낸 품종은 Yusin으로 나타났고 가장 낮은 발현율을 나타낸 품종은 동안벼로 나타났으며 두 품종 모두 직립형 지엽각 품종군에 포함되어 있는 것으로 관찰되었다.
총6,243,699개의 SNP들 중, read depth가 4× 이상, 200× 이하이며 MAF > 0.05, genotyping quality ≥ 20, Hardy-Weinberge equilibrium(P-value ≤ 0.001)를 만족시키는 1,842,515개(전체 SNP의 29.50%)의 SNP를 확인할 수 있었다.
Os08g31950의 잎에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군이 수평형 지엽각 품종군보다 유전자의 발현량이 상대적으로 높았으며 가장 높은 발현율을 나타낸 품종은 Yusin으로 나타났고 가장 낮은 발현율을 나타낸 품종은 동안벼로 나타났으며 두 품종 모두 직립형 지엽각 품종군에 포함되어 있는 것으로 관찰되었다. 한편, Os08g31950의 뿌리에서의 발현 양상을 보면, 직립형 지엽각 품종군에 속해 있는 대부분의 품종이 수평형 지엽각 품종군에 속해 있는 품종들보다 높은 발현량을 나타내었다. 반면 잎에서와는 다르게 가장 높은 발현율을 나타내는 품종은 CARTUNA로 나타났고 가장 낮은 발현율을 나타내는 품종은 BIKOM으로 나타났으며 두 품종 모두 수평형 지엽각 품종군에 포함되어 있는 것으로 관찰되었다.
후속연구
따라서, 본 연구를 통하여 벼 유전자원 집단의 다양한 농업 형질과의 관련성 분석 및 유전적 지표인자 발굴에 도움이 될 것이며 이를 통해 분자유전학적 기법을 이용한 광합성 효율과 관련된 지엽(Cho et al. 1975)의 벼 육종전략을 확립하는데 기초 자료가 되는 것은 물론 유전자원 보존 및 분자육종학적인 연구에 기초 자료로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 모두 직립형 품종군에서 상대적으로 발현량이 높게 나타났으며 뿌리보다 잎에서의 발현율이 높게 나타났다. 본 연구를 통해 동정된 지엽각 연관 후보유전자 Os08g31950는 벼 생육 및 수량 증대에 이용할 수 있는 마커제작 및 육종의 기초자료가 될 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
차세대 염기서열 분석(NGS)이란?
차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전체를 수많은 조각으로 나눈 뒤 각각의 염기서열을 조합하여 게놈을 해독하는 기술로써, 지난 십년간 그 분석기술이 비약적으로 발전해왔으며 식물육종분야에 있어서 새로운 혁명을 초래하고 있다(Perezde-Castro et al. 2012; Blawid et al.
NGS 장비의 발달의 효과는?
2017). NGS 장비의 발달은 많은 주요 작물들에 대한 게놈 정보의 해독을 가속화시키고 있으며, 다양한 작물에서 재래종, 야생종 등 resequencing 분석 이나 GBS (genotyping by sequencing)등의 분석 방법으로 데이터를 대량 생산하고 있다. 또한, 벼 유전체 해독 프로젝트 (IRGSP)에 의해 벼의 게놈 해독이 완료됨으로써 표준게놈을 기반으로 한 GWAS를 수행하여 SNP, InDel 등을 단기간에 개발할 수 있게 되었다(Huang et al.
SNP(S8_19815442)의 지엽각의 발현과 관련있는 연구 결과는 어떤 것이 있는가?
3). 이 결과와 관련하여 Kobayashi 등(2003)에 따르면 RIL 집단의 지엽 형질과 관련한 QTL 분석 결과, 9번 염색체를 제외한 11개 염색체에서 총 64개의 QTL이 탐색되었으며 그 중 8번 염색체에서 LOD 4.1로 RFLP 마커인 XNpb187과 XNpb135사이의 엽각 관련 QTL이 발굴되었다. 또한 Cai et al. (2015)에 따르면 ‘인디카/자포니카’ 조합 DH 집단을 이용한 유전자 지도 작성에서 총 30개의 QTL이 탐색되었으며 1번, 2번, 6번, 7번, 8번, 9번, 12번 염색체에서 각각 LOD 값 2 이상의 엽각 관련 QTL이 발굴되었다. 이와 관련하여 본 연구에서는 ‘S8-19815442’ SNP가 이미 확인된 QTL region(17.44 Mbp ~ 26.91 Mbp)에 유사하게 위치하는 것을 확인하였다.
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