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문제 정의
- 본 연구는 기존에 보고된 MdMYB10 유전자에서 유래한 SNP 분자표지 외에 사과 과육색을 구분할 수 있는 조기선발 분자표지의 개발을 위해 적색 과육 사과 품종 ‘Redfield’와 녹색 과육 사과 품종 ‘Granny Smith’의 EST 분석 결과를 바탕으로(Kim et al. 2015) anthocyanin 발현에 관여하는 유전자들을 비교 분석하였다.
- 사과는 재식 후 2~3년이 경과되어야 과실의 특성을 볼 수 있기 때문에 적육계 계통 선발을 위한 교배 집단에서 분자표지의 개발은 육종 연한을 단축시킬 수 있는 중요한 수단이다. 본 연구에서는 고부가 기능성 품종으로 사과 적육계 계통을 육성하기 위해 전사체 분석방법으로 적육계와 백육계에서 차등으로 발현되는 유전자들을 분석하였고, HRM 방법을 이용한 SNP 분자표지를 개발하여 사과 유전자원 21품종에 적용하므로써 과육색을 구분할 수 있는 분자표지의 가능성을 검토하였다. 앞으로 anthocyanin의 내재생합성 조절 기작에 대한 연구를 통해 기존에 보고되지 않은 새로운 유색관련 분자표지를 개발하고 이를 다양한 유전자원과 교배집단에 적용하여 육종연한을 단축할 수 있는 방향을 제시하고자 한다.
- ‘Redfield’와‘Granny Smith’의 EST database로부터 103쌍의 단일염기다형성(SNP) 분자표지를 선발하였고, 붉은 색 과육 품종 10개와 백색 과육 품종 11개를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 HRM 방법으로 분석하였다. 본 연구에서는 사과 EST database를 기반으로 HRM 분석 방법을 이용하여 사과 품종의 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 효율적인 SNP 분자표지를 개발하였다. 이러한 SNP 분자표지는 사과육종에 유용하게 사용할 수 있으며 사과 품종의 다양한 색 변화에 관한 분자 기작 연구에 좋은 참고자료가 될 수 있을 것이다.
- 본 연구의 목적인 적색 과육 사과 품종과 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하기 위해서 사과 NGS 데이터를 참조 제놈에 매핑하여 genome wide SNP를 찾고, 적색 과육 품종인 ‘Redfield’와 백색 과육 품종인 ‘Granny Smith’에서 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP를 선발하였다.
제안 방법
- ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’ 간에 탐색되는 polymorphism SNP554개 중에서 103개의 프라이머 조합을 이용하여 HRM 분석을 하였다(Table 2).
- ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’에서 찾은 SNP를 매트릭스로 만들어 변이 과정을 거친 후, 동형 SNP와 이형 SNP로 나누어 정리하였고(Table 1) SNP 선발 조건은 3 이상으로 하였다.
- ‘Redfield’와‘Granny Smith’의 EST database로부터 103쌍의 단일염기다형성(SNP) 분자표지를 선발하였고, 붉은 색 과육 품종 10개와 백색 과육 품종 11개를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 HRM 방법으로 분석하였다.
- 2015) anthocyanin 발현에 관여하는 유전자들을 비교 분석하였다. HRM 기술을 사용하여 적색 과육 사과 품종과 백색 과육 사과 품종의 PCR 증폭산물에서 한 개의 서로 다른 염기서열을 구분하여 분리할 수 있는 SNP 위치를 확인하였다. 적색 과육 발현에 관련한 특이적 SNP 분자표지를 탐색하여 사과 유전자원 중 적색 과육 품종과 백색 과육 품종을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하였고, 이러한 분자표지의 개발은 적색 과육 사과 품종의 육종 기한을 단축시키고 교배 육종의 효율성을 높이는데 이용할 수 있을 것이다.
- HRM 분석(Wittwer et al. 2003)에 필요한 프라이머 제작을 위해 참조한 제놈과 주석 정보는 JGI Phytozome에서 사과(Malus domestica) 제놈 데이터를 받았고 7500 Fast Real-time PCR machine (Applied BioSystems)을 사용하여 수행하였다. HRM분석을 위한 gDNA 추출은 적색 과피, 적색 과육 사과 10 품종 Redfield, Jay Darling, Pink Wood, Makamilk, May Pole, Okanagan, Red Flesh, M.
- 2003)에 필요한 프라이머 제작을 위해 참조한 제놈과 주석 정보는 JGI Phytozome에서 사과(Malus domestica) 제놈 데이터를 받았고 7500 Fast Real-time PCR machine (Applied BioSystems)을 사용하여 수행하였다. HRM분석을 위한 gDNA 추출은 적색 과피, 적색 과육 사과 10 품종 Redfield, Jay Darling, Pink Wood, Makamilk, May Pole, Okanagan, Red Flesh, M. pumila Royalty, Crimson Glory, Purple Wave, 백색 과육 사과 11 품종, Granny Smith, Court Pendu, Priam, End Blue Green, Mutsu, Northwest Greening, Lodi, Kinsei, Tumange, Bulmer Normern, Amere에서 잎을 채취하여 DNeasy Plant kit (Qiagen)을 사용하여 gDNA를 분리하였다(Prince et al. 1997). 추출한 DNA는 NanoDropⓇ ND-1000 (Nanodrop Technologies, USA)를 이용하여 정량하고 최종 농도가 20 ng이 되도록 희석하였다.
- MdMYB10 유전자에서 유래한 기존의 SNP 분자표지 개발 방법은 MdMYB10 유전자의 인트론 부분의 4개의 염기서열에서 indel을 발견하여 SNP 분자표지로 개발하였으며(Chagne et al. 2007) 본 연구에서는 기존에 알려진 anthocyanin pathway에 관여하는 유전자뿐만 아니라 다른 기작에 의해서도 사과 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 개발하고자 RNA-Seq data를 사용하였다. 본 연구에서 개발한 2개의 SNP 분자표지가 적육계 사과 품종과 백육계 사과 품종을 구분할 수 있는 정확한 기작에 대해서는 앞으로 연구를 계속 진행해야 할 것이다.
- One mg의Total RNA의 최종 부피를 500 µL로 맞춘 후 65°C에서 10분간 저장 후 3 µL의 biotinylated oligo (dT)probe와 13 µL의 20ⅹSSC를 첨가 후 상온에 저장하였다.
- Redfield’와 ‘Granny Smith’ 전사체 분석 결과에서 찾은 SNP를 매트릭스로 만들어 변이 과정을 거친 후 동형(homozygous) SNP와 이형(heterozygous) SNP로 나누었고, SNP 선발 조건은 3 이상으로 하였다.
- One mg의Total RNA의 최종 부피를 500 µL로 맞춘 후 65°C에서 10분간 저장 후 3 µL의 biotinylated oligo (dT)probe와 13 µL의 20ⅹSSC를 첨가 후 상온에 저장하였다. SAPMPs (streptavidin paramagnetic particles)이 튜브 안에서 완전하게 섞이도록 한 후에 magnetic stand에 세워서 입자를 분리하고, total RNA와 혼합하여 10분 동안 저장 후에 magnetic stand에서 0.3 ml의 0.1ⅹSSC로 4번 세척한 뒤에 0.1 mL의 DEPC 처리한 멸균수를 첨가하였다.
- 과육색이 다르게 발현되는 사과(Malus domestica L.) 품종의 유전자 발현을 비교하기 위해 2개의 cDNA library를 제작하였다. 붉은 색 과육 품종인 ‘Redfield’와 백색 과육 품종인‘Granny Smith’의 유전자 발현 차이를 보기 위해 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 사용하였고 두 품종으로부터 얻은 EST의 염기서열을 결정하고 기존에 보고된 유전자와의 상동성을 분석하였다.
- 마지막으로 95°C에서 10초간 변성 반응을 시킨 후, 60°C에서 95°C까지 0.2°C씩 올리면서 각 온도에서 5초간 유지하는 동안 형광을 측정하여 HRM melting 그래프를 그렸다.
- 분쇄한 3 g의 시료에 15 mL의 추출용액(2% CTAB, 2% PVP, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 2.0 M NaCl, 0.05% spermidine, 2% β-mercaptoethanol 사용 직전에 첨가)을 첨가하였다.
- 붉은 색 과육 품종인 ‘Redfield’와 백색 과육 품종인‘Granny Smith’의 유전자 발현 차이를 보기 위해 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 사용하였고 두 품종으로부터 얻은 EST의 염기서열을 결정하고 기존에 보고된 유전자와의 상동성을 분석하였다.
대상 데이터
- ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’의 SNP 비교분석은 동일한 SNP 위치에서 두 시료 간에 서로 동형 SNP인 경우만을 선발하였고, 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개가 선발되었다.
- ‘Redfield’의 총read 수는 353,980이며 총 염기서열 길이는 213,441,953이고, read의 평균 염기서열 길이는 602.98 bp로 전사체 대비 범위가 3×이고, raw reads 대비 확보된 수치가 44.89%로 총 95,811,160 bp를 분석에 사용하였다.
- 15000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 분리한 후 2배의 에탄올 첨가 후에 -70°C에서 40분 동안 저장 후 DEPC 처리한 멸균수에 녹였다. Total RNA로부터 mRNA를 분리하기 위해 polyA Tract mRNA isolation kit (Promega. USA)를 사용하였다. 다당류를 제거하기 위해 oligo (dT) 컬럼을 사용하는 대신에 biotinylated oligo (dT)와 paramagnetic particles을 사용하였다.
- USA)를 사용하였다. 다당류를 제거하기 위해 oligo (dT) 컬럼을 사용하는 대신에 biotinylated oligo (dT)와 paramagnetic particles을 사용하였다. One mg의Total RNA의 최종 부피를 500 µL로 맞춘 후 65°C에서 10분간 저장 후 3 µL의 biotinylated oligo (dT)probe와 13 µL의 20ⅹSSC를 첨가 후 상온에 저장하였다.
- 본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에 재식되어 있는 적색 과피, 적색 과육 사과 품종, ‘Redfield’와 녹색 과피, 백색 과육 사과 품종인 ‘Granny Smith’ 과실을 시기별로 채취하여 액체질소를 사용하여 분쇄하였다.
- 참조한 제놈의 유전자는 선택적인 splicing form을 포함하고 있기 때문에 한 개의 SNP 위치는 한 개 이상의 전사체에 포함될 수 있으며 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개를 포함하는 전사체수는 323개 이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개 이다. 이후 GO 분석 및 SNP 프라이머 디자인은 다형성을 나타내는 SNP 554개만을 사용하여 분석을 진행하여 103개의 프라이머를 제작하였다.
- 본 연구의 목적인 적색 과육 사과 품종과 백색 과육 사과 품종을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하기 위해서 사과 NGS 데이터를 참조 제놈에 매핑하여 genome wide SNP를 찾고, 적색 과육 품종인 ‘Redfield’와 백색 과육 품종인 ‘Granny Smith’에서 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP를 선발하였다. 참조 제놈과 주석 정보는 JGI Phytozome에서 사과(Malus domestica) 제놈을 사용하였고, 사용한 염기서열은 881,278,625 bp이고 전사체 수는 63,517개, 전사체의 총 염기서열은 71,132,322 bp이다. ‘Redfield’의 총read 수는 353,980이며 총 염기서열 길이는 213,441,953이고, read의 평균 염기서열 길이는 602.
- jsp)에서 제공하는 Gene Ontology Annotation Tool을 사용하였다. 참조한 제놈의 유전자는 선택적인 splicing form을 포함하고 있기 때문에 한 개의 SNP 위치는 한 개 이상의 전사체에 포함될 수 있으며 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개를 포함하는 전사체수는 323개 이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개 이다. 이후 GO 분석 및 SNP 프라이머 디자인은 다형성을 나타내는 SNP 554개만을 사용하여 분석을 진행하여 103개의 프라이머를 제작하였다.
이론/모형
- ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’의 SNP 비교분석은 동일한 SNP 위치에서 두 시료 간에 서로 동형 SNP인 경우만을 선발하였고, 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개가 선발되었다. GO분석은 TAIR10_ID을 이용하여 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp)에서 제공하는 Gene Ontology Annotation Tool을 사용하였다. 참조한 제놈의 유전자는 선택적인 splicing form을 포함하고 있기 때문에 한 개의 SNP 위치는 한 개 이상의 전사체에 포함될 수 있으며 두 시료 간에 탐색되는 다형성을 나타내는 SNP 554개를 포함하는 전사체수는 323개 이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개 이다.
- 본 연구에 사용한 재료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에 재식되어 있는 적색 과피, 적색 과육 사과 품종, ‘Redfield’와 녹색 과피, 백색 과육 사과 품종인 ‘Granny Smith’ 과실을 시기별로 채취하여 액체질소를 사용하여 분쇄하였다. 만개 후 7주에 과실을 수확하였고, RNA 분리 방법은 Pine Tees Methods (Shujun et al. 1993)에 따라서 다음과 같이 수행하였다. 분쇄한 3 g의 시료에 15 mL의 추출용액(2% CTAB, 2% PVP, 100 mM Tris-HCl pH 8.
성능/효과
- ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’ 간에 탐색되는 SNP 554개의 주석(JGI Phytozome)을 찾은 결과 전사체 수는 323개이고, TAIR10_ID 기준으로는 288개이다.
- ‘Redfield’와 ‘Granny Smith’의 SNP 비교분석은 동일한 SNP 위치에서 두 품종간에 서로 동형 SNP인 경우만을 선발하였고, 그 결과 다형성을 나타내는 SNP 554개가 선발되었다.
- 이 유전자로부터 유래한 SNP 분자표지는 사과 적색 과육 품종 10개와 백색 과육 11품종이 구분되지 않았다. 과육 색에 따른 21품종의 사과를 적색과 백색 2군으로 구분할 수 있는 SNP 분자표지는 2종이었다(Fig. 1). SNP ID, MDC000453.
- 103개의 SNP 분자표지의 유전자 정보를 분석하여 탐색한 색소 생성과 관련된 유전자는 carotenoid cleavage dioxygenase1으로 C40 carotenoids의 이중결합을 분해하여 다양한 apocarotenoids을 생성하는 기능을 가지고 있다(Floss and Walter 2009). 이 유전자로부터 유래한 SNP 분자표지는 사과 적색 과육 품종 10개와 백색 과육 11품종이 구분되지 않았다. 과육 색에 따른 21품종의 사과를 적색과 백색 2군으로 구분할 수 있는 SNP 분자표지는 2종이었다(Fig.
- 이 유전자의 기능은 색소 생성과는 직접적으로 관계가 없지만 ‘Redfield’에서는 G 염기서열이 ‘Granny Smith’에서 A로 바뀌어서 적색 과육 사과 10품종과 백색 과육 사과 11품종을 구분할 수 있었다(Fig. 1A).
- 참조 제놈 대비, 배열 결과 ‘Redfield’는 정리된 read 중에서 73.52%의 read가 매핑되었고, ‘Granny Smith’는 71.71%의 read가 매핑되었다.
후속연구
- 본 연구에서 개발한 2개의 SNP 분자표지가 적육계 사과 품종과 백육계 사과 품종을 구분할 수 있는 정확한 기작에 대해서는 앞으로 연구를 계속 진행해야 할 것이다. 또한 더 많은 유전자원과 교배집단에 적용하여 분자표지로서의 가능성이 있는지 확인할 필요가 있다. HRM 분석 방법에 의한 SNP 분자표지 개발은 재현성 실험 결과가 확보되어야 하고, 구분하고자 하는 개체수가 많을수록 정확성이 높다고 볼 수 있다.
- 2007) 본 연구에서는 기존에 알려진 anthocyanin pathway에 관여하는 유전자뿐만 아니라 다른 기작에 의해서도 사과 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 SNP 분자표지를 개발하고자 RNA-Seq data를 사용하였다. 본 연구에서 개발한 2개의 SNP 분자표지가 적육계 사과 품종과 백육계 사과 품종을 구분할 수 있는 정확한 기작에 대해서는 앞으로 연구를 계속 진행해야 할 것이다. 또한 더 많은 유전자원과 교배집단에 적용하여 분자표지로서의 가능성이 있는지 확인할 필요가 있다.
- 본 연구에서는 고부가 기능성 품종으로 사과 적육계 계통을 육성하기 위해 전사체 분석방법으로 적육계와 백육계에서 차등으로 발현되는 유전자들을 분석하였고, HRM 방법을 이용한 SNP 분자표지를 개발하여 사과 유전자원 21품종에 적용하므로써 과육색을 구분할 수 있는 분자표지의 가능성을 검토하였다. 앞으로 anthocyanin의 내재생합성 조절 기작에 대한 연구를 통해 기존에 보고되지 않은 새로운 유색관련 분자표지를 개발하고 이를 다양한 유전자원과 교배집단에 적용하여 육종연한을 단축할 수 있는 방향을 제시하고자 한다.
- 본 연구에서는 사과 EST database를 기반으로 HRM 분석 방법을 이용하여 사과 품종의 적육계와 백육계를 구분할 수 있는 효율적인 SNP 분자표지를 개발하였다. 이러한 SNP 분자표지는 사과육종에 유용하게 사용할 수 있으며 사과 품종의 다양한 색 변화에 관한 분자 기작 연구에 좋은 참고자료가 될 수 있을 것이다.
- HRM 기술을 사용하여 적색 과육 사과 품종과 백색 과육 사과 품종의 PCR 증폭산물에서 한 개의 서로 다른 염기서열을 구분하여 분리할 수 있는 SNP 위치를 확인하였다. 적색 과육 발현에 관련한 특이적 SNP 분자표지를 탐색하여 사과 유전자원 중 적색 과육 품종과 백색 과육 품종을 구분할 수 있는 분자표지를 개발하였고, 이러한 분자표지의 개발은 적색 과육 사과 품종의 육종 기한을 단축시키고 교배 육종의 효율성을 높이는데 이용할 수 있을 것이다.
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