[논문]Acidovorax avenae subsp. citrulli에 의한 멜론 과실썩음병

서상태; 박종한; 이중섭; 한경숙; 정승룡

doi:10.5423/rpd.2006.12.3.185

Acidovorax avenae subsp. citrulli에 의한 멜론 과실썩음병
Bacterial Fruit Blotch of Melon Caused by Acidovorax avenae subsp. citrulli 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.12 no.3, 2006년, pp.185 - 188

서상태 (원예연구소 원예환경과) , 박종한 (원예연구소 원예환경과) , 이중섭 (원예연구소 원예환경과) , 한경숙 (원예연구소 원예환경과) , 정승룡 (원예연구소 원예환경과)

초록
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2005년 전남 나주와 광주의 멜론 재배포장에서 잎맥을 따라 갈색으로 변색되면서 시드는 증상이 관찰되었고, 과실 표면에는 점무늬의 수침상이 형성되며 과실 내부는 갈색으로 썩는 증상이 관찰되었다. 잎과 과실의 병반부로부터 2개의 세균을 분리하여 생리생화학적 실험, 유전적 실험 및 병원성 실험 결과 Acidovorax avenae subsp. citrulli로 동정되었다. 이 보고는 국내에서 최초이며, 이 병을 멜론 과실썩음병으로 명명할 것을 제안한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In September and October 2005, melons(Cucumis melo L.) from the commercial greenhouses in Naju and Gwangju exhibited severe foliar necrosis and fruit rot. Leaf symptoms initially appeared as V-shaped, necrotic lesions and extending to the midrib. Symptoms on the fruit were occurred randomly as necrotic and sunken spots. Two isolates from diseased leaves and fruits were identified as Acidovorax avenae subsp. citrulli on the basis of bacteriological and genetic characteristics. Pathogenicity of the isolates was confirmed by inoculating on 3-week-old melon and cucumber seedlings. This is the first report of bacterial fruit blotch of melon in Korea.

주제어

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문제 정의

citmlli에 의한 식물병 발생 보고는 송 등(1991)에 의해 전북 고창의 수박 재배지에서 처음 보고되었으나, 다른 박과 작물에서의 발생 보고는 없었다. 본 연구에서는 전남 광주와 나주지역에서 재배되고 있는 멜론으로부터 과실썩음병균을 분리하여 생리 생화학적 방법, 분자유전학적 방법 및 병원성 검정을 통하여 동정한 결과를 보고한다.
citrulli로 동정되었다. 이 보고는 국내에서 최초이며, 이 병을 멜론 과실썩음병으로 명명할 것을 제안한다.

제안 방법

세균을 TSBA 배지(BD211825) 에서 48시간 배양 후 GN/GP-IF 용액에 현탁시켜 GN₂ microplate(BIOLOG GN₂ MicroPlate™)에 분주하였다. 24 시간과 48시간 배양 후 MicroLog Gram-negative database (Version 4.02)를 이용하여 동정하였다.
)과 오이 (Cucumis sativus L.) 잎에 분무접종 후 28^。C습실항온기에서 1일 배양 후 유리온실로 옮겨 3일 후 병원성을 관찰하였다.
분리된 세균을 동정하기 위해 Walcott와 Gitaitis (2000)가 보고한 종특이적 primer(WFBl, WFB2)를 이용하여 PCR을 실시한 후 증폭산물의 유무를 조사하였다. PCR 반응은 Takara PCR thermal cycler MP(Takara, Japan) 를 이용하였으며, PCR 반응액은 2ul의 DNA, 2.5U Tag polymerase(Takara, Japan), 100 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KC₁, 각각의 dNTP 0.2 mM, primer 50 pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25ul 로 조절하였다. PCR은 초기 변성화 반응(951, 5분), 30 회의 증폭반응(94°C, 30초; 58°C, 30초; 72°C, 45초), 최종확장반응(721, 10분) 조건으로 수행하였다.
2 mM, primer 50 pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25ul 로 조절하였다. PCR은 초기 변성화 반응(951, 5분), 30 회의 증폭반응(94°C, 30초; 58°C, 30초; 72°C, 45초), 최종확장반응(721, 10분) 조건으로 수행하였다.
병원세균의 전자현미경 관찰. YPDA 배지에서 48시간 배양한 콜로니를 0.5% potassium phosphotungstate로 염색 후 투과전자현미경 (LEO 906E)으로 관찰하였다.
avenae subsp. citrulli 로 동정하였으며, 멜론 과실썩음병으로 명명할 것을 제안한다.
실험에 이용된 균주들의 DNA는 InstaGene matrix(Bio-Rad)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 분리하였고, -2(rc에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리된 세균을 동정하기 위해 Walcott와 Gitaitis (2000)가 보고한 종특이적 primer(WFBl, WFB2)를 이용하여 PCR을 실시한 후 증폭산물의 유무를 조사하였다. PCR 반응은 Takara PCR thermal cycler MP(Takara, Japan) 를 이용하였으며, PCR 반응액은 2ul의 DNA, 2.
준하여 실시하였다. 세균을 TSBA 배지(BD211825) 에서 48시간 배양 후 GN/GP-IF 용액에 현탁시켜 GN₂ microplate(BIOLOG GN₂ MicroPlate™)에 분주하였다. 24 시간과 48시간 배양 후 MicroLog Gram-negative database (Version 4.
분리된 세균은 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 특성을 조사하였다. 세균을 동정하기 위해 그람염색, KB 배지에서의 형광유무, NBY 배지에서의 색소 형성 여부 등을 조사하였다.

대상 데이터

유전적 특성조사. 실험에 이용된 균주들의 DNA는 InstaGene matrix(Bio-Rad)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 분리하였고, -2(rc에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리된 세균을 동정하기 위해 Walcott와 Gitaitis (2000)가 보고한 종특이적 primer(WFBl, WFB2)를 이용하여 PCR을 실시한 후 증폭산물의 유무를 조사하였다.

데이터처리

)로 정제하였다. 염기서열 분석은 ALF-Express automatic sequencer (Pharmacia Biotech, Lyon, France)를 이용하였고, 염기서열 비교분석은 NCBI BLAST search 프로그램을 활용하였다.

이론/모형

16S rRNA 유전자는 universal primer인 fDl, rP2를 이용하여 William 등(1991)이 제시한 조건에 의해 증폭하였고, 증폭된 PCR 산물은 Ultra clean kit(Mobio Co.)로 정제하였다. 염기서열 분석은 ALF-Express automatic sequencer (Pharmacia Biotech, Lyon, France)를 이용하였고, 염기서열 비교분석은 NCBI BLAST search 프로그램을 활용하였다.
Biolog system을 이용한 동정은 Lee 등(2005)이 보고한 방법에 준하여 실시하였다. 세균을 TSBA 배지(BD211825) 에서 48시간 배양 후 GN/GP-IF 용액에 현탁시켜 GN₂ microplate(BIOLOG GN₂ MicroPlate™)에 분주하였다.
병원세균의 생리적 특성조사. 분리된 세균은 Schaad 등(2001)의 방법에 따라 특성을 조사하였다. 세균을 동정하기 위해 그람염색, KB 배지에서의 형광유무, NBY 배지에서의 색소 형성 여부 등을 조사하였다.

성능/효과

Aac 91 균주를 전자현미경으로 관찰한 결과 크기가 약 0.5-0.8X1.530 um였으며, 1개의 단극모를 가지고 있었다 (Fig. 1QH). Walcott와 Gitaitis(2000)가 보고한 종특이적 primer(WFBl, WFB2)> 이용하여 PCR을 실시한 결과 Aac 91, Aac 92 균주 모두 360bp의 유전자가 증폭되어 생리 생화학적 실험에 의한 동정결과와 일치했다(Fig.
ID). 이러한 병징을 나타내는 멜론 잎과 과실의 병환부에서 Aac 91과 Aac 92 균주를 분리하여 온실에서 병원성을 조사한 결과 멜론 잎에서는 분무 접종 3일 후 포장에서의 병징과 유사한 병징을 관찰할 수 있었으며(Fig. IE), 오이 잎에서도 점무늬의 병반을 나타내는 병원성이 확인되었다(Fig. IF).
이상의 생리생화학적 실험, 전자현미경 관찰, 종특이적 primer를 이용한 PCR 실험 및 병원성 실험을 종합한 결과 본 실험에서 분리한 병원세균을 A. avenae subsp. citrulli 로 동정하였으며, 멜론 과실썩음병으로 명명할 것을 제안한다.

참고문헌 (11)

Isakeit, T., Black, M. C., Barnes, L. W. and Jones, J. B. 1997. First report of infection of honeydew with Acidovorax avenae subsp. citrulli. Plant Dis. 81: 694
Latin, R. X. and Rane, K. K. 1990. Bacterial fruit blotch of watermelon in Indiana. Plant Dis. 74: 331
Langston, D. B., Jr., Walcott, R. D., Gitaitis, R. D. and Sanders, F. H., Jr. 1999. First report of a fruit rot of pumpkin caused by Acidovorax avenae pv. citrulli in Georgia. Plant Dis. 83: 199
Lee, S. D., Lee, J. H., Kim, Y. K., Heu, S. G. and Ra, D. S. 2005. Bacterial blight of sesame caused by Xanthomonas campestris pv. sesami. Res. Plant Dis. 11: 146-151

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Martin, H. L., O'Brien, R. G. and Abbott, D. V. 1999. First report of Acidovorax avenae subsp. citrulli as a pathogen of cucumber. Plant Dis. 83: 965
Schaad, N. W., Jones, J. B. and Chun, W. 2001. Plant pathogenic bacteria. 3rd ed. APS Press, Minnesota, USA
Song, W. Y., Kim, H. M., So, I. Y. and Kang, Y. K. 1991. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli: The causal agent of bacterial fruit blotch rot on watermelon. Korean J. Plant Pathol. 7: 177-182
Sowel, G., Jr. and Schaad, N. W. 1979. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli on watermelon: Seed transmission and resistance of plant introductions. Plant Dis. Rep. 63: 437- 441
Walcott, R. R., Fessehaie, A. and Castro, A. C. 2004. Differences in pahtogenicity between two genetically distinct groups of Acidovoarax avenae subsp. citrulli on cucurbit hosts. J. Phytopathol. 152: 277-285

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Walcott, R. R. and Gitaitis, R. D. 2000. Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in watermelon seed using immunomagnetic separattion and the polymerase chain reaction. Plant Dis. 84: 470-474

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William, G. W., Susan, M. B., Date, A. P. and David, J. L. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 173: 697-703

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