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박과 작물에 과일썩음병을 일으키는 Acidovorax citrulli 검출을 위한 nested-PCR 검사법 개발
Development of Nested-PCR Assay to Detect Acidovorax citrulli, a Causal Agent of Bacterial Fruit Blotch at Cucurbitaceae 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.21 no.2, 2015년, pp.74 - 81  

김영탁 ((주)농우바이오) ,  박경수 ((주)농우바이오) ,  김혜성 ((주)농우바이오) ,  이혁인 (농림축산검역본부) ,  차재순 (충북대학교 식물의학과)

초록
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박과 작물에서 과일썩음병(bacterial fruit blotch)을 일으키는 Acidovorax citrulli를 종자로부터 검출하기 위한 특이적이고 민감한 nested-PCR 방법을 개발하였다. 본 연구에서는 Next Generation Sequencing을 이용하여 draft genome sequencing을 얻은 후 이를 분석하여 PCR 프라이머를 디자인하였고, 이들 프라이머의 A. citrulli에 대한 특이성을 확인하여 Ac-ORF 21F/Ac-ORF 21R의 nested PCR 프라이머를 최종 선발하였다. Ac-ORF 21F/Ac-ORF 21R는 오직 A. citrulli에서만 특이적으로 140bp 크기의 DNA를 증폭하였으며, 그 검출민감도는 1차 PCR 검출한계(10 ng genomic DNA/PCR)보다 검출한계를 10,000배 증가시켰다. 개발된 nested-PCR 방법을 통해 병원균을 인공접종한 수박 종자의 외부검사에서 $10^1cfu/ml$까지 인공 접종 한 모든 종자 시료에서 병원균을 검출하였고, 병원균을 인공접종 한 수박 종자의 내부검사에서는 병원균이 검출되지 않았다. 자연 감염 수박 종자의 외부검사에서는 10개의 반복 시료 중 2개에서, 그리고 종자 내부검사에서는 10개의 반복 시료 중 5개에서 A. citrulli를 검출하였다. 본 연구에서 개발한 nested-PCR은 특이성과 민감도가 높고 인공접종과 자연감염 수박 종자에서도 병원균의 검출이 가능하여 박과 작물의 종자로부터 A. citrulli를 검출하는데 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

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The specific and sensitive nested-PCR method to detect Acidovorax citrulli, a causal agent of bacterial fruit blotch on cucurbitaceae, was developed. PCR primers were designed from the draft genome sequence which was obtained with the Next Generation Sequencing of A. citrulli KACC10651, and the nest...

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

  • 따라서 본 연구에서는 실제 박과 작물의 종자검사에 적용이 가능한 특이적이고 민감도가 높은 A. citrulli 검출법을 개발하고자 하였다. 개발된 nested-PCR 프라이머는 A.
  • 감귤 궤양병균 검출을 위한 LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)의 경우 검출한계가 genomic DNA 농도로 10 fg(Rigano 등, 2010) 보고되었는데, 본 연구결과로 얻은 nested-PCR의 검출한계는 이와 유사하거나 조금 더 민감한 방법으로 판단된다. 본 연구에서 개발된 nestedPCR을 인공접종 종자와 자연 감염 종자를 이용하여 종자 검사에 적용하여 상업적으로 이용 가능한지 확인하였다. 인공접종 종자의 외부 검사에서는 101 cfu/ml 농도로 오염시킨 종자에서도 검출이 되는 것이 확인되었으나 내부 검사에서는 검출이 되지 않았다.
  • ) 특이 PCR 프라이머를 식물병원 세균의 whole-genome 또는 draft genome을 분석을 통해 성공적으로 얻었다(An 등, 2015; Lang 등, 2010). 본 연구에서는 병원균인 A. citrulli에 특이성이 높은 프라이머를 얻기 위하여 A. citrulli KACC10651 균주의 draft genome sequence를 Next Generation Sequencing(NGS)을 이용하여 얻었으며, 이를 통해 최종 선발한 Ac-ORF 12F/Ac-ORF 13R PCR 프라이머와 Ac-ORF 21F/Ac-ORF 21R nested PCR 프라이머는 수박, 멜론, 오이에서 분리한 19개의 모든 A. citrulli에서만 예상한 620 bp와 140 bp 크기의 DNA를 증폭시켜 그 특이성을 확인할 수 있었다.
  • 본 연구에서는 수박을 포함한 박과 작물에 발생하여 큰 경제적 피해를 주는 과일썩음병 병원균 A. citrulli를 수박 종자로부터 검출하는 특이적이고 민감한 PCR 방법을 개발하였다. 종자에 매우 낮은 밀도로 감염된 병원세균을 성공적으로 검출하기 위해서는 PCR에 사용하는 프라이머가 검출하고자 하는 target 병원세균에 특이성이 매우 높아야 한다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
Acidovorax citrulli는 무엇인가? Acidovorax citrulli는 박과 작물에 과일썩음병(bacterial fruit blotch, BFB)을 일으키는 종자전염성 병원세균이다(Hopkins와 Thompsin, 2002; Walcott 등, 2004). 과일썩음병은 1965년 미국에서 처음 보고 되었으며(Sowel 등, 1978), 강력한 병원성을 가진 균주의 출현과 더불어 1980년대 미국 전역의 수박 재배지에서 대발생되어 경제적으로 큰 피해를 일으켰다(Latin 등, 1990).
과일썩음병은 언제, 어디서 처음으로 보고되었는가? Acidovorax citrulli는 박과 작물에 과일썩음병(bacterial fruit blotch, BFB)을 일으키는 종자전염성 병원세균이다(Hopkins와 Thompsin, 2002; Walcott 등, 2004). 과일썩음병은 1965년 미국에서 처음 보고 되었으며(Sowel 등, 1978), 강력한 병원성을 가진 균주의 출현과 더불어 1980년대 미국 전역의 수박 재배지에서 대발생되어 경제적으로 큰 피해를 일으켰다(Latin 등, 1990). 이후 다른 박과 작물인 멜론, 오이 및 호박에서도 발병이 보고되었다(Isakeit 등, 1997; Langston 등, 1999; Matin 등, 1999).
과일썩음병은 국내에서 어디서 처음 보고되었는가? 이후 다른 박과 작물인 멜론, 오이 및 호박에서도 발병이 보고되었다(Isakeit 등, 1997; Langston 등, 1999; Matin 등, 1999). 국내에서는 전북 고창의 수박 재배지에서 처음 보고되었으며(Song 등, 1991), 멜론에서는 전남 광주와 나주지역 재배지에서 처음 보고되었다(Seo 등, 2006).
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