비브리오 불니피쿠스는 우리의 식생활과 밀접한 관계가 있는 어패류와 바닷물에 의해 간경화 같은 만성 간질환 환자에 주로 감염되어 높은 치사율을 보이는 비브리오. 패혈증을 일으킨다. 그러나 현재까지도 항생제 같은 대증적 요법 외 효과적인 치료 및 예방 방법이 없는 실정이다. 최근 혈중 LDL같은 지단백질 이 감염 과 염증반응에 중요한 방어작용을 가지고 있음이 알려졌다. 따라서 LDL이 비브리오 패혈증에 영향을 미치는지 평가해 보았다. 비브리오 패혈증을 일으키는 비브리오 불니피쿠스 균을 배양하고, 대표적인 병태 인자인 비브리오 불니피쿠스 cytolysin를 추출하여 cytolysin의 용혈 활성에 혈청, 콜레스테롤 및 LDL의 영향을 조사하였다. 그리고 마우스에 직접 LDL를 복강 내 주입하여 혈중농도를 변화시킨 후 비브리오 불니피쿠스 균의 마우스 사망률을 조사하였다. 또한 전북 지역 대학 병원에서 비브리오 패혈증 환자에서 생존한 환자와 사망한 환자의 콜레스테롤과 LDL를 조사하였다. 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 용혈 활성은 혈청, cholesterol 및 LDL에 의해 억제되었다. 비브리오 불니피쿠스 균의 마우스 사망률은 LDL을 주입한 경우 40%나 사망률이 낮게 나타났다. 전북 지역 대학 병원에 비브리오 패혈증으로 입원 중인 환자 (15명)의 혈액 분석에서 정상 수준의 콜레스테롤 $(190.8{\pm}16.3)$과 혈청 지단백질 LDL $(53.3{\pm}40.7)$을 가진 환자는 모두 생존하였다 (4명). 그러나 정상보다 낮은 수치 ($35.6{\pm}13.9,\;LDL;\;59.2{\pm}15.1$, 콜레스테롤)를 보이는 환자는 사망하였다 (11명). 콜레스테롤과 LDL은 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 독작용의 억제 요소로서, 비브리오 패혈증의 예후에 중요한 요소임이 밝혀졌다. 또한 이는 콜레스테롤과 LDL이 비브리오 패혈증의 예방과 치료에 중요한 지표가 될 수 있음을 시사한다.
비브리오 불니피쿠스는 우리의 식생활과 밀접한 관계가 있는 어패류와 바닷물에 의해 간경화 같은 만성 간질환 환자에 주로 감염되어 높은 치사율을 보이는 비브리오. 패혈증을 일으킨다. 그러나 현재까지도 항생제 같은 대증적 요법 외 효과적인 치료 및 예방 방법이 없는 실정이다. 최근 혈중 LDL같은 지단백질 이 감염 과 염증반응에 중요한 방어작용을 가지고 있음이 알려졌다. 따라서 LDL이 비브리오 패혈증에 영향을 미치는지 평가해 보았다. 비브리오 패혈증을 일으키는 비브리오 불니피쿠스 균을 배양하고, 대표적인 병태 인자인 비브리오 불니피쿠스 cytolysin를 추출하여 cytolysin의 용혈 활성에 혈청, 콜레스테롤 및 LDL의 영향을 조사하였다. 그리고 마우스에 직접 LDL를 복강 내 주입하여 혈중농도를 변화시킨 후 비브리오 불니피쿠스 균의 마우스 사망률을 조사하였다. 또한 전북 지역 대학 병원에서 비브리오 패혈증 환자에서 생존한 환자와 사망한 환자의 콜레스테롤과 LDL를 조사하였다. 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 용혈 활성은 혈청, cholesterol 및 LDL에 의해 억제되었다. 비브리오 불니피쿠스 균의 마우스 사망률은 LDL을 주입한 경우 40%나 사망률이 낮게 나타났다. 전북 지역 대학 병원에 비브리오 패혈증으로 입원 중인 환자 (15명)의 혈액 분석에서 정상 수준의 콜레스테롤 $(190.8{\pm}16.3)$과 혈청 지단백질 LDL $(53.3{\pm}40.7)$을 가진 환자는 모두 생존하였다 (4명). 그러나 정상보다 낮은 수치 ($35.6{\pm}13.9,\;LDL;\;59.2{\pm}15.1$, 콜레스테롤)를 보이는 환자는 사망하였다 (11명). 콜레스테롤과 LDL은 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 독작용의 억제 요소로서, 비브리오 패혈증의 예후에 중요한 요소임이 밝혀졌다. 또한 이는 콜레스테롤과 LDL이 비브리오 패혈증의 예방과 치료에 중요한 지표가 될 수 있음을 시사한다.
The halophilic bacterium Vibrio vulnificus is known to be a foodborne pathogen that causes septicemia in human. V. vulnificus infection is characterized by the high fatality rates and the primary attack against a person who have underlying diseases such as liver cirrhosis. However, there is no effec...
The halophilic bacterium Vibrio vulnificus is known to be a foodborne pathogen that causes septicemia in human. V. vulnificus infection is characterized by the high fatality rates and the primary attack against a person who have underlying diseases such as liver cirrhosis. However, there is no effective treatment for V. vulnificus septicemia except for classical treatments such as antibiotics. Recently, it has been known that lipoprotein (LDL) plays a major role in the protection against infection and inflammation. Consequently in this paper we analyzed the effects of LDL on V. vulnificus septicemia. We purified V. vulnificus cytolysin, a major virulent factor of V. vulnificus infection and measured inhibitory effects of mouse serum, cholesterol, and LDL on its hemolytic activity. Next experiments were performed to investigate whether LDL has a protective role against septicemia induced by V. vulnificus in mice. Intraperitoneal injection of LDL (1mg as protein) into mice 3hr before V. vulnificus $(1\times10^6\;CFU)$ injection, and V. vulnificus -induced lethality was determined. For the determination the relationship between LDL or cholesterol and prognosis, we determined serum levels of cholesterol and lipoprotein from V. vulnificus septicemia patients (n=15) who had visited the Chonbuk National University Hospital in Chonju. V. vulnificus cytolysin -induced hemolysis of mice erythrocytes was completely inhibited by serum, cholesterol, and low-density lipoprotein. V. vulnificus- induced lethality of mice injected with LDL showed only 40% compared to 100% of control. In survival groups (n=4) of V. vulnificus septicemia patients (n=15), their serum LDL and cholesterol revealed normal levels ($153.3{\pm}40.7,\;LDL;\;190.8{\pm}16.3$, Total cholesterol). However, in death groups (n=11) showed very low levels ($35.6{\pm}13.9,\;LDL;\;59.2{\pm}15.1$, Total cholesterol). Our study indicates that cholesterol and LDL are a prognosis indicator of V. vulnificus septicemia as well as an inhibitor of virulent action of V. vulnificus cytolysin. We suggested that the serum levels of cholesterol or LDL would be major index in the treatment and prevention of V. vulnificus septicemia.
The halophilic bacterium Vibrio vulnificus is known to be a foodborne pathogen that causes septicemia in human. V. vulnificus infection is characterized by the high fatality rates and the primary attack against a person who have underlying diseases such as liver cirrhosis. However, there is no effective treatment for V. vulnificus septicemia except for classical treatments such as antibiotics. Recently, it has been known that lipoprotein (LDL) plays a major role in the protection against infection and inflammation. Consequently in this paper we analyzed the effects of LDL on V. vulnificus septicemia. We purified V. vulnificus cytolysin, a major virulent factor of V. vulnificus infection and measured inhibitory effects of mouse serum, cholesterol, and LDL on its hemolytic activity. Next experiments were performed to investigate whether LDL has a protective role against septicemia induced by V. vulnificus in mice. Intraperitoneal injection of LDL (1mg as protein) into mice 3hr before V. vulnificus $(1\times10^6\;CFU)$ injection, and V. vulnificus -induced lethality was determined. For the determination the relationship between LDL or cholesterol and prognosis, we determined serum levels of cholesterol and lipoprotein from V. vulnificus septicemia patients (n=15) who had visited the Chonbuk National University Hospital in Chonju. V. vulnificus cytolysin -induced hemolysis of mice erythrocytes was completely inhibited by serum, cholesterol, and low-density lipoprotein. V. vulnificus- induced lethality of mice injected with LDL showed only 40% compared to 100% of control. In survival groups (n=4) of V. vulnificus septicemia patients (n=15), their serum LDL and cholesterol revealed normal levels ($153.3{\pm}40.7,\;LDL;\;190.8{\pm}16.3$, Total cholesterol). However, in death groups (n=11) showed very low levels ($35.6{\pm}13.9,\;LDL;\;59.2{\pm}15.1$, Total cholesterol). Our study indicates that cholesterol and LDL are a prognosis indicator of V. vulnificus septicemia as well as an inhibitor of virulent action of V. vulnificus cytolysin. We suggested that the serum levels of cholesterol or LDL would be major index in the treatment and prevention of V. vulnificus septicemia.
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문제 정의
10) 따라서 본 연구자는 정제된 cytolysin의 용혈 활성에 미치는 마우스 혈청, 콜레스테롤 및 LDL의 영향을 관찰 하였다. 정제된 비브리오 불니피쿠스 cytolysin(0.
LDL이 비브리오 감염병의 강력한 억제자임이 in vitro 또는 in vivo 실험을 통하여 밝혀져 본 연구자는 전북대학교 병원에 내원한 비브리오 패혈증으로 판명된 환자들의 혈액 내의 lipoprotein 및 콜레스테롤 농도를 추적 조사하였다. 비브리오 패혈증으로 입원 중인 환자 (15명)의 혈액분석에서 정상 수준의 콜레스테롤 (190.
결과적으로 다음실험에서 본 연구자는 lipoprotein 이 직접 비브리오 불니피쿠스 감염에 보호작용을 하는지 확인하기 위하여 마우스 in vivo model을 이용하여 비브리오 불니피쿠스 감염에 대한 lipoprotein 의 방어작용을 관찰 하였다. 이 실험을 위하여 lipoprotein중에 콜레스테롤을 가장 많이 함유하고 있는 low density lipoprotein (LDL)을 이용하였다.
10) 이러한 결과들은 혈중 콜레스테롤이나 LDL 이 세균감염증에 중요한 방어 인자임을 시사하여준다. 결과적으로 본 연구에서 비브리오 불니피쿠스 균으로부터 cytolysin을 정제하고, 사람의 혈액으로부터 LDL 등의 지질단백질을 추출하여 마우스에 주입하여 cytolysin의 용혈 활성 억제 정도와 사망률을 조사하고자 하였으며, 또한 실저비브리오 패혈증환자의 혈액의 LDL수치가 환자의 병태진항에 어떠한 영향을 주는지 평가하고자 한다.
제안 방법
측정하였다.'2)즉 cytolysin와 BSA (1 mg/ml)^ 함유하는 phosphate buffered saline (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.4) 용액 1 ml에 PBS로 여러 번 세척하여 미리 조제된 0.7% 마우스 적혈구 부유 액 1 ml를 가하고, 37°C에서 30 분간 부치한 후 원심 시켜 상청액에 유리된 hemoglobin 농도를 545 nm에서의 흡광도로 측정하여 50%의 hemoglobin 유리를 일으킨 cytolysin의 양을 1 hemolytic unit (HU) 로정의하였다. 완전 (100%) 용혈은 saponin을 최종농도가 0.
마우스 복강 내에 균 주입 3시간 전에 복강 내에 1 mg LDL를 투여하여 생존 율을 관찰하였다. 그 결과 Fig.
실험도중 실험동물은 특수 제작된 실험 동물실에서 관리하였으며, 자유식을 공급하였다. 마우스의 복강 내에 LDL Img (as protein) 주입한 3시간 후 복강 주사로 비브리오 불니피쿠스 균(»1俨>을 주입 후 사망률을 관찰하였다.
비브리오 불니피쿠스 균의 cytolysin의 활성은 마우스 적혈구의 용혈 정도를 이용한 Bemheimer 등의 방법을 응용하여 측정하였다.'2)즉 cytolysin와 BSA (1 mg/ml)^ 함유하는 phosphate buffered saline (PBS, 137 mM NaCl, 2.
10) 따라서 본 연구자는 정제된 cytolysin의 용혈 활성에 미치는 마우스 혈청, 콜레스테롤 및 LDL의 영향을 관찰 하였다. 정제된 비브리오 불니피쿠스 cytolysin(0.5 HU)를 각 대조군(PBS), 10 uL 마우스 혈청, 1 mg LDL, 10 ug 콜레스테롤에 주입하여 37도에서 30분간 용혈 활성 정도를 관찰하였다. 그 결과 대조군은 20%, 마우스 혈청은 55%, LDL는 75%, 콜레스테롤은 91%정도 용혈 활성을 억제하였다.
대상 데이터
2000-20003년까지 전북 대학 병원의 비브리오 패혈증 환자에서 생존한 환자와 사망한 한자의 혈청 콜레스테롤, LDL 을 조사하였다.
본 연구에서 비브리오 불니피쿠스 E4125 균주는 미국 M, H. Kothary (Department of Microbiology, Virulence Assess ment Branch, Center for Food Safety and Applied Nu trition, Food and Drug Administration, Washington D.C.) 박사로부터 분주 받아 사용하였다. 균 선택 배지인 TCBS agar에서 colony들을 Kreger 등의 방법에 따라 다시 100mM TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethame- sulfonic acid)-NaOH 완충액 (pH 7.
비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 동물 독성실험
실험동물로 15-20 g 사이의 female BALB/c 마우스를 (주) 샘타코 Bio Korea(경기도 오산시) 에서 구입하여 사용하였다. 실험도중 실험동물은 특수 제작된 실험 동물실에서 관리하였으며, 자유식을 공급하였다.
이 실험을 위하여 lipoprotein중에 콜레스테롤을 가장 많이 함유하고 있는 low density lipoprotein (LDL)을 이용하였다.
데이터처리
통계분석
통계검사는 ANOVA test 및 Student's test 프로그램을 이용하였다. 본 연구에서 p<0.
이론/모형
4)을 포함하는 heart infusion difiusate broth (HI)에 접종하고 배양하였다.11) 배양 후 상청액에 존재하는 cytolysin을 Kim 등의 방법에 따라 ammonium sulfete fractionation, calcium phosphate gel adsorption, DEAE-cellulose chromatography, 및 Phenyl- Sepharose CL-4B chromatography을 거쳐 순수하게 정제하여 사용하였다3
성능/효과
투여하여 생존 율을 관찰하였다. 그 결과 Fig. 15에 표시 된 바와 같이 LDL은 비브리오 불니피쿠스 에 의한 사망률을 40%로 감소시켰다(Fig. 2).
5 HU)를 각 대조군(PBS), 10 uL 마우스 혈청, 1 mg LDL, 10 ug 콜레스테롤에 주입하여 37도에서 30분간 용혈 활성 정도를 관찰하였다. 그 결과 대조군은 20%, 마우스 혈청은 55%, LDL는 75%, 콜레스테롤은 91%정도 용혈 활성을 억제하였다. 모두 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 용혈 활성을 억제하였고 특히 콜레스테롤과 LDL이 강하게 억제하였다(Fig.
그 결과 대조군은 20%, 마우스 혈청은 55%, LDL는 75%, 콜레스테롤은 91%정도 용혈 활성을 억제하였다. 모두 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 용혈 활성을 억제하였고 특히 콜레스테롤과 LDL이 강하게 억제하였다(Fig. 1). 이런 결과로 콜레스테롤 및 LDL이 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 강력한 억제 인자임이 확인되었다.
17)이것은 혈청 지 단백질인 LDL이 세균 감염의 방어체제에 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 이러한 연구 배경으로 실험한 이번 연구에서 혈청 LDL이 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 용혈 활성을 약 75% 억제하였고 또한 비브리오 패혈증 마우스에 혈청 LDL를 주입한 결과 사망률이 40% 감소하였다는 것은 혈청 지 단백질인 LDL이 비브리오패혈증에도 강력한 세균 방어 작용을 한다는 것을 시사한다고 볼 수 있다.
1). 이런 결과로 콜레스테롤 및 LDL이 비브리오 불니피쿠스 cytolysin의 강력한 억제 인자임이 확인되었다.
후속연구
결국 본 연구에서는 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 콜레스테롤과 더불어 LDL이 비브리오 패혈증 방어하는데 영향을 줄 것으로 시사한다. 또한 근 4년간의 전북대학 병원 비브리오 패혈증 환자의 조사에서도 혈청 콜레스테롤과 LDL 정상 수치에 있는 사람은 모두 생존하였으나 반대로 정상보다 낮은 사람은 모두 사망하는 결과를 보였다.
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