[논문]소르빈산 칼륨의 GJIC 억제로 인한 간독성 유발

황재웅; 정지혜; 정지원; 정지윤; 김선중; 박정란; 안지윤; 하태열; 김성란; 이영순; 강경선

소르빈산 칼륨의 GJIC 억제로 인한 간독성 유발
Inhibition of Gap Junctional Intercellular Communication by Food Preservatives Potassium Sorbate 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.21 no.4, 2006년, pp.269 - 273

황재웅 (서울대학교 수의과대학 수의공중보건학교실) , 정지혜 (서울대학교 수의과대학 수의공중보건학교실) , 정지원 (서울대학교 수의과대학 수의공중보건학교실) , 정지윤 (공주대학교 산업과학대학 특수 동물학과) , 김선중 (서울대학교 수의과대학 수의공중보건학교실) , 박정란 (서울대학교 수의과대학 수의공중보건학교실) , 안지윤 (한국식품연구원) , 하태열 (한국식품연구원) , 김성란 (한국식품연구원) , 이영순 (서울대학교 수의과대학 수의공중보건학교실) , 강경선 (서울대학교 수의과대학 수의공중보건학교실)

초록
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소르빈산 칼륨은 소르빈산의 일종으로 항세균 및 곰팡이 발육 저지 효과를 갖고 있다. 이러한 성질로 인하여 소르빈산 칼륨은 곰팡이와 진균에 대한 식품 방부제로서 사용되고 있다. 소르빈산 칼륨은 많은 양에 노출되었을 때도 체내에서 수분과 이산화탄소로 분해되는 특성으로 인하여 독성이 없는 것으로 알려져 있다. gap junction을 통한 세포 간 신호 전달(GJIC)는 생체의 성장과 분화에 있어서 조직의 항상성 유지에 본질적인 역할을 하고 있다. 본 연구는 WB-F344 랫드의 정상 간 상피 세포(WB 세포)에서 소르빈산 칼륨을 노출하였을 때 GJIC에 대하여 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 그 결과 소르빈산 칼륨에 노출에 의하여 WB세포의 GJIC가 농도 및 시간 의존적으로 현격하게 감소하는 것을 관찰하였다. 소르빈산 칼륨은 GJIC를 강력하게 억제하며, 이는 WB 세포에서 gap junction을 구성하는 connexin 43의 인산화와 병행하는 것을 확인하였다. 소르빈산 칼륨이 gap junction의 기능을 방해함으로 인해 소르빈산 칼륨에 의한 간독성이 유발될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Potassium Sorbate (PS) is a potassium salt version of sorbic acid, which has antimicrobial and fungistatic features in foods. Therefore, PS is used as a food preservative against fungi and mold. PS has been found to be non-toxic even when taken in large quantities given its trait to be broken down in the body into water and carbon dioxide. Gap Junctional Intercellular Communication (GJIC) is essential in the maintenance of tissue homeostasis during development and differentiation. This study was made of the effects of PS on GJIC in WB-F344 rat liver epithelial (WB) cells. We found dramatic decrease of cell viability in time- and dose-dependent manners when WB cells were treated with PS. The effect of PS on GJIC is strong inhibition, and it took place in parallel with a hyperphosphorylation of connexin 43 expression. The finding that PS interferes with gap junction functionality should be considered with respect to the mechanism of PS-induced hepatotoxicity.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 소르빈산 칼륨의 in vitro 상에서 세포 독성을 확인하는 것이며, 세포의 항상성 유지에 큰 기여를 하는 GJIC와의 상관성을 확인하고자 함이다.
소르빈산 칼륨에 의한 GJIC의 억제를 검증하기 위하여 gap junction을 이루고 있는 단백질인 connexin 중 WB 세포에서 주로 발현하는 connexin 43 (Cx43)의 인산화 양상을 확인해 보았다. GJIC의 억제는 connexin의 활성 변화로 인해 g junction이 막히게 되므로, 이는 간접적으로 connexin의 활성 측정을 통해 확인할 수 있다.

가설 설정

Then cells were scrape loaded. (B) Effect of PS on the phosphorylation pattern of Cx43 was measured. Total cellular protein extracts were prepared and western blot analysis was performed with 20 ㎍ protein using antibody specific for Cx43.

제안 방법

Fig. 1에 의해 얻어진 세포 독성 농도를 바탕으로 소르빈산 칼륨을 1시간 동안 WB 세포에 노출하였을 경우, GJIC 의 변화 양상을 알아보았다. GJIC의 활성 정도는 앞서의 재료와 방법에서 언급한 시험법을 사용하여, 물리적으로 세포에 자극을 가해 찢어진 세포 사이로 들어간 Lucifer Yellow CH (LY)가 gap junction을 통해 이웃 세포로 전이된 염색 정도로 평가를 하였다.
1에 의해 얻어진 세포 독성 농도를 바탕으로 소르빈산 칼륨을 1시간 동안 WB 세포에 노출하였을 경우, GJIC 의 변화 양상을 알아보았다. GJIC의 활성 정도는 앞서의 재료와 방법에서 언급한 시험법을 사용하여, 물리적으로 세포에 자극을 가해 찢어진 세포 사이로 들어간 Lucifer Yellow CH (LY)가 gap junction을 통해 이웃 세포로 전이된 염색 정도로 평가를 하였다. Fig.
05% Lucifer yellow CH (Sigma, USA)를 첨가한 다음, 24호 blade를 이용하여 scrape line을 만든 다음 3분간 실온, 차광상태에서 incubation한 후 다시 PBS로 3회 세척한다. 세척 후 10% neutral fbrmalin을 이용하여 고정시킨 후 inverted fluorescent microscope로 관찰하였다6).
일반적으로 세포 활성의 측정에 대하여 80% 이하의 활성을 보일 때 세포 독성이 있음을 지시하게 되는데7)소르빈산 칼륨의 경우, 24시간 노출 시는 20 mM, 1시간 노출 시는 100 mM에서부터 세포 독성이 시작됨을 알 수 있었다. 소르빈산 칼륨에 의한 WB 세포에서 GJIC의 변화는 세포독성이 나타나지 않는 100 mM 미만의 농도에서 실험을 진행하였다.
소르빈산 칼륨을 지시된 시간대별로 처치하여 시간의 변화에 의한 GJIC의 변화 양상을 확인해보았다. Fig.
소르빈산 칼륨이 Gap Junction을 통한 세포 간 정보전달 (Gap Junctional Intercellular Communication; GJIC)에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 랫드의 간 상피세포인 WJ3 세포를 35 mm² dish에 파종한 후 37℃ incubator에서 배양한 다음, 소르빈산 칼륨을 농도별 또는 시간대 별로 처치하여 배양하고, PBS로 3회 세척한 후 0.05% Lucifer yellow CH (Sigma, USA)를 첨가한 다음, 24호 blade를 이용하여 scrape line을 만든 다음 3분간 실온, 차광상태에서 incubation한 후 다시 PBS로 3회 세척한다. 세척 후 10% neutral fbrmalin을 이용하여 고정시킨 후 inverted fluorescent microscope로 관찰하였다6).

대상 데이터

본 실험에 사용하였다. 세포는 5%의 FBS (fiital bovine serum, Gibco BRL)이 함유된 EMEM(Gibco, BRL) 배양액에서 5%의 의 대기조건에서 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 세포는 75 mm 조직 배양 plate에서 배양되었고 이틀에 한번 배양액을 교체하였다.
세포는 75 mm 조직 배양 plate에서 배양되었고 이틀에 한번 배양액을 교체하였다. 실험에 사용된 WB 세포는 동결 보관에서 해동 후 8번까지 계대를 하였다.
정상 WB-F344 랫드에서 분리된 간 상피 세포인 WB 세포주를 본 실험에 사용하였다. 세포는 5%의 FBS (fiital bovine serum, Gibco BRL)이 함유된 EMEM(Gibco, BRL) 배양액에서 5%의 의 대기조건에서 37℃ 세포배양기에서 배양하였다.

이론/모형

Cells were treated with different concentration of PS for Ih or 24h. Cell survival rate was determined by MTT assay.
WB 세포에서 소르빈산 칼륨의 노출에 의한 세포독성을 MTT 시험법으로 측정하였다. 소르빈산 칼륨을 100 mM 이하의 농도로 1시간 또는 24시간 동안 WB 세포에 노출하였을 경우 얻어진 세포독성은 Fig.

성능/효과

3에서 1 시간, 6시간, 12시간 동안 소르빈산 칼륨을 24시간 노출 시세포 독성을 나타내지 않은 농도인 20 mM의 농도로 WB세포에 노출하였을 경우 1 시간까지는 대조군에 비하여 GJIC 의 감소가 나타나지 않았다. 6시간 노출부터는 대조군에 비하여 scrape line을 기준으로 lucifer yellow의 퍼짐이 현격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 세포 활성을 이용한 세포 독성의 측정에서 20 mM의 소르빈산 칼륨은 WB 세포에서 독성을 보여주지 못했지만 GJIC의 감소는 6시간부터 유의적으로 나타났다.
GJIC의 억제는 connexin의 활성 변화로 인해 g junction이 막히게 되므로, 이는 간접적으로 connexin의 활성 측정을 통해 확인할 수 있다. Fig. 2-B에서 보듯이, 소르빈산 칼륨을 각 지시된 농도로 WB 세포에 노출하였을 때 대조군에 비하여 Cx43의 인산화가 일어난 P1 과 P2 밴드의 유의적인 증가를 확인할 수 있었다. 이는 앞서의 Fig.
6시간 노출부터는 대조군에 비하여 scrape line을 기준으로 lucifer yellow의 퍼짐이 현격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 세포 활성을 이용한 세포 독성의 측정에서 20 mM의 소르빈산 칼륨은 WB 세포에서 독성을 보여주지 못했지만 GJIC의 감소는 6시간부터 유의적으로 나타났다.
감소된 GJIC로 인해 in vitro 상에서 항상성의 유지가 방해를 받게 되고 이로 인해 세포 활성의 감소로 인한 세포 독성이 유발된 것으로 사료된다. 소르빈산 칼륨은 in vitro 환경에서 간독성을 유발할 수 있으며, 간독성의 유발 기전 중의 하나가 GJIC의 억제임을 확인할 수 있었다. GJIC는 다양한 요소에 따라 회복 및 억제되는 것으로 알려져 있다.
1과 같다. 소르빈산 칼륨을 24시간 동안 WB 세포에 노출하였을 경우, 20 mM에서부터세포 활성이 80% 이하로 줄어들기 시작하였고 60 mM 이상의 농도에서는 세포의 활성의 저하가 현저하게 나타났다. 소르빈산 칼륨을 1시간 동안 노출하였을 경우, 24시간 노출에서와는 달리 80 mM까지는 세포 활성의 변화가 없었으며 100 mM 농도에서 세포 활성의 감소가 나타났다.
지금까지의 결과를 통해 현재까지 안전하다고 알려진 소르빈산 칼륨은 WB 세포에서 GJIC의 현격한 감소를 농도 및 시간 의존적으로 보여주었다. 감소된 GJIC로 인해 in vitro 상에서 항상성의 유지가 방해를 받게 되고 이로 인해 세포 활성의 감소로 인한 세포 독성이 유발된 것으로 사료된다.

후속연구

이와같이 안전하다고 알려진 소르빈산 칼륨의 식품첨가제로서의 사용에 있어서 세포 독성의 .가능성을 보이고 있으며 간독성의 가능성을 검색해볼 필요가 있을 것이다.
GJIC는 다양한 요소에 따라 회복 및 억제되는 것으로 알려져 있다. 소르빈산 칼륨으로 인해 유발된 GJIC의 억제 기전을 살펴봄으로써 그에 대응하는 방어기전을 연구함으로써 소르빈산 칼륨에 의한 간독성을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.

참고문헌 (7)

Thakur, B.R., Singh, K. and Arya, S.S.: Chemistry of Sorbates - A Basic Perspective. Food Rev. Int., 10, 71-91 (1994)

상세보기
Perez-Prior, M.T., Manso, J.A., Garcia-Santos, Mdel P., Calle E. and Casado J.:Alkylating potential of potassiun sorbate. J. Agric. Food. Chem., 53, 10244-10247 (2005)

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Simon, A.M. and Goodenough, D.A.: Diverse functions of vertebrate gap junctions. Trends Cel.l Biol., 8, 477-483 (1998)

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Musil, L. S.; Cunningham, B.A., Edelman, G,M. and Goodenough, D.A.: Differential phosphorylation of the gap junction protein connexin43 in junctional communication-competent and -deficient cell lines. J. Cell Biol., 111, 2077-2088 (1990)

상세보기
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상세보기
Hwang, J.W., Park, J.S., Jo, E.H., Kim, S.J., Yoon, B.S., Kim, S.H., Lee, Y.S. and Kang, K.S.. : Chinese cabbage extracts and sulforaphane can protect $H_2O_2$ -induced inhibition of gap junctional intercellular communication through the inactivation of ERK1/2 and p38 MAP kinases. J. Agric. Food. Chem., 53, 8205-8210 (2005)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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