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문제 정의
- 그러나 이러한 화학합성 약물의 여러가지 부작용 및 재발의 문제로 인하여 새로운 약물의 개발이 시급한 실정이다. 천연물은 비교적 안전성이 높은 약물로, 본 연구에서는 전통적으로 항염증 작용을 갖거나 위장 질환에 사용되었던 생약을 선정하여 항위염 및 항위궤양 효과를 알아보았다.
- 8) 그 밖에 고삼으로부터의 추출물이나 추출성분이 여러 효소나 세균 등에 작용하여 생리학적인 작용에 영향을 주거나 항균 활성이 있는 것이 밝혀지고 있다.9-11)이에 본 연구에서는 고삼 70% ethanol 추출물 및 고삼 성분인 trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifolirhizin이 위염 및 위손상과 H. pylori 균에 미치는 영향에 대해서 알아보고자 하였다.
- pyrolie 미치는 영향 및 HC1 .ethanol 유발 위손상 모델에서 위손상 억제효과와 흰쥐의 위액 분비에 미치는 영향에 관하여 검토하였다. Trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifolirhizine 위산을 중화시키는 제산력 및 free radical scaenging 활성은 증가하는 경향을 보여 항산화효과 및 산중화능의 지표물질로 사용할 수 있으리라 생각된다.
제안 방법
- 이 추출물을 증류수에 현탁 하여 용매의 극성에 따라 분획하여 각각 CH2C12 (114 g), EtOAc (124 g), n-BuOH (305 g) 및 H2O (524 g)을 얻었다. 이 중 CH2C12 분획 70 g을 silica (Si) gel 60 (70-230 mesh, Merck, Germany)을 사용하여 CHzChTCHzCleMeOJk 80:1 — 1:1, MeOH, gradient)의 조건으로 분리한 후, Sephadex LH-20 및 RP-18 gel column을 이용하여 FeO과 MeOH으로 정제하였다. 각 분획의 단계에서 precoated Merck Kieselgel 60 F254 plate (20 x 20 cm, 0.
- 이 중 CH2C12 분획 70 g을 silica (Si) gel 60 (70-230 mesh, Merck, Germany)을 사용하여 CHzChTCHzCleMeOJk 80:1 — 1:1, MeOH, gradient)의 조건으로 분리한 후, Sephadex LH-20 및 RP-18 gel column을 이용하여 FeO과 MeOH으로 정제하였다. 각 분획의 단계에서 precoated Merck Kieselgel 60 F254 plate (20 x 20 cm, 0.25 mm) 및 RP-18 F254S plate (5x 10 cm, Merck, Germany)를 이용하여 박층크로마토그래피를 실시하여 성분을 확인하였고, 발색제로 50% H2SO4< 사용하였다. 실험에 사용한 고삼 70% ethanol 추줄물 및 trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifolirhizine 앞서 기술한 방법에 의하여 추출 및 분리한부경대학교 식품공학과 최재수 교수님으로부터 제공받아 사용하였으며 구조식은 Fig.
- 대하여 실험하였다. 대한약전에 명시된 제산력 시험법을 변경하여 0.1 N HC1 에 검체 1 mg 취하여 혼합 후 37℃ 의 shaking incubator에서 1시간 동안 반응시 킨 후 0.1 N NaOH로 적정하였다. 지시약으로 methyl orange, 양성대조 약물로 hydrotalcite와 cimetidine을 사용하였다.
- DPPH 시험법 - In 에서의 직접적인 free radical scavenging 효과를 측정하고자 1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 제거 활성을 즉정하였다. 즉 trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifoli- rhizin에 methanol을 가하여 120, 80, 40, 20, 10, 5 및 2.
- 제거 활성을 즉정하였다. 즉 trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifoli- rhizin에 methanol을 가하여 120, 80, 40, 20, 10, 5 및 2.5 μg/mg 농도가 되도록 조제하고 4mL 씩 시험관에 취하였다. 여기에 1.
- pyroli strain 인 HP ATCC43504는 ATCC사로부터 구입하여 Kim14) 등의 방법으로 실험하였다. H. pyroli 생장 억제효과를 확인하기 위하여 먼저 brucella agar 배지 및 7%의 horse sennn이 딤긴 petridish에 해당농도로 DMSO에 용해한 검체를 주입하고 여기에 IxlO6 CFU의 H. pyroli를 분주하여 37℃에서 (AnaeroPak Campylo:85% N2, 10% CO2 and 5% O2) 3일간 배양한 후 생성된 colony를 계수하였다. 양성대조군으로써 ampicillin을 사용하였다.
- 실험하였다. 즉, 절식시킨 흰쥐에 HCLethanol액 (60% EtOH에 150mM HC1 함유) 1 mL을 경구투여 흐}고 절식 절수 하에서 1시간 방치 후 과량의 ether로 치사시켜 위를 적출하였다. 적출한 위를 2% formalin 수용액으로 10분간 침적하여 위 내외를 가볍게 고정한 다음 대만부를 절개하여선 위부에 발생한 손상의 길이 (mm)의 총화를 위 손상지수로 하였다.
- 즉, 절식시킨 흰쥐에 HCLethanol액 (60% EtOH에 150mM HC1 함유) 1 mL을 경구투여 흐}고 절식 절수 하에서 1시간 방치 후 과량의 ether로 치사시켜 위를 적출하였다. 적출한 위를 2% formalin 수용액으로 10분간 침적하여 위 내외를 가볍게 고정한 다음 대만부를 절개하여선 위부에 발생한 손상의 길이 (mm)의 총화를 위 손상지수로 하였다. 검체는 HC1 .
- 검체는 HC1 . ehan이을 투여하기 30분전에 용량별로 경구투여 하였다. Inhibition ratio (%)는 다음의 식이의하여 계산하였다.
- 본 연구에서는 고삼 70% ethanol 추출물 및 성분 중 traris ferulic acid, trans sinapic acid, trifolirhizin의 제산력, free radical scvenging 효과, H. pyrolie 미치는 영향 및 HC1 .ethanol 유발 위손상 모델에서 위손상 억제효과와 흰쥐의 위액 분비에 미치는 영향에 관하여 검토하였다.
- 위액분비 량을 Shay등의 방법으로 측정하였다. 즉 흰쥐를 ether 마취 하에 개복하고 유문부를 결찰한 즉시 검 체를 십이지장 내로 주입하고 봉합한 후 4시간 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하고 저류된 위액을 채취하였다. 채취한 위액은 3, 000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상징액을 취하여 위 액 량, pH 및 산도를 측정하였다.
- 즉 흰쥐를 ether 마취 하에 개복하고 유문부를 결찰한 즉시 검 체를 십이지장 내로 주입하고 봉합한 후 4시간 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하고 저류된 위액을 채취하였다. 채취한 위액은 3, 000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상징액을 취하여 위 액 량, pH 및 산도를 측정하였다. 산도는 methyl orange를 지시 약으로 하여 0.
대상 데이터
- 실험재료 및 기구 - H. pylori strain인 HP ATCC43504는 ATCG사로부터 구입한 것을 사용하였으며 , HC1 및 methanol, ethanol 등은 Duksan Chem. Co.
- Louis, MO)로부터 구입하여 크로마토그래 피 를 실시하였다. 박층크로마토그래 피 는 precoated Merck Kieselgel 60 F254 plate (20 x 20 cm, 0.25 mm) 및 RP-18 F254S plate를 Merck사 제품을 이용하여 실시하였다.
- 실험동물 - 오리엔트(주)에서 분양 받은 체중 200-250 g 의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 22±2℃에서 1주간 이상 사육하여 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 동물실 내의 명암은 12시간씩으로 자동조절 시키고, 고형사료 (삼양사료) 및 물은 충분히 공급하였다.
- 25 mm) 및 RP-18 F254S plate (5x 10 cm, Merck, Germany)를 이용하여 박층크로마토그래피를 실시하여 성분을 확인하였고, 발색제로 50% H2SO4< 사용하였다. 실험에 사용한 고삼 70% ethanol 추줄물 및 trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifolirhizine 앞서 기술한 방법에 의하여 추출 및 분리한부경대학교 식품공학과 최재수 교수님으로부터 제공받아 사용하였으며 구조식은 Fig. 1과 같다.
- 1 N NaOH로 적정하였다. 지시약으로 methyl orange, 양성대조 약물로 hydrotalcite와 cimetidine을 사용하였다.12)
- H. pyroli 0|| 대한 항균작용 - H. pyroli strain 인 HP ATCC43504는 ATCC사로부터 구입하여 Kim14) 등의 방법으로 실험하였다. H.
- pyroli를 분주하여 37℃에서 (AnaeroPak Campylo:85% N2, 10% CO2 and 5% O2) 3일간 배양한 후 생성된 colony를 계수하였다. 양성대조군으로써 ampicillin을 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리 - 모든 실험결과는 평균±오차 (Mean ± S.E.)로계산하였다. 각 군간의 유의성 검정은 Student's F-test를 사용하였고,p값이 5% 미만일 때 유의성이 있다고 판정하였다.
- )로계산하였다. 각 군간의 유의성 검정은 Student's F-test를 사용하였고,p값이 5% 미만일 때 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- HCI-ethanol 유발 위손상에 대한 효과 - 체중 약 200 g 전후의 웅성 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 Mizui⑸의 방법에 따라 실험하였다. 즉, 절식시킨 흰쥐에 HCLethanol액 (60% EtOH에 150mM HC1 함유) 1 mL을 경구투여 흐}고 절식 절수 하에서 1시간 방치 후 과량의 ether로 치사시켜 위를 적출하였다.
- 기초 위액 분비에 대한 실험 - 체중 약 200 g 전후의 웅성 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 ether 마취하에 유문결찰하고 위액분비 량을 Shay등의 방법으로 측정하였다. 즉 흰쥐를 ether 마취 하에 개복하고 유문부를 결찰한 즉시 검 체를 십이지장 내로 주입하고 봉합한 후 4시간 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하고 저류된 위액을 채취하였다.
성능/효과
- DPPH 시험법 - In vzTro에서의 직접적인 free radical scavenging 효과를 측정하고자 O.lSxlO'4 M/mL 1, 1-diphenyl-2-piciylhydrazyl에 대한 고삼 70% ethanol 추출물의 활성산소소거능력을 측정하여 억제력을 Ky으로 나타내었다 그 결과 160 μg/mL 이상의 용량이었다. 고삼의 70% ethanol 추출물은 free radical의 제거능을 측정하였을 때 유의성 있는 결괴를 나타내지 않았으나, 성분인 trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifblirhizine #이 118.
- lSxlO'4 M/mL 1, 1-diphenyl-2-piciylhydrazyl에 대한 고삼 70% ethanol 추출물의 활성산소소거능력을 측정하여 억제력을 Ky으로 나타내었다 그 결과 160 μg/mL 이상의 용량이었다. 고삼의 70% ethanol 추출물은 free radical의 제거능을 측정하였을 때 유의성 있는 결괴를 나타내지 않았으나, 성분인 trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifblirhizine #이 118.37, 82.57, 92.91 pig/mL로 free radiml 제거능력이 확인되었다 (Table II).
- pylori에 의한 염증반응의 결과로 알려져 있다. 고삼의 70% ethanol 추출물에 대한 항균실험을 실시한 결과, 1 mg/mL의 농도에서 colony의 수가 대조군에 비하여 (+)감소되었다. 같은 방법으로 고삼 추출물로부터 분리한 trans ferulic acid, trans sinapic acid, triR)lirhizin으로 실험한 결과 trifdlirhizin 100|ig/mL의 농도에서 colony의 생성이 완전히 억제된 것을 확인할 수 있었다 (Table HI).
- 고삼의 70% ethanol 추출물에 대한 항균실험을 실시한 결과, 1 mg/mL의 농도에서 colony의 수가 대조군에 비하여 (+)감소되었다. 같은 방법으로 고삼 추출물로부터 분리한 trans ferulic acid, trans sinapic acid, triR)lirhizin으로 실험한 결과 trifdlirhizin 100|ig/mL의 농도에서 colony의 생성이 완전히 억제된 것을 확인할 수 있었다 (Table HI). 즉 고삼 중 trifolirhizin0] H.
- 같은 방법으로 고삼 추출물로부터 분리한 trans ferulic acid, trans sinapic acid, triR)lirhizin으로 실험한 결과 trifdlirhizin 100|ig/mL의 농도에서 colony의 생성이 완전히 억제된 것을 확인할 수 있었다 (Table HI). 즉 고삼 중 trifolirhizin0] H. pyrolie\ 증식을 강력하게 억제함으로써 H. pyroli의 위궤양 및 위암 기전인 carcinogen 에 대한 저항성 저하, mucosal hyperproliferation 유발, carcinogenic N-nitroso compound의 증가 및 ascorbic acid의 분비감소 등을 완화하고 2차적인 감염의 증상들을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 생각된다.
- 2에 나타내었다. 대조약물인 cimetidinee 200㎎/㎏ 용량에서 2.8±0.9 mm의 위 손상지수를 보여 control의 6.5 ±1.1 mm에 비해 56.54±1.5%의 위손상 억제효과를 나타내었다. Trifolirhizin 50, 100㎎/㎏ 투여시 위 손상지수가 각각 4.
- 5%의 위손상 억제효과를 나타내었다. Trifolirhizin 50, 100㎎/㎏ 투여시 위 손상지수가 각각 4.0±0.7, 2.2±0.7 로 각각 38.46, 66.92%의 유의성 있는 위손상 억제 효과를 나타내었고 이는 대조약물인 cimetidine0] 억제한 효과와 비슷하였다. HCI-ethanol 위손상을 유발시킨 위의 모습은 대조군의 선위부에 선형의 hemorrhage가 심하게 나타나고, 전체적인 조직이 얇아져 있으며, 색상이 흐려진 것에 비하여 trifolirhizin 투여군에서는 손상이 현격하게 줄어있으며, 전체적인 조직의 탄력과 색상에 있어 정상군과 큰 차이를 나타내지 않았다.
- HCI-ethanol 위손상을 유발시킨 위의 모습은 대조군의 선위부에 선형의 hemorrhage가 심하게 나타나고, 전체적인 조직이 얇아져 있으며, 색상이 흐려진 것에 비하여 trifolirhizin 투여군에서는 손상이 현격하게 줄어있으며, 전체적인 조직의 탄력과 색상에 있어 정상군과 큰 차이를 나타내지 않았다. 즉 trifolirhizine 유의성 있는 방어효과가 있었으며, 이를 통하여 공격인자인 염산에 대해 점액의 분비 증가나 방어 인자의 존재를 추측할 수 있다.
- 대조군과 비교하였을 때 trifolirhizin 100 ㎎/㎏ 경구투여시 기초위액 분비량은 567ml로 약 15% 정도 감소시켰다. pH를 측정한 결과 trifolirhizin는 1.
- 대조군과 비교하였을 때 trifolirhizin 100 ㎎/㎏ 경구투여시 기초위액 분비량은 567ml로 약 15% 정도 감소시켰다. pH를 측정한 결과 trifolirhizin는 1.70로 대조군의 1.33에 비하여 유의적인 증가를 나타내지 않았으나, 총산배출량은 대조군의 0.54 mEq/4 hr에 비교하여 trifolirhizine 0.38 mEq/4 hr를 나타내어 대조군과 유의성 있는 차이를 보였다. 즉 trifolirhizin 는 위산의 pH는 다소 증가하였고 위산분비량 은 유의성 있는 억제 효과를 나타내어, 총 산 분비량 또한 유의성 있는 효과를 나타내었다.
- 38 mEq/4 hr를 나타내어 대조군과 유의성 있는 차이를 보였다. 즉 trifolirhizin 는 위산의 pH는 다소 증가하였고 위산분비량 은 유의성 있는 억제 효과를 나타내어, 총 산 분비량 또한 유의성 있는 효과를 나타내었다.
- Trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifolirhizine 위산을 중화시키는 제산력 및 free radical scaenging 활성은 증가하는 경향을 보여 항산화효과 및 산중화능의 지표물질로 사용할 수 있으리라 생각된다. 또한, trifolirhizin의 H. pyralid 대한 억제 효과, HCl-ethanol 유발 위손상 모델에서 위손상 억제효과 및 흰쥐의 위액분비억제 및 4시간 동안의 Total acid output 감소 효과를 확인하였다. 따라서.
후속연구
- ethanol 유발 위손상 모델에서 위손상 억제효과와 흰쥐의 위액 분비에 미치는 영향에 관하여 검토하였다. Trans ferulic acid, trans sinapic acid, trifolirhizine 위산을 중화시키는 제산력 및 free radical scaenging 활성은 증가하는 경향을 보여 항산화효과 및 산중화능의 지표물질로 사용할 수 있으리라 생각된다. 또한, trifolirhizin의 H.
- 따라서. 고삼 중 trifolirhizine 항 위 염 및 H. pylori 균에 대한 지표물질로 지정할 수 있을 것이며 고삼추출물 및 그 유효성분을 이용하여 위염 치료제 개발 및 질병예방차원에서 기능성식품개발에도 응용할 수 있으리라 생각된다.
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