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문제 정의
- 본 연구에서는 probiotics 균주의 주요한 선발기준인 세포 부착성을 보다 신속하고 간편하게 선발하는 방법을 개발하기 위하여 다양한 분리원에서 분리한 bifidobacteria 균주의 Caco-2 세포에 대한 부착성과 이 균주들의 세포 표면 소수성을 측정하여 이에 대한 상관관계를 밝히고자 연구를'수행하였다.
제안 방법
- Bifidobacteria의 균수에 따른 부착성의 변화를 측정하기 위하여, 균 현탁액을 희석 또는 농축하여 CFU/well의 범위에서 반응 균수를 조정 하였을 때의 부착성을 측정하였다. Bifidobacteria의 Caco- 2 세포 부착 반응시간에 따른 부착성의 변화는 CFU/mL 의 실험 균주를 첨가하고 CO2 배양기에서 배양하면서 2시간 간격으로 24시간 동안 관찰하였다
- 부착성 측정은 직접계수법(Direct counting)으로 실시하였다. Bifidobacteria의 균수에 따른 부착성의 변화를 측정하기 위하여, 균 현탁액을 희석 또는 농축하여 CFU/well의 범위에서 반응 균수를 조정 하였을 때의 부착성을 측정하였다. Bifidobacteria의 Caco- 2 세포 부착 반응시간에 따른 부착성의 변화는 CFU/mL 의 실험 균주를 첨가하고 CO2 배양기에서 배양하면서 2시간 간격으로 24시간 동안 관찰하였다
- Caco-2 세포는 DMEM(Dulbe-cco's modified Eagle's minimal essential medium, Gibco-BRL, Rockville, MD) 배지에 10%의 불성화된 fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL)과 1%의 비필수 amino acid(Gibco-BRL)7} 함유된 배지를 사용하였다. 모든 배양은 CO2 배양기(Sanyo, Japan)에서 5%의 C6와 95% air 조건으로 37℃에서 실시하였으며, 완전한 세포 단층이 형성될 때까지 매일 배지를 교환하면서 현미경으로 관찰을 실시하였다. 세포의 계대 배양은 세포 단층이 형성된 후 PBS bufi&로 3회 세척하고 0.
- 실험 균주의 현탁액 3 mL에 동량의 hexadecane (Sigma)을 넣고 1분간 vortexing한 후에 상온에서 20분간 방치하여 층이 분리되도록 하였다. 분리된 층중에서 하층의 수용성 층의 흡광도를 600 nm에서 측정하여 세포 표면 소수성을 아래와 같이 계산하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다.
- 실험 균주의 부착성 실험은 24 well plate에 멸균된 glass cover slip(12x12 mm, Coming)을 장착하고, 여기에 Caco-2 세포를 배양하여 세포 단층이 형성된 것을 Tuomola와 Sal- minen(1988)의 방법을 개선하여 사용하였다. 원심분리로 회수된 균체를 PBS buffer로 3회 세척한 후, 세포 현탄액을 제조하여 610 nm에서 동일한 buff&를 이용하여 흡광도를 1.
- 실험 균주의 세포 표면 소수성 검사는 Perez 등(1998)의 방법을 응용하여 실시하였다. 회수된 실험 균주를 PBS buffere] 재현탁하여 600 nm에서의 흡광도를 1.
- 실험 조건에 따른 부착성의 변화를 측정하기 위하여 bifidobacteria의 균수와 Caco-2 세포 부착 반응 시간에 따른 부착성의 변화를 측정하였다. 부착성 측정은 직접계수법(Direct counting)으로 실시하였다.
- 방법을 개선하여 사용하였다. 원심분리로 회수된 균체를 PBS buffer로 3회 세척한 후, 세포 현탄액을 제조하여 610 nm에서 동일한 buff&를 이용하여 흡광도를 1.0 으로 조정하고 동시에 실험 균주의 생균수도 측정하였다.
- 8 mL를 혼합하여 접종하였다. 접종된 24 well plate는 CO2 배양기에서 2시간 배양한 후, PBS buftCr로 5회 세척하고 methyl alcohol로 5분간 고정화 시킨 후에 Gram 염색을 하여 현미경으로 실험 균주의 부착성을 확인하였다. 현미경으로 검경할 때 무작위로 20부위를 선정하여 100개의 Caco-2 세포에 부착되어 있는 bifidobacteria의 수를 계수하고 그 평균치를 부착성으로 계산하였다.
- 접종된 24 well plate는 CO2 배양기에서 2시간 배양한 후, PBS buftCr로 5회 세척하고 methyl alcohol로 5분간 고정화 시킨 후에 Gram 염색을 하여 현미경으로 실험 균주의 부착성을 확인하였다. 현미경으로 검경할 때 무작위로 20부위를 선정하여 100개의 Caco-2 세포에 부착되어 있는 bifidobacteria의 수를 계수하고 그 평균치를 부착성으로 계산하였다.
대상 데이터
- 실험에 이용하였다. Caco-2 세포는 DMEM(Dulbe-cco's modified Eagle's minimal essential medium, Gibco-BRL, Rockville, MD) 배지에 10%의 불성화된 fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL)과 1%의 비필수 amino acid(Gibco-BRL)7} 함유된 배지를 사용하였다. 모든 배양은 CO2 배양기(Sanyo, Japan)에서 5%의 C6와 95% air 조건으로 37℃에서 실시하였으며, 완전한 세포 단층이 형성될 때까지 매일 배지를 교환하면서 현미경으로 관찰을 실시하였다.
- animalis subsp. lactis(for- merly Bifidobacterium lactis) BB12(Chr. Hansen A/S, Hor- sholm, Denmark)와 B. longum 2(Wiesby Laboratorium, Niebull, Germany) 등을 각 종균사로부터 분양 받아서 사용하였다
- 실험에 사용하였다(Table 1). 공시균주로는 Bifido-bacterium asteroides ATCC 25910, Bifidobacterium longum ATCC 15707, Bifidobacterium suis ATCC 27533, Bifidobacterium thermophilum ATCC 25525를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 상업적으로 판매되고 있는 B.
- 본 연구에 사용된 bifidobacteria는 경인 지역에서 출생한 12개월령 이하의 건강한 유아 15명의 분변으로부터 분리하여 한국야쿠르트 중앙연구소에 보관중인 10개 균주와 공시 균주 4개 균주 및 상업용으로 판매되는 2개 균주 등 총 16개 균주를 실험에 사용하였다(Table 1). 공시균주로는 Bifido-bacterium asteroides ATCC 25910, Bifidobacterium longum ATCC 15707, Bifidobacterium suis ATCC 27533, Bifidobacterium thermophilum ATCC 25525를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험실에 사용한 Caco-2 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에 구입하였으며, passage number 50 ~70의 세포를 실험에 이용하였다. Caco-2 세포는 DMEM(Dulbe-cco's modified Eagle's minimal essential medium, Gibco-BRL, Rockville, MD) 배지에 10%의 불성화된 fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL)과 1%의 비필수 amino acid(Gibco-BRL)7} 함유된 배지를 사용하였다.
- 실험에 사용된 bifidobacteria는 paraffin oil이 중층된 modified BL broth(Tera#uchi 등, 1978)를 사용하여 37℃에서 18~24시간 배양하였으며, 실험 전에 2회 이상의 계대 배양을 통해 활력을 충분히 높인 후에 사용하였다. 순수분리 및 동정이 완료된 bifidobacteria는 paraffin oil 이 중층된 modified BL broth에 18시간 배양한 후 3, 000 rpm에서 20분간 원심분리 (Union 32R, Hanil Science Industrial, Korea)하고 상징액을 3% sodium 미utamate가 함유된 12% 멸균 환원 탈지유로 치환하여 -70℃ deep freezer(MDF-U6086S, Sanyo Electronic Co.
이론/모형
- 실험 조건에 따른 부착성의 변화를 측정하기 위하여 bifidobacteria의 균수와 Caco-2 세포 부착 반응 시간에 따른 부착성의 변화를 측정하였다. 부착성 측정은 직접계수법(Direct counting)으로 실시하였다. Bifidobacteria의 균수에 따른 부착성의 변화를 측정하기 위하여, 균 현탁액을 희석 또는 농축하여 CFU/well의 범위에서 반응 균수를 조정 하였을 때의 부착성을 측정하였다.
성능/효과
- 3에서 보는 바와 같이 실험 균주의 부착성과 소수성간의 상관관계가 확인이 되었다. Caco-2 세포에 200개 이상이 부착되는 실험 균주는 모두 60% 이상의 세포 표면 소수성을 나타내고 있으므로 부착성이 우수한 균주 선발 시 1차적으로 분리 균주의 세포 표면 소수성을 측정하여 선발하는 것이 가능하다고 판단되었다.
- 실험 균주가 부착된 Caco-2 세포를 Gram 염색하여 관찰할 경우 Fig. 4에서 보는 것과 같이 실험 균주가 대부분 Caco-2 세포와 세포 사이의 tight jumction에 주로 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 한국인 유아의 분변에서 분리한 10종의 분리 균주와 4종의 공시 균주(B longum ATCC 15707, B. thermophilum ATCC 25525, B. suis ATCC 27533, B. asteroides ATCC 15910) 및 2종의 상업용 종균(3. animalis subsp. lactis BB12, B. longum 2)의 세포 표면 소수성을 측정한 결과는 Fig. 1에서 보는 바와 같이 균주에 따라 매우 다른 결과를 나타냈으며, 균종간의 일정한 경향은 관찰되지 않았다.
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