[논문]김치 유산균의 Caco-2 세포막 부착성 및 Aflatoxin B1 제거 효과

이정민

doi:10.3746/jkfn.2005.34.5.581

문제 정의

mesenteroides KCTC 3100의 장점 막 세 포에 대한 부착성을 확인하기 위하여 Caco-2 결장암세포를 이용하였으며 또한 유산균의 생존 여부와 세포벽의 구조적 변화가 부착성에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 유산 균을 열처리하거나 강산에 처리한 후 균체의 부착성을 비교 실험 하였다. 그리고 식품산업 화의 보다 폭넓은 응용 가능성 을 검토하기 위 해 김치유산균의 AF%에 대한 흡착능을 생 균, 열처리 및 강산 처리한 후 확인하고자 하였다.
김치의 발효와 숙성 에 관여 하는 2종의 유산균과 3종의 유 제품으로부터 분리 된 유산균을 Caco-2 세포 부착성 과 AFBi 흡착능에 대해 비교 검토하여 보았다. 또한 유산균을 생균 군, 열처리군, 강산처리군으로 나누어 유산균의 부착성 및 흡착력이 세포벽의 구조와 관련이 있다는 보고를 재확인하 고자 하였 다.
하지 만 프로바이오틱스로서의 김 치 유산균에 대한 장점막세포 부착성에 대한 연구는 아직 미비하게 수행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 L plantarum KCTC 3099와 L. mesenteroides KCTC 3100의 장점 막 세 포에 대한 부착성을 확인하기 위하여 Caco-2 결장암세포를 이용하였으며 또한 유산균의 생존 여부와 세포벽의 구조적 변화가 부착성에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 유산 균을 열처리하거나 강산에 처리한 후 균체의 부착성을 비교 실험 하였다. 그리고 식품산업 화의 보다 폭넓은 응용 가능성 을 검토하기 위 해 김치유산균의 AF%에 대한 흡착능을 생 균, 열처리 및 강산 처리한 후 확인하고자 하였다.
Aflatoxins은 Aspergillus 속의 곰팡이에서 생성되는 미생물독소로서 사람과 동물 모두에게 돌연변이 및 발암에 관 여하여 치명적인 해를 끼칠 수 있다. 따라서 이전의 연구에 서 프로바이오틱 미생물이 식품의 오염원으로 작용하는 af latoxins] AFBi) 의 제거에 이용되는 것은 대체로 독소의 흡 착에 의한 제거나 독소를 세포내에서 대사하여 보다 독성이 약한 물질로 전환시 킬 수 있는 방안을 개발하고자 하는 목적 으로 시도되었다. 유산균의 AFBi 에 대한 흡착능은 유산균 의 종에 따라 다양하게 나타나고 있음을 알 수 있으며 또한 유산균의 처 리 방법 에 따라서도 차이를 나타내 었다.
김치의 발효와 숙성 에 관여 하는 2종의 유산균과 3종의 유 제품으로부터 분리 된 유산균을 Caco-2 세포 부착성 과 AFBi 흡착능에 대해 비교 검토하여 보았다. 또한 유산균을 생균 군, 열처리군, 강산처리군으로 나누어 유산균의 부착성 및 흡착력이 세포벽의 구조와 관련이 있다는 보고를 재확인하 고자 하였 다. L.

제안 방법

박테리아 계수는 공냉식 488-nm argon-ion laser(15 mV)를 장착한 FACS Calibur flow cytometry> 이용하여 결정 하였다. 내부교정 (internal cali bration)-!- 위 해서 Fluoresbrite beads(2.0 Um, Polysciences Inc.)를 사용하였으며 브]■테리아 생존률은 1 M/106~107bac teria 농도의 SYTOX green nucleic acid stain(Molecular Probes, S-7020)을 사용하여 측정하였다. 이 때 green SYTOX 파장을 확인하기 위해 525 nm의 필터를 부착하였다.
HPLC를 통한 AFBi 측정과정은 이전의 연구에서 수행된 바 있는 것을 본 실험 에 적합하도록 변형하였다(7). 상층액 으로부터 AFBi의 추출없이 직접 70 UL 상층액을 HPLC에 주입하였다.
먼저 위에서 제시된 방법에 따라 유산균 현탁액을 만들어 분화된 Caco-2 세포에 1시간 동안 처리하여 PBS로 3번 세척하였다. PBS에 녹인 3%(w/v) paraformaldehyde를 30분간 처리하여 상온에서 고정시킨 후 PBS로 3번 세척 하였고 공기 중에서 건조시 켜 그람 염 색 을 수행하여 15곳을 무작위로 선택하여 현미경상에서 관찰 하였다.
이 때 green SYTOX 파장을 확인하기 위해 525 nm의 필터를 부착하였다. 균수 확인을 위한보다정확한 비교로서 MRS 평판배지에 10배씩 연속 희석한 유산균을 도말하여 CFU를 측정하였다. 장내세 포 부착성과 AFBi 흡착성 실험을 위해서 2X109 CFU/mL 의 유산균을 사용하였으며 이 에 해당되는 ODeoo 값을 기록 하여 방사선 동위 원소의 사용으로 인한 측정기기의 오염을 방지하기 위해 차후에 균수를 확인하는데 사용하였다.
7 Ci mmol/mL, BMS, USA)을 대수기에 있는 유산균 전배양액으로부터 재접종된 5 mL의 배 양액 에 첨 가하여 37℃에서 4시 간 200 rpm으로 진 탕 배 양하였다. 균체를 2, 500 xg에서 20분간 원심 분리 하여 수집한 후 생균군, 열처리군(PBS에서 1시간 가열), 강산처 리군(2 M HC1 에서 1시간 처리)으로 나누어 각각의 조건에 따라 처 리 한 후 최 종수집 하여 PBS로 3회 세 척 하였다. Caco- 2 세포 부착성 실험은 생균, 열처리, 강산 처리된 3그룹의 방 사선 동위원소로 표지된 유산균 50 UL 현탁액(2X10, CFU) 을 세포에 처리하여 37℃에서 1.
5 mL PBS에 재현탁시켜 37℃에서 1시간 배양하였다. 다시 2, 500xg에서 20분간 원심 분리하여 균체를 제거한 후 상층액에 남아있는 AFBr의 함 량을 HPLC로 측정하였다.
모든 균 주는 deMan-Rogosa-Sharpe(MRS)배지 (Oxoid, Hamp shire, United Kingdom) 에서 호기 적 조건 (37℃, 10% CO2)으로 16 〜 24시간 배양하였다. 박테리아 계수는 공냉식 488-nm argon-ion laser(15 mV)를 장착한 FACS Calibur flow cytometry> 이용하여 결정 하였다. 내부교정 (internal cali bration)-!- 위 해서 Fluoresbrite beads(2.
Caco-2 세포에 대한 부착성 실험은 24-well tis- sue culture plates에 5 x io, 세 포/well을 초기 접 종하여 세 포 간의 접 촉이 있을 때까지 배 양한 후 2주간 분화(differentia tion) 시켜 사용하였다. 배지는 매일 신선한 것으로 교체시켜 배양하였고 부착성 실험 한시간 전에 FBS를 첨가하지 않은 MEM 배지로 교체한 후 실험하였다.
결장암 세포(ATCC HTB37)는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA) 에서 구입 하였다. 세포는 20% heat - inacti vated( 55℃, 30 min) fetal bovine serum(FBS, Whitaker, USA), 2 mM L-glutamine (Sigma, USA), 100 U/mL penicillin and 100 mg/mL strep tomycin (Bio Whitaker, USA) 를 첨가한 MEMCminimum es sential medium)으로 5% COz 배 양기 에 서 37℃ 항온하여 배 양하였다. Caco-2 세포에 대한 부착성 실험은 24-well tis- sue culture plates에 5 x io, 세 포/well을 초기 접 종하여 세 포 간의 접 촉이 있을 때까지 배 양한 후 2주간 분화(differentia tion) 시켜 사용하였다.
9 M NaOH로 구성된 용액 500 卩L를 처리한 후 37℃에서 1시간 배양하여 세포질 을 용출시켰다. 세포질 용출액을 5 mL의 scintillation 용액 에 혼합하여 Beckman LS 6500 scientillation counter에서 방사능 수치 (cpm)을 측정하였다.
유산균의 Caco-2 세포에 부착한 형태를 관찰하기 위해 그람염색을 수행하였다. 먼저 위에서 제시된 방법에 따라 유산균 현탁액을 만들어 분화된 Caco-2 세포에 1시간 동안 처리하여 PBS로 3번 세척하였다.
균수 확인을 위한보다정확한 비교로서 MRS 평판배지에 10배씩 연속 희석한 유산균을 도말하여 CFU를 측정하였다. 장내세 포 부착성과 AFBi 흡착성 실험을 위해서 2X109 CFU/mL 의 유산균을 사용하였으며 이 에 해당되는 ODeoo 값을 기록 하여 방사선 동위 원소의 사용으로 인한 측정기기의 오염을 방지하기 위해 차후에 균수를 확인하는데 사용하였다.

대상 데이터

2종의 김치유산균을 포함하여 모두 5종의 유산균을 한국 균주은행 任Corean Type Culture Collection, KTCC)에서 구입 하였으며 균주는 다음과 같다; Lactobacillus rhamnosus GG (양성 대 조군), L. casei 01, L. casei KCTC 3109, L. plant arum KCTC 3099, L. mesenteroides KCTC 3100. 모든 균 주는 deMan-Rogosa-Sharpe(MRS)배지 (Oxoid, Hamp shire, United Kingdom) 에서 호기 적 조건 (37℃, 10% CO2)으로 16 〜 24시간 배양하였다.
Caco-2.결장암 세포(ATCC HTB37)는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA) 에서 구입 하였다. 세포는 20% heat - inacti vated( 55℃, 30 min) fetal bovine serum(FBS, Whitaker, USA), 2 mM L-glutamine (Sigma, USA), 100 U/mL penicillin and 100 mg/mL strep tomycin (Bio Whitaker, USA) 를 첨가한 MEMCminimum es sential medium)으로 5% COz 배 양기 에 서 37℃ 항온하여 배 양하였다.
유산균의 Caco-2 세포에 대한 부착능 은 유산균의 종에 따라 다양하게 나타나고 있지 만 유산균의 처리방법에 따라서는 큰 차이를 나타내지 않았다. L. rham- nosusGG의 경우 장내 세포에 대한 부착능이 뛰어난 것으로 알려져 있어 본 실험 에서 양성 대조군으로 사용하였다. 김치 유산균인 L.
상층액 으로부터 AFBi의 추출없이 직접 70 UL 상층액을 HPLC에 주입하였다. 사용한 HPLC system(Waters, USA)은 dual pi imp model 400 solvent delivery sytstem, model 980 pro grammed fluorescence detector, 그리고 Cis guard column 을 장착한 220 x 4.6 mm 크기 의 5 Um ODS Spheri-5 Brownlee column로 구성하였다. Water-acetonitrile-methanol(60 : 30 : 10 by vol)을 mobile phase로 사용하였고 flow rate는 1 mL/min로 하였고 파장은 365 nm에서 excitation 그리고 418 nm에서 emission 되도록 고정하였다.

데이터처리

유산균의 Caco-2 세포부착성 과 AFBi 흡착력 에 관한 실 험에서 얻어진 자료로부터 Studenfs t-test를 이용하여 통 계분석하였고 5% 이내에서 통계적 유의성을 부여하였다.

이론/모형

유산균의 AFBi 에 대한 흡착능은 유산균 의 종에 따라 다양하게 나타나고 있음을 알 수 있으며 또한 유산균의 처 리 방법 에 따라서도 차이를 나타내 었다. AFBi에 대한 유산균의 흡착력은 유의성을 지니기 위해 균수를 최소 "IO, 으로 하여야 한다는 El-Nezami 등⑺의 보고에 따라 동일한 균수를 본 실험 에서는 사용하였다. Table 2에서 나타 낸 바와 같이 l.

성능/효과

또한 유산균을 생균 군, 열처리군, 강산처리군으로 나누어 유산균의 부착성 및 흡착력이 세포벽의 구조와 관련이 있다는 보고를 재확인하 고자 하였 다. L. plantarum KCTC 3099의 경 우 Caco-2 세 포 부착성이나 AFBi 흡착능이 높게 나타났으며 이것은 양성 대 조군으로 사용된 L. rhamnosus GG와 유사한 수준을 나타 내었다. 하지만 L mesenteroides KCTC 3001은 Caco-2 부착 성은 다소 높게 나타났으나 AFBi 흡착능은 낮게 나타났다.
rham- nosusGG의 경우 장내 세포에 대한 부착능이 뛰어난 것으로 알려져 있어 본 실험 에서 양성 대조군으로 사용하였다. 김치 유산균인 L. plantarum KCTC 3099와 L. mesenteroid.es KCTC 3001 모두 높은 장내세포 부착능을 보였으나 L plantarum KCTC 3099가 보다 효과적으로 나타났고 양성 대조군에 비 해 보다 높은 장내세포 부착능을 나타내었으나 L. mesenteroides KCTC 3001은 양성 대조군에 비 해 다소 낮은 부착능을 나타내었다. 나머지 L.
특히 열처 리군의 경우 AFBi이 유산균 세포질 내로 유 입되어 대사될 수 있는 가능성을 배제시켰음으로 상층액에 서 AFBi 함량의 감소는 유산균 세포벽 과의 결합에 의 한 것 으로 추측할 수 있다. 따라서 본 실험 에서 생균군보다 열처 리 군의 흡착력 이 높은 것은 AFBi의 세포질 대사를 중단시 켰기 때문이거나 열처리로 인한 표면 수용체 물질들의 구조 적 변형이 AFBi이 결합하기에 적합한 방향으로 진행되었을 가능성도 있을 것으로 사료된다. 강산처 리군의 경우는 보다 높은 AFBj 흡착능을 나타내었는데 이것은 세포벽의 구조적 변화에 기인한 것으로 사료된다.
이것은 Caco-2 세포에 결합하는 부위와 AFBi에 결합하는 부위가 일치 하지 는 않는다는 것을 암시 하는 것으로 사료된 다. 또한 유산균의 처 리 방법 에 따라서 도 다양한 차이 를 보였 는데 본 실험 에서는 강산처 리군의 경우 보다 효과적 인 것으 로 나타났으며 세포벽 의 주된 구조인 peptidoglycan과 pol ysaccharides 이 강산의 처리에 의해 결합이 파괴되면서 Caco- 2 세포 부착성 이나 AFBi 흡착능의 상승에 영 향을 미 쳤으리 라 여겨진다. 하지만 강산처리에 의한 세포벽의 변화는 비특 이적으로 발생하기 때문에 동일한 형 태로 모든 유산균에 적용 되기는 어려울 것이며 각 유산균종의 세포벽 구조와 특이 성 분의 함량에 따라 다양하게 변화가 일어날 것으로 사료된다.
따라서 방사선 동위 원소를 이용한 유산균의 장점 막 세 포 부착능 실 험 에 는 필수적 으로 Gram-staining-4- 통한 현 미경적 관찰이 필요하리라 여겨진다. 본 실험에서도 유산균의 부착 후 Gram-staining 하여 현미경을 관찰한 결과를 Fig. 1에서 나타내었는데 chain 형상의 유산균은 없었으며 모두 개체별로 관찰되었고 대개 2〜3개의 유산균이 서로 결합된 채 관찰되었다.
casei 3109의 경우는 양성 대조군에 비 해 매우 낮은 부착능을 나타 내 었다. 유산균 처 리 방법 에 따라서도 다소 차이 를 나타내 었 는데 생균(viable cell)보다는 열처리군과 강산 처리군에서 부착능이 증가하는 경 향을 확인하였으나 강산 처 리군을 제 외 하면 통계적 유의 성은 낮게 나타났다. L rhamnosus GG의 부착능이 14.
따라서 이전의 연구에 서 프로바이오틱 미생물이 식품의 오염원으로 작용하는 af latoxins] AFBi) 의 제거에 이용되는 것은 대체로 독소의 흡 착에 의한 제거나 독소를 세포내에서 대사하여 보다 독성이 약한 물질로 전환시 킬 수 있는 방안을 개발하고자 하는 목적 으로 시도되었다. 유산균의 AFBi 에 대한 흡착능은 유산균 의 종에 따라 다양하게 나타나고 있음을 알 수 있으며 또한 유산균의 처 리 방법 에 따라서도 차이를 나타내 었다. AFBi에 대한 유산균의 흡착력은 유의성을 지니기 위해 균수를 최소 "IO, 으로 하여야 한다는 El-Nezami 등⑺의 보고에 따라 동일한 균수를 본 실험 에서는 사용하였다.
따라서 AFBi의 제거 는 오염된 곡물이나 유가공품의 폐기로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있음으로 산업적으로 중요하게 여겨지고 있다. 최 근에 Lactobacillus 속의 유산균이 장점 막세포 부착성 이 뛰 어남과 동시에 AFBi의 제거에도 유용한 것이 알려졌다. 따 라서 김 치 로부터 장내 세포 부착성 이 높음과 동시 에 식품근 원의 독성물질을 제거할 수 있는 유산균을 발굴하는 것은 김 치의 기능성과 산업화 증대에 기여할 수 있으리라 사료된다.

후속연구

최 근에 Lactobacillus 속의 유산균이 장점 막세포 부착성 이 뛰 어남과 동시에 AFBi의 제거에도 유용한 것이 알려졌다. 따 라서 김 치 로부터 장내 세포 부착성 이 높음과 동시 에 식품근 원의 독성물질을 제거할 수 있는 유산균을 발굴하는 것은 김 치의 기능성과 산업화 증대에 기여할 수 있으리라 사료된다.
johnsonii Lal 는 lipoteichoic acid가 주요 한 물질로 밝혀졌다(9, 10). 본 실험에서는 유산균의 생존여 부와 세포벽의 구조적 변화가 부착성에 미치는 영향을 평가 하기 위해 열과 강산에 처리하였으나 열처리군의 경우 큰 유의성을 발견하지는 못하였다. 하지만 강산처리군의 경우 부착능이 증가한 것은 강산에 의해 세포벽의 peptidoglycan 구조가 파괴되면서 재정렬된 세포벽의 구조 및 성질에 의한 결과로 추측된다.

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