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문제 정의
- 이 연구에서는 우리나라에서 많이 사용되는 살균제 procymidon과 살충제 parathion 및 제초제 alachlor 에대해 분해력이 있는 토양세균을 선발하여 각종 농약의 분해효과, 분해에 미치는 환경요인을 조사하였으며, 특히 농약의 분해능이 높은 미생물을 동정하였다.
제안 방법
- 접종원으로 사용한 278개의 세균은 1/10 TSA배지에서 48시간 배양하였으며, 농도는 멸균증류수에 현탁하여 108 CFU mL-1의 농도로 조절하였다. 2 차 선발에서는 1차에서 선발된 12균주를 3종의 농약을 포함하여 12종의 약제(살균제, chlorothalonil, edifenphos, procymidone, IBP; 살중제, ethoprophos, parathion, phenthoate; 제초제, alachlor, butachlor, molinate, pendimethalin, thiobencarb) 에 대하여 표준사용농도와 이의 1/10 농도에서 전술한 방법으로 접종하여 생장력이 왕성한 2균주를 선발하였다.
- TSB배지의 pH를 각각 4, 5, 6, 7, 8, 9로 조정, 멸균한 후 3종의 농약(procymidone, parathion, alachlor)을각각 40 mg a.i. L-1가 되도록 첨가, 공시 2균주를 전술한 방법으로 21일간 배양하면서 배양액중 잔류하는 농약 성분을 GLQ로 분석하여 농약분해율을 조사하였다.
- 0) 를 이용하여 20분씩 2회 세척, 1% ostnic acid(OSO4)에 2시간 동안 이 중 고정한 후 증류수로 2 회 세척하였다. 고정된 시료는 ethanol series와 amyl acelate 에서 탈수하고 임계점 건조 (Hitachi, HCP-2 Critical Point Dryer) 과정을 거쳐 200 ~300A 의 gold-palladium으로 coating 한 후 주사 전자현미경 (Hitachi S570)하에서 조사하였다.
- 공시균주에 의한 배양액 중 농약의 분해율을 측정하기 위하여 Screw-capped tube에 배양액 1 mL를 취하고 여기에 hexane 10 mL 및 포화식염수 1 mL를 첨가, 3분간 초음파 처리 (Branson 8200), 이를 다시 3분간 격렬하게 진탕한 후, hexane층을 분리, 여기에 무수황산나트륨 1 g을 첨가하여 수분을 제거하고 적당량 희석하여 GLC(Gas Liquid CMomatograph)분석을 하였다. 본 실험에서 사용한 각 농약의 기기분석조건은 표 1과 같다.
- 균주선발은 2차에 걸쳐서 수행하였는데, 1차 선발은 표준사용농도의 procymidone, parathion, alachlor가함유된 1/10 TSA 배지에 세균현탁액을 10 µL씩 점적, 28℃에서 2일간 배양 후 생장력이 왕성한 12 균주를 선발하였다. 접종원으로 사용한 278개의 세균은 1/10 TSA배지에서 48시간 배양하였으며, 농도는 멸균증류수에 현탁하여 108 CFU mL-1의 농도로 조절하였다.
- 1/가 되도록 무균적으로 첨가하고 전술한 방법으로 조제한 접종원을 1 mL씩 접종, 다시 12일간 진탕배양(28℃, 150 rpm)하면서 농약 분해율을 조사하였다. 농약농도별 선발균주의 농약분해 농약농도를 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 mg a.i. L-1로조정한 TSB배지에 공시한 2균주를 접종, 앞서의 방법과 동일하게 21일간 배양하면서 농약분해율을 조사하였다.
- 토양시료 1 g씩을 멸균증류수 9 mL에 넣고 진탕한 후 10-5, 10-7배로 순차적으로 희석하였다. 멸균한 TSA(Tryptic soy agar, Difco, 3 g tryptic soy broth, 15 g agar)배지에 3종의 시험농약(pro-cymidone, parathion, alachlor) 을 각각 40 mg a.i. L-1가 되도록 첨가, Petri dish에 20 mL씩 분주하여, 상기의 토양 희석액 0.1 mL 씩을 도말, 28℃에서 2~3일간 배양하여 형태적으로 상이한 278개(procynidone, 153; parathion, 50; alachlor, 75)의 colony를 분리하였다. 분리된 세균은 1/10 TSA에서 순수분리 과정을 거쳐 10% glycerol 을 첨가하여 -80℃에서 동결보존하면서 실험에 사용하였다.
- 93%)이었다. 삼각플라스크(250 mL) 에 TSB(Tryptic soy broth, tryptone 17 g, soytone 3 g, dextrose 2.5 g, NaCl 5 g, K2HPO4 2.5 g, distiUed water 1000 mL, pH 7.0)배지를 100 mL씩 분주, 멸균한 후, 이들 농약의 최종농도가 40 mg a.i. 1/가 되도록 무균적으로 첨가하고 전술한 방법으로 조제한 접종원을 1 mL씩 접종, 다시 12일간 진탕배양(28℃, 150 rpm)하면서 농약 분해율을 조사하였다. 농약농도별 선발균주의 농약분해 농약농도를 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 mg a.
- 선발된 2균주를 procymidone, parathion 및 alachlor가 40 mg a.i. L1 함유된 TSB 배지에 접종, 진탕배양 (28℃, 150 rpm)하면서 12일까지 3일 간격으로 농약의 분해와 균증식정도를 조사하였다. 균증식 정도는 희석 평판법으로 조사하였다.
- 7)(Jones 등, 1993)을 이용해서 농약분해균을 동정하였다. 세균의 형태 조사를 위하여 TSA 배지에서 28℃, 16시간 배양한 colony를 배지와 함께 잘라(0.5x0.5cm) 4℃의 kamovsky 고정액에서 12시간 고정한 후 0.05M cacodylate buffer(pH 7.0) 를 이용하여 20분씩 2회 세척, 1% ostnic acid(OSO4)에 2시간 동안 이 중 고정한 후 증류수로 2 회 세척하였다. 고정된 시료는 ethanol series와 amyl acelate 에서 탈수하고 임계점 건조 (Hitachi, HCP-2 Critical Point Dryer) 과정을 거쳐 200 ~300A 의 gold-palladium으로 coating 한 후 주사 전자현미경 (Hitachi S570)하에서 조사하였다.
- 이들은 실험에 사용된 농약에 관계없이 다양한 농약이 함유된 배지에서 생장이 양호하였으므로 약제내성을 가지고 있거나, 농약분해능이 우수한 균주로 판단하고 농약분해정도 및 특성조사에 이용하였다.
- 접종원으로 사용한 278개의 세균은 1/10 TSA배지에서 48시간 배양하였으며, 농도는 멸균증류수에 현탁하여 108 CFU mL-1의 농도로 조절하였다. 2 차 선발에서는 1차에서 선발된 12균주를 3종의 농약을 포함하여 12종의 약제(살균제, chlorothalonil, edifenphos, procymidone, IBP; 살중제, ethoprophos, parathion, phenthoate; 제초제, alachlor, butachlor, molinate, pendimethalin, thiobencarb) 에 대하여 표준사용농도와 이의 1/10 농도에서 전술한 방법으로 접종하여 생장력이 왕성한 2균주를 선발하였다.
- 토양시료로부터 분리된 278균주 중에서 농약 분해에 직접 관여하는 균주를 선발하기 위해 2차에 걸쳐 여러 가지 약제가 함유된 배지에서 생육이 양호한 균주를 선발하였다. 1차 선발에서는 procymidone, para- thion, alachlor의 표준사용농도의 1/10 농도에서 생육 정도가 양호한 12균주를 선발하였고, 선발된 12 균주를 상기의 3종 농약을 포함한 12종 농약의 표준사용농도 및 그 1/10 농도로 함유된 배지에서의 생장 정도는 표 3과 같다.
대상 데이터
- 8em;"> 사멸하는 균주도 있었다. 12균주 중에서 B59 와 B기이 12가지 농약의 표준사용농도에서도 생육이 양호하였으므로 이들 두 균주를 최종적으로 선발하였다. 농약 분해균주를 선발하기 위하여 경기도 지역 10 개소의 시설하우스와 밭에서 각각 30점씩의 토양 시료를 채취하였다. 토양시료 1 g씩을 멸균증류수 9 mL에 넣고 진탕한 후 10-5, 10-7배로 순차적으로 희석하였다.
- 시험에 사용된 농약은 살균제 2종, 살충제 2종, 제초제 2종을 포함하여 6종으로 제품은 시중에서 구입하였고, 원제는 농업과학기술원에서 분양받았다. 제품으로 사용한 약제는 procymidone 수화제 (a.
- 제품으로 사용한 약제는 procymidone 수화제 (a.i. 50%), parathion 유제(a.i. 17%), pendimethalin 유제(a.i. 31.7%) 이며 원제로 사용한 약제는 chlorothalonil(a.i. 85%), ethoprophos(a.i. 90%), alachlor(a.i. 93%)이었다. 삼각플라스크(250 mL) 에 TSB(Tryptic soy broth, tryptone 17 g, soytone 3 g, dextrose 2.
- 형태적 특징, 생리생화학적 특성 및 미생물 동정 system으로 선발된 2종의 세균을 동정하였다. B59는 짧은 간상의 형태로 쌍을 이루고 있었으며, 크기는 0.
이론/모형
- L1 함유된 TSB 배지에 접종, 진탕배양 (28℃, 150 rpm)하면서 12일까지 3일 간격으로 농약의 분해와 균증식정도를 조사하였다. 균증식 정도는 희석 평판법으로 조사하였다.
- 선발된 농약 분해균의 형태적, 세균학적, 생리 생화학적 특성을 後藤과 龍川(1984a, 1984b, 1984c, 1984d) 의 방법으로 조사하여 Bergey's manual의 검색표(Holt 등, 1994)를 기준으로 동정하였으며, 추가로 동정 system인 GC-Fatty acid 분석기 (HP 6890, Sherlock)와 Biolog system(Bio Log™ V.3.7)(Jones 등, 1993)을 이용해서 농약분해균을 동정하였다. 세균의 형태 조사를 위하여 TSA 배지에서 28℃, 16시간 배양한 colony를 배지와 함께 잘라(0.
성능/효과
- Alachlor는 배양 9일차에 B59균주 접종구는 59.6%, B기균주는 57.4%의 분해율을 보였고 배양 21일 차에는 각각 80.4%와 68.8%의 분해율을 보여 대조구 41% 의 분해율에 비해 28~40%의 분해촉진효과가 있었다 (그림 2).
- 대조구와 균 접종 구에 있어서 배양 21일차의 분해율을 비교하면 균 접종구에서의 분해율이 25-31% 높았다(그림 2). Parathione B59균주 접종구에서 배양 직후부터 급격히 분해되어 배양 6일차에는 93%의 분해율을 보이다가 그 후 완만하게 진행되어 배양 18일차 이후에는 거의 전부 분해되었는데, 배양 6일까지의 분해속도는 6.7 mg day '이었으며 대조구에서 가수분해에 의한 분해속도를 빼면 균에 의한 분해속도는 1.6 mg day-1이었다. 반면 B71 균주는 배양 9일차에 분해율이 38% 에 이르렀고 그 이후로 완만하게 분해되었다(그림 2).
- 그리고 단위배양기간 중의 균의 증식을 생균 수로 조사한 결과 그림 3에서 보는 바와 같이 약제 간에는 생균 수의 차이가 없고, 균증식이 원활한 초기에 농약 분해율이 높은 경향을 보였으며, 배양후기에는 생균 수가 점차 감소했는데 균의 증식율과 농약 분해율 간에는 상관이 없는 것으로 나타났다.
- 대조구에서의 농약 분해는 주로 가수분해에 의한 것인데 분해율이 배양 9일에 60%까지 상승하였으나 그 이후는 거의 변화가 없었다. 대조구와 균 접종 구에 있어서 배양 21일차의 분해율을 비교하면 균 접종구에서의 분해율이 25-31% 높았다(그림 2). Parathione B59균주 접종구에서 배양 직후부터 급격히 분해되어 배양 6일차에는 93%의 분해율을 보이다가 그 후 완만하게 진행되어 배양 18일차 이후에는 거의 전부 분해되었는데, 배양 6일까지의 분해속도는 6.
- 1993b)와 일치하는 것으로 생각되었다. 또한 3가지 농약 중에서의 분리율과 이들 농약의 포유동물에 대한 독성을 비교했을 때 독성이 가장 높은 parathion 에서의 분리율이 18%로 상대적으로 낮은 것과도 일치하는 것으로 생각되었다.
- 또한 균주에 따라 각 약제의 분해 정도에 차이가 있는 것으로 나타났는데, 이는 각 미생물의 생리작용의 차이와 약제의 구조상의 차이에서 유래된 것으로 생각되었다.
- 분석조건에서 GLC column 온도가 200℃일 때 농약의 retention timee procymidone 6.1 분, chlorothalonil 3.0분, parathion 4.4분 alachlor 2.9분, pendimethalin 4.7 분이었고, ethoprophost- column 온도가 180℃에서 약 2.2분이었으며, 배양액 중에서의 농약 회수율은 78~ 96% 수준이었다.
- 결과는 표 4와 같다. 살균제 procymidone 과 chlorothalonil에 대한 B59균주의 분해율은 각각 76.7% 와 96.1%로 대조구(무접종구)보다 18.9%, 22.9% 분해율이 높았으며, B기균주에서는 70.9%, 76.2%로 대조 구보다 각각 13.1%와 3.0% 분해가 촉진되었다. 살충제 ethoprophos와 parathion의 경우 B59균주에서의 분해율은 대조구보다 각각 26.
- 살균제 procymidone이 함유된 배지에서는 모든 균주가 잘 생육하였으나 chlorothalonil, edifenphos, IBP가함유된 배지에서는 균주의 생육정도가 약제간 그리고 처리 균주 간에 차이가 많았다. 표준사용농도에서는 시설재배지 토양 및 밭토양에서 시료를 채취하여 procymidone, parathion, alachlor가 함유된 1/10 TSA 배지 상에서 생장이 양호하면서 형태적으로 상이한 총 278개의 균주가 분리되었는데, procytnidone을 처리한 배지에서 분리균주의 55%, paraflrion에서 18%, alachlor 에서 27%의 균주를 분리하였다(표 2).
- 이 실험에 사용한 두 균주는 우선 형태적으로 차이가 있을 뿐만 아니라 생화학적 성질에서도 약간의 차이가 있었다. B59는 그람음성, 비운동성이고 oxidase 음성이었으며, B기은 그람 음성, 운동성 및 oxidase 양성이었다(표 5).
- B59는 그람음성, 비운동성이고 oxidase 음성이었으며, B기은 그람 음성, 운동성 및 oxidase 양성이었다(표 5). 이러한 결과 B59와 B71은 각각 Acinetobacter속과 Pseudomonas속으로 추정되었다.
- 이상에서 볼 때 두 균주 모두가 procymidone, parathion, alachlor의 분해를 촉진한 것으로 나타났는데, 이는 처음 선발할 때 이들 3종 농약을 대상으로 선정하였기 때문이라 판단되었고 B59균주가 B71 균주보다 상대적으로 분해능이 높은 것으로 나타났고 특히 parathion에 대한 B59균주의 분해능이 높았다. 또한 균주에 따라 각 약제의 분해 정도에 차이가 있는 것으로 나타났는데, 이는 각 미생물의 생리작용의 차이와 약제의 구조상의 차이에서 유래된 것으로 생각되었다.
- 8em;"> 주지 못하였다. 이상에서 생육에 영향을 준 농약을 함유한 배지에서는 대부분의 균주가 표준사용농도에서 생육이 불가능하였으며, 균주에 따라 1/10 농도에서도 사멸하는 균주도 있었다. 12균주 중에서 까지는 분해율이 70% 이상이었으나 그 이상 농도에서는 분해율이 최고 처리농도에서 최저 59%까지 낮아졌다. 이상의 결과 세 가지 약제의 처리농도는 40 mg a.i. L-1까지는 쉽게 분해되는 것으로 나타났다.
- 0%가 더 분해되었다. 제초제 achlor와 pendimethalin에 대한 B59균주에서 분해율이 대조 구보다 각각 25.0%와 17.1%, B기균주에서는 24.1%와 5.1% 더 분해되는 것으로 나타났다.
후속연구
- 로 동정되었다. 금후 2종의 세균에 대한 추가적인 다양한 조사가 이루어진다면 균의 종명이 결정될 것으로 판단되었다.
- 이러한 토양 중의 농약의 동태는 화학구조, 농도, 제형, 토양형, 유기물함량, 토양 pH, 무기이온, 통기성, 기후조건, 표층의 식생, 미 생물상 등에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다(정과 박, 1990). 따라서 살포되는 많은 부분의 농약은 토양에 집적하게 되며 집적된 농약의 토양 중에서의 행동 양상을 파악하는 것은 토양환경의 보전뿐만 아니라 잔류농약의 위해정도를 평가하는데 귀중한 자료로 이용될 수 있을 것으로 판단되었다.
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