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문제 정의
- 소화관과 간에는 아세트아미노펜을 대사시킬 수 있는 효소가 존재한다. CYP 1A1/2, 2E1과 3A4가 아세트아미노펜의 독성물질인 N-acetyl-p-benzoquinoneimine을 생성하는데 주로 작용하는 효소로 보고되고 있는데 이 중 Caco 2 세포에서 CYP 1A1/2 활성을 평가하고자 하였다.14,15) 3-MC를 함유하는 배양 배지를 사용하여 정상적인 장관 내 세포의 CYP 1A1/2활성과 유사하도록 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 약물흡수와 각 장기간의 상호작용에 의한 영향을 알아보기 위해 소화관과 폐 및 간을 연결하는 pCCA-nGI 디바이스를 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 정사각형 공간에 제작된 웨이퍼를 놓고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 위부분의 plexiglas를 덮고 나사못을 사용하여 양쪽의 덮개를 서로 밀착시켰다. (1CCA 와 μGI tracte 0.25 mm Pharmed tubing(205S: Watson- Marlow: Wilmington, MA, USA)으로 서로 연결이 되도록 하였으며. 이때 튜브 끝은 gel-loading tip을 이용하여 입구와 출구로 연결이 용이하도록 하였다.
- 3 mL 이므로 각 장기에서의 혈류속도로 각 장기의 부피를 나누어 유지 시간을 구하였다.10) 이렇게 얻어진 결과를 이용하여 폐 2초, 간 85초, 소화관 69초, 다른 기관 223초의 유지 시간을 갖도록 디바이스를 디자인하였다. 이때 소화관과 간을 연결시킴으로서 각 장기간의 상호작용을 보고자 하였으므로 소화관에서의 혈류속도(7.
- 15) 3-MC는 정상적인 소화관 상피세포에 존재하는 정도의 효소 활성을 나타내기 위한 대표적인 유도물질로 non-induced Caco 2세포의 CYP 1A1/2의 활성을 증가시킨다.16) CYP 1A1/2의 활성은 Caco 2세포와 10μM 에톡시레조르핀의 배양에 의해 생성된 레조르핀의 농도로 측정하였다. 생성된 레조르핀의 농도는 530 nm excitation, 590nm emission 필터에서 형광을 측정하였다.
- 19) HEp G2/C3A세포와 L2 세포는 따로 well과 insert를 이용하여 단층배양하였으며, 배지의 양은 동시배양과 동일하게 사용하였다. 3-MC 처리 후 각각의 세포를 단층 배양한 것과 동시 배양한 경우의 세포의 증식 능(cell prolif&ation)과 CYP 1A1/2 활성을 측정하였다.9) 세포의 증식 능은 MTS((3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl-2H-tetrazolium, inner salt)와 electron coupling reagent인 phenazine methosulfate(PMS)를 사용하여 형성된 formazan의 흡광도를 Elisa readei를 이용하여 492 nm의 파장에서 측정하는 MTS assay를 통해 측정하였다.
- 3-MC 처리 후 각각의 세포를 단층 배양한 것과 동시 배양한 경우의 세포의 증식 능(cell prolif&ation)과 CYP 1A1/2 활성을 측정하였다.9) 세포의 증식 능은 MTS((3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl-2H-tetrazolium, inner salt)와 electron coupling reagent인 phenazine methosulfate(PMS)를 사용하여 형성된 formazan의 흡광도를 Elisa readei를 이용하여 492 nm의 파장에서 측정하는 MTS assay를 통해 측정하였다.2)
- 5 μM을 첨가하여 배양하였다. CYP 1A.1/2의 활성은 ethoxyresorufin O-deethylase(EROD) 에 의해 생성되는 레조르핀의 농도로 측정하였다.9)
- Caco 2세포를 3-MC로 처리하여 CYP 1A1/2의 활성을 증가시켰다. 아세트아미노펜의 독성이 주로 간에서의 CYP 2E1 에 의한 대사에 의해 나타나는 것으로 알려져 있으나, 소화관 흡수과정에서 생성되는 대사체에 의한 독성을 알아보고자 Caco 2세포에서 CYP 1A1/2에 의한 아세트아미노펜의 독성 여부를 측정하였다.
- Caco 2세포에서 3-MC에 의해 CYP 1A1/2의 활성이 증가된 후 Caco 2세포의 apical side 쪽에 3-MC와 아세트아미노펜(1-20 μM)을 함유하는 새로운 배지를 가하고, basal side 쪽에는 3-MC을 함유하는 새로운 배지를 가하여 아세트아미노펜에 의한 독성을 Caco 2세포에서 살펴보고자 하였다. 따로 3-MC를 처리하지 않은 아세트아미노펜 투여군에서도 Caco 2세포에서의 독성을 평가하여 CYP 1A1/2 유도후 나타난 아세트아미노펜의 독성과 비교하였다.
- 5 mg 배지를 넣어 동시배양 (coculture)하였다. μCCA-μGI에서의 아세트아미노펜의 독성을 평가하기 위해 Caco 2세포와 HEpG2/C3A세포, L2 세포를 가지고 각 세포의 증식 능과 효소 활성을 실험하였다. 이때 랫트를 모델로 각 장기의 유지 시간을 정하였으므로 랫트의 세포를 이용하여야 하나, Caco 2세포와 HEpG2/C3A가가장 사람과 유사한 흡수 능과 효소 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있어 사람과 랫트의 세포를 가지고 실험하였다.
- μCCA의 패턴은 CAD(Cadence; Fishkill, NY USA)에서 작성하였으며, 데이터화일로 전환시킨 후에 pattern generators 크롬이 코팅된 유리 마스크에 노출시켜 μCCA패턴을 제작하였다. 디바이스 제작 시 두 개의 층이 필요하므로 100 nm, 40 μm을 위한 각각의 마스크를 제작하였다.
- μGI tract 디바이스에서의 위쪽 부분은 소화관 통과시간인 88분의 유지시간을 갖도록 하였으며, 아래쪽 부분은 유지 시간 69초를 갖도록 하였다. 이때 위쪽과 아래쪽 chamber의 높이를 같게 함으로서 양쪽 chamber의 압력차를 유사하게 하였다.
- 세포의 독성은 MTS assay로 측정하였다. 단백질 정량은 소 혈청알부민을 표준물질로 하여 바이오레드 단백질 정량시약(Bio-rad, Munich, Germany)을 사용하여 측정하였다.
- 따로 3-MC를 처리하지 않은 아세트아미노펜 투여군에서도 Caco 2세포에서의 독성을 평가하여 CYP 1A1/2 유도후 나타난 아세트아미노펜의 독성과 비교하였다. 세포의 독성은 MTS assay로 측정하였다.
- 랫트의 간은 19.6 mL, 폐는 2.1 mL 및 소화관은 11.3 mL 이므로 각 장기에서의 혈류속도로 각 장기의 부피를 나누어 유지 시간을 구하였다.10) 이렇게 얻어진 결과를 이용하여 폐 2초, 간 85초, 소화관 69초, 다른 기관 223초의 유지 시간을 갖도록 디바이스를 디자인하였다.
- 현상한 이후에 웨이퍼는 lOOμm의 두께를 얻도록 unix 770으로 식각하였으며, 이것은 약 60분이 소요되었다. 마지막으로 남아 있는 photoresist 를 60℃ heated resist bath에서 제거하였으며 4개의 디바이스로 만들어진 μCCA 디바이스는 웨이퍼용 전자칼을 이용하여 4개의 디바이스로 나누었다.
- 아래쪽 chamber 에 폴리카보네이트 멤브레인(3 Rm pore, 직경 12 mm)과 테프론 가스킷을 위한 계단형 원형 chamber# 갖도록 하였다. 마지막으로 배지의 입구와 출구를 위한 구멍을 만들었으며, 3개의 나사못을 이용하여 chamber가 서로 밀착되도록 하였다.
- 실리콘 웨이퍼(Silicone Quest; Santa clara, CA)는 실리콘 표면의 수분을 없애기 위하여 P20 primer (Shipley; Marlborough, MA)를 코팅하였으며, 4000rpm에서 Shipley 1813 photoresist(Shipley)을 1.5 μm두께로 회전 코팅하였다. Pattern 은 contact aligner(AB-M HTG 3HR Contact proximity aligner, San Jose, CA, US A)를 이용하여 웨이퍼에 자외선 (405 nm wavelength)를 2.
- 아세트아미노펜의 독성이 주로 간에서의 CYP 2E1 에 의한 대사에 의해 나타나는 것으로 알려져 있으나, 소화관 흡수과정에서 생성되는 대사체에 의한 독성을 알아보고자 Caco 2세포에서 CYP 1A1/2에 의한 아세트아미노펜의 독성 여부를 측정하였다. 아세트아미노펜을 Caco 2세포에 가한 뒤 24시간 후에 세포독성을 측정하였다. 3-MC 처리 군과 미처리군 모두 20mM 아세트아미노펜으로 24시간 처리한 후에도 IC50에는 도달하지 않았으며, 두 군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다(Figure 3).
- 아세트아미노펜의 독성이 주로 간에서의 CYP 2E1 에 의한 대사에 의해 나타나는 것으로 알려져 있으나, 소화관 흡수과정에서 생성되는 대사체에 의한 독성을 알아보고자 Caco 2세포에서 CYP 1A1/2에 의한 아세트아미노펜의 독성 여부를 측정하였다. 아세트아미노펜을 Caco 2세포에 가한 뒤 24시간 후에 세포독성을 측정하였다.
- 4 cm2)은 실리콘 μCCA 디바이스의 표면을 덮기 위해 제작되었다. 윗부분은 plexiglas sheet (thickness: 3.2 mm)를 가지고 입구와 출구를 위한 구멍을 만들었으며, 아랫부분은 6.4 mm두께의 plexiglas를 가지고 2 mm두께의 실리콘 칩이 들어가도록 2.56x2.56cm 정사각형 공간을 만들었다. 정사각형 공간에 제작된 웨이퍼를 놓고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 위부분의 plexiglas를 덮고 나사못을 사용하여 양쪽의 덮개를 서로 밀착시켰다.
- μCCA-μGI에서의 아세트아미노펜의 독성을 평가하기 위해 Caco 2세포와 HEpG2/C3A세포, L2 세포를 가지고 각 세포의 증식 능과 효소 활성을 실험하였다. 이때 랫트를 모델로 각 장기의 유지 시간을 정하였으므로 랫트의 세포를 이용하여야 하나, Caco 2세포와 HEpG2/C3A가가장 사람과 유사한 흡수 능과 효소 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있어 사람과 랫트의 세포를 가지고 실험하였다.19) HEp G2/C3A세포와 L2 세포는 따로 well과 insert를 이용하여 단층배양하였으며, 배지의 양은 동시배양과 동일하게 사용하였다.
- 10) 이렇게 얻어진 결과를 이용하여 폐 2초, 간 85초, 소화관 69초, 다른 기관 223초의 유지 시간을 갖도록 디바이스를 디자인하였다. 이때 소화관과 간을 연결시킴으로서 각 장기간의 상호작용을 보고자 하였으므로 소화관에서의 혈류속도(7.5 mL/min)를 이용하지 않고 간문맥의 혈류속도(9.8 mL/min)를 이용하여 소화관의 유지시간을 계산하였다. 두 개의 펌프 중 peristaltic pump를 이용하여 폐와 간으로 이루어진 μCCA 디바이스로 배지가 흐르게 하였으며, syringe pump는 폐와 간의 유속과 다른 μGI tract을 위하여 장치하였다.
대상 데이터
- Caco 2세 포(human colon adenocarcinoma epithelial cells), L2세포(rat lung Type II epithelial cells) 및 Hep G2/C3A세포(human hepatocalcinoma epithelial cells)를 ATCC(American Tissue Culture Collection)에서 분양받았다. Caco 2 세포는 10% FBS와 lOmM의 MEM non-essential amino acid가 첨가된 Dulbecco's modified minimum essential medium(DMEM)에서 배양하였으며, L2 세포 및 HEp G2/C3A세포는 DMEM/F12(1:1)에 파이루베이트가 첨가된 세포배양 배지에서 배양하였다.
- Caco 2 세포는 10% FBS와 lOmM의 MEM non-essential amino acid가 첨가된 Dulbecco's modified minimum essential medium(DMEM)에서 배양하였으며, L2 세포 및 HEp G2/C3A세포는 DMEM/F12(1:1)에 파이루베이트가 첨가된 세포배양 배지에서 배양하였다. DMEM/F12을 포함한 모든 배지, 소혈청알부민(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신, 파이루베 이트와 생 리식 염 인산염 완충액은 Life Technoloigies사 (Rockbille, MD, USA)에서, 폴리 라이신 (Poly-D-lysine), 아세트아미노펜, 레조르핀, 에톡시레조르핀은 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- Plexglas housing(3.8x5.4 cm2)은 실리콘 μCCA 디바이스의 표면을 덮기 위해 제작되었다. 윗부분은 plexiglas sheet (thickness: 3.
- and |1GI tract. The microfabricated device comprises two depths 40 jim (depicted in grey) for the lung and liver chamber and 100 |im (depicted in black line) for the other tissues. The dimension of the chamber are as follows (wxL): Lung (2x2 mm), Liver (3.
- 큰 압력 차는 양쪽 chambet에서 소화관쪽과 혈관 쪽에서 독립적으로 배지의 흐름이 일어나지 않게 하면서 압력 차가 큰 chamber로만 흐르도록 하는 원인이 되기 때문이다. ptGI tract 디바이스는 polymethylmethacrylate(PMMA) 폴리머를 가지고 computer numerically controlIed(CNC) machine (Bridgeport Series ILBridgeport, CT, USA; equipped with a dynapath controller:Indianapolis, IN, US A) 에 의해 제작되었다. CNC machinee 소화관에서의 유지 시간을 위해 디자인된 디바이스에 정확한 수치를 부여하고 부드러운 표면을 갖도록 만들 수 있다는 장점을 가지고 있다.
- μCCA의 패턴은 CAD(Cadence; Fishkill, NY USA)에서 작성하였으며, 데이터화일로 전환시킨 후에 pattern generators 크롬이 코팅된 유리 마스크에 노출시켜 μCCA패턴을 제작하였다. 디바이스 제작 시 두 개의 층이 필요하므로 100 nm, 40 μm을 위한 각각의 마스크를 제작하였다.
- 2번 회전 코팅시켰다. 이때 얇은 층을 형성하는 shipley 1827를 사용 시 오랜 시간의 식각을 견디지 못하고 자외선에 노출되지 않은 부분도 식각이 되어 두꺼운 필름을 형성하는 shipley 1075를 사용하였다. 일반적으로 Shipley 1075는 20μm 정도의 두께를 형성하므로 더욱 긴 시간의 자외선 노출이 필요하였다.
이론/모형
- 따로 3-MC를 처리하지 않은 아세트아미노펜 투여군에서도 Caco 2세포에서의 독성을 평가하여 CYP 1A1/2 유도후 나타난 아세트아미노펜의 독성과 비교하였다. 세포의 독성은 MTS assay로 측정하였다. 단백질 정량은 소 혈청알부민을 표준물질로 하여 바이오레드 단백질 정량시약(Bio-rad, Munich, Germany)을 사용하여 측정하였다.
- 실리콘 디바이스는 Cornell Nano fabrication Facility(CNF) 에서 standard lithography-etching technique을 이용하여 제조하였다. μCCA의 패턴은 CAD(Cadence; Fishkill, NY USA)에서 작성하였으며, 데이터화일로 전환시킨 후에 pattern generators 크롬이 코팅된 유리 마스크에 노출시켜 μCCA패턴을 제작하였다.
성능/효과
- 9926)이 나타났다. 3-MC를 함유하지 않는 Caco 2세포의 CYP 효소는 거의 발현되지 않았으나, 3-MC에 의한 CYP 1A1/2의 유도이후 Caco 2세포의 농도가 1x105개일 때 CYP 효소의 활성은 약 5배 정도 증가하였으며, 이는 보고된 생리적인 CYP 1A1/2의 농도와 유사한 것을 알 수 있었다.⑹
후속연구
- μCCA-μGl 의 연결은 향후 장관에서의 약물의 흡수과정을 거쳐 간에서 대사되는 약물의 독성을 평가할 때 단층배양에 비해 신약후보물질의 독성을 평가하는데 보다 더욱 적절한 정보를 얻을 수 있을 것이다.
- 향후 μCCA와 gGI tract을 연결함으로서 간과 소화관의 상호작용이 폐에 미치는 영향, 소화관과 폐의 상호작용이 간에 미치는 영향을 알아볼 수 있을 것으로 기대된다.
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