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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라 식품의약품안정청에 식품 원료로 사용 가능한 식물로 분류되어 있는 식물을 포함, 주변에서 흔히 자생하는 야생 잡초류의 식물에서 항산화 효과 및 어류질병 미생물에 대한 항균효과를 유기용매 추출 시제기되는 잔류독성 문제를(8) 피하기 위해 유기용매 추출액이 아닌 열수추출액으로 그 특성을 조사하였다.
제안 방법
- 8% TCA (trichloroacetic acid)용액 1ml를 가하여 반응을 중지 시켰다. 그 후, 1.0% TBA (thiobarbituric acid)용액 1 ml를 가하여 100°C 에서 10 분간 가열시킨 후 급속히 냉각시켜 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 시료에 대한 기준시료는 DPPH액을 가지고 측정하였다. OH 소거활성은 HSA (hydroxyl radical scavenging ability)로 표기하였으며 다음과 같은 식으로 계산하였다.
- 항균 실험은 어류 질병미생물로 분류된 그람 음성균 12종과 그람 양성균 1종에 대하여 디스크 확산법으로 측정하였는데 그 결과 두메꿀풀 꽃 추출물에서 가장 강한 항균효과를 나타내었고 다음으로 풀고사리 잎과 돌잔고사리 잎, 들깨 잎, 들깨 열매 순으로 나타났으며 큰천남성 뿌리나 왕모시풀 잎, 열매에서는 눈에 띄는 항균 효과를 나타내지는 않았다. 그리고 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH radical 소거능과 SOD 유사활성, Hydroxyl radical 소거 활성을 실험하였다. 각 식물의 열수 추출물을 농도별로 희석하여 측정한 결과 농도가 높아질수록 항산화 효과가 증가하는 것을 확인 할 수가 있었으며 2.
- 농도별로 희석된 추출액의 hydroxyl radical (OH - ) 소거 활성 능을 조사하기 위해 2-deoxyribose oxidation method 방법(15)을 변형하여 측정하였다.
- 0 X 10'4 M DPPH (l, l-diphenyl-2- picryhydrazyl)용액 2 ml와 자생식물 열수 추출액을 농도별루 희석한 액을 1 ml 씩 혼합한 후, spectrophotometer (Hanson OPRON-3000, Korea)로 518 nm에서 흡광도를 측정하였다 (12). 대조구로는 합성 항산화제인 BHA(butylated hydroxytoluene)를 0.05% (w/v)의 농도로 제조한 후 제조된 DPPH 용액 2 ml와 대조구액 1 ml를 혼합한 것과 자생식물 열수 추출액을 시험구와 같은 농도로 희석액을 제조한 후 제조된 DPPH 용액 2 ml와 대조구액 1 ml씩을 혼합한 후 30분간 상온에서 반응시킨 후 흡광도를 측정 하였다.
- 본 실험에서는 생체내의 항산화 방어기구 중 효소적 방어체계의 하나로서 superoxide radical을 환원시켜서 산 소독으로부터 생체를 보호하는 superoxide radical 소거활성을 pyrogallol 자동산화로 생성되는 superoxide anion radical 소거 여부로 확인하였다. 기존 합성 항산화제인 BHT (butylated hydroxy toluene) 와 BHA (butylated hydroxyanisole) 를 대조구로 사용하여 자생식물 열수 추출물의 농도별 superoxide anion radical 소거 활성을 측정한 결과는 Fig.
- 효과를 검색하였다. 실험 대상 식물은 생체 채집하여 음건 한 후 열수 추출하여 시료화하여 어류 질병미생물에 대한 항균실험과 각 식물의 열수 추출물의 항산화 효과를 측정 하였다. 항균 실험은 어류 질병미생물로 분류된 그람 음성균 12종과 그람 양성균 1종에 대하여 디스크 확산법으로 측정하였는데 그 결과 두메꿀풀 꽃 추출물에서 가장 강한 항균효과를 나타내었고 다음으로 풀고사리 잎과 돌잔고사리 잎, 들깨 잎, 들깨 열매 순으로 나타났으며 큰천남성 뿌리나 왕모시풀 잎, 열매에서는 눈에 띄는 항균 효과를 나타내지는 않았다.
- 어류 질병 미생물에 대한 자생식물 열수 추출액의 항균 활성 측정은 Murry 등의 방법(11)을 응용하여 측정하였다. 전 배양되어진 공시균을 Muller Hinton broth (Difco, USA) 에 12시간 정도 배양하여 배양액의 탁도를 MacFarland turbidity No.
- Singlet oxygen은 분자산소와는 달이 외각의 전자 2개의 spin방향이 서로 반대로 되어 있어 불안정하다. 이상에서 열거한 여러 형태의 산소를 가리켜 흔히 reactive oxygen species (ROS, 활성 산소)라 부르는데 그 중에서도 hydroxyl radical과 singlet oxygen이 수용액 중에서 가장 강한 반응성을 나타내어 지질산화를 개시하고 DNA에 손상을 주거나 돌연변이를 유발하는 물질로 알려져 있고, 생체의 대사과정에서 생성되는 지질의 과산화물이나 과산화수소 (田。2)가 F:+나 + 이온의 존재 하에서 생산되며 가장 독성이 강한 free radical이므로 이 라디칼을 소거하는 정도를 측정하였다(15, 19). 합성항산화제인 BHT (butylated hydroxytoluene) 와 BHA (butylated hydroxy anisole) > 대조 구로 사용하여 자생식물 열수 추출물의 농도별 hydroxyl radical scavenging activity (HSA) 측정한 결과는 Fig.
- 전자공여능은 4.0 X 10'4 M DPPH (l, l-diphenyl-2- picryhydrazyl)용액 2 ml와 자생식물 열수 추출액을 농도별루 희석한 액을 1 ml 씩 혼합한 후, spectrophotometer (Hanson OPRON-3000, Korea)로 518 nm에서 흡광도를 측정하였다 (12). 대조구로는 합성 항산화제인 BHA(butylated hydroxytoluene)를 0.
- 제주도 서부지역과 동부지역의 목초지 및 농지 주변 길가에서 흔히 자라는 식물을 위주로 7종을 채취하여 부위별로 열수 추출한 추출액을 가지고 어류 병원성 미생물인 그람 양성균 1종과 그람 음성균 12종(Table 2)에 대하여 항균 활성을 측정 하였다(Table 3).
- 증류수 400 ml 당 40 g의 식물시료를 혼합하여 100°C 수욕상에서 약 30분간 중탕한 다음 Whatman No.2 여과지를 사용하여 1차 여과과정을 거친 후 pore size 0.45 例 syringe용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 식물 열수 추출액을 조제 하였다. 조제된 시료는 4°C 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 채집된 자생식물 열수추출물의 항산화능을 DHHP에 대한 전자공여능 (electron donating ability, EDA (%))으로 측정 하였다. 일반적으로 특정 물질에 대한 항산화 활성을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으나 그 중에서도 DPPH radical 소거 활성법은 비교적 간단하면서 여러 개의 샘플을 동시에 측정 할 수 있는 방법으로 흔히 이용되고 있다.
- 항균측정용 시료액은 8 mm paper disc (ADVANTEC, Japan)에 50 卩1를 흡수 건조시켜 배지위에 부착시켜서 각 공시균의 최적온도에서 24시간 배양 후 생성된 억제환 (직경 mm)을 측정하여 항균 효과를 확인하였다. 항균 실험은 3회 실험하였다.
- 5가 되도록 조절한 후 멸균된 면봉을 사용하여 Muller Hinton agar (Difco, USA)에 회전하면서 배지 전면에 균액을 골고루 도말하였다. 항균측정용 시료액은 8 mm paper disc (ADVANTEC, Japan)에 50 卩1를 흡수 건조시켜 배지위에 부착시켜서 각 공시균의 최적온도에서 24시간 배양 후 생성된 억제환 (직경 mm)을 측정하여 항균 효과를 확인하였다. 항균 실험은 3회 실험하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 균주는 어류 질병 미생물로서 한국 유전자은행인 KCTC (Korean Collection For Type Culture) 에서그람음성균 12종과 그람양성균 1종을 분양받아(Table 2) 실험에 사용하였다. 균 생육배지로는 Table 2에 명시되어 있는 배지를 사용하여 전배양하였다.
- 본 실험에서 사용된 시료는 자생식물 열수 추출액을 농도별로 희석하여 실험하였다. 50 mM phosphate buffer 2.
- 본 실험의 공시 재료로 사용된 식물은 Table 1과 같이 제주도 서부지역과 동부지역의 목초지 및 농지 주변 길가에서 흔히 자라는 식물을 위주로 2005년 8월부터 11월에 채집 하였으며, 식물분류는 한국식물도감(9)과 한국의 자원식물 I (10) 그리고 제주식물도감 인터넷 사이트(http://www.nfc.co.kr) 를 참고하였다.
- 제주도 자생식물의 열수 추출물 10종의 항균 효과 및 항산화 효과를 검색하였다. 실험 대상 식물은 생체 채집하여 음건 한 후 열수 추출하여 시료화하여 어류 질병미생물에 대한 항균실험과 각 식물의 열수 추출물의 항산화 효과를 측정 하였다.
이론/모형
- Superoxide dismutase 유사활성능은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Eugene(13)와 Marklud(14)의 방법에 따라 측정하였다.
- Radical scavenging activity of the hot water extracts obtained Indigenous plants. The antioxidative activity was tested by DPPH method (BHA: Butylated hydroxyanisole, BHT: Butylated hydroxy toluene).
성능/효과
- 그림에서도 나타내었듯이 기존 합성항산화제의 SOD 소거활성능은 각각 45% (BHA), 35% (BHT) 로나타났다. 2.0% 농도의 자생식물 열수추출물에서는 큰천남성 (, 4rkaema ringens (Thunb.) Schott; 뿌리, 13%)에서 가장 낮은 활성을 보였으며 다음으로 왕모시풀 (Boehmeriq pannosa Nakai et Satake: 잎 (25%), 열매 (24%)), 마디풀 (Polygonum aviculare 잎 + 줄기, 31%), 풀고사리 (Gleichenia japonica Spreng-. 잎, 34%), 들깨 (Perilla frutescens var. japonica Hara.
- 2.0% 농도의 자생식물 열수추출물에서는 큰천남성 (Arisaema ringens (Thunb.) Schott: 뿌리, 32%)에서 가장 낮은 소거활성을 보였으며 다음으로 마디풀 (Polygonum aviculare L.;. 잎 + 줄기, 37%), 왕모시풀 (Boehmeria pannosa Nakai et Satake-. 잎 (40%), 열매 (37%)), 들깨 (Perilla frutescens var.
- 그리고 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH radical 소거능과 SOD 유사활성, Hydroxyl radical 소거 활성을 실험하였다. 각 식물의 열수 추출물을 농도별로 희석하여 측정한 결과 농도가 높아질수록 항산화 효과가 증가하는 것을 확인 할 수가 있었으며 2.0% (20 mg/ml)농도에서 두메꿀풀 잎과 열매 그리고 들깨 잎과 열매, 돌잔고사리 잎은 합성 항산화제인 BHT, BHA와 높거나 유사한 항산화 효과를 나타내었다.
- 실험에 이용된 13종의 균에 대하여 가장 좋은 항균 활성을 나타내고 있는 식물은 두메꿀풀로서 꽃과 잎 추출물에서 가장 강한 활성을 나타냈다. 다음으로 풀고사리 잎과 돌잔고사리 잎, 들깨 잎, 열매 순으로 나타났다.
- 전자 공여능 (Electron donating ability, EDA (%))은 자생식물 열수 추출액과 control의 흡광도 감소율로 나타내었다.
- 꽃 (44%), 잎 (43%)) 순으로 나타났다. 특히 두메꿀풀의 꽃과 잎 추출물을 BHT, BHA와 활성을 비교하였을 때 BHT보다는 훨씬 높은 소거활성을 나타냈고 BHA와는 거의 유사한 활성을 나타냈다.
- 실험 대상 식물은 생체 채집하여 음건 한 후 열수 추출하여 시료화하여 어류 질병미생물에 대한 항균실험과 각 식물의 열수 추출물의 항산화 효과를 측정 하였다. 항균 실험은 어류 질병미생물로 분류된 그람 음성균 12종과 그람 양성균 1종에 대하여 디스크 확산법으로 측정하였는데 그 결과 두메꿀풀 꽃 추출물에서 가장 강한 항균효과를 나타내었고 다음으로 풀고사리 잎과 돌잔고사리 잎, 들깨 잎, 들깨 열매 순으로 나타났으며 큰천남성 뿌리나 왕모시풀 잎, 열매에서는 눈에 띄는 항균 효과를 나타내지는 않았다. 그리고 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH radical 소거능과 SOD 유사활성, Hydroxyl radical 소거 활성을 실험하였다.
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