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문제 정의
- 본 연구에서는 전처리 과정이 간단하면서도 정량적신뢰성을 확보한 소변 중 MA, 4HMA, AP 및 4HA에대한 LC-MS/MS 분석법을 개발하였고 그 유효성을확인하였다. 추가적인 정제과정 없이 50000 g에서3 min 동안 초고속원심분리를 진행하여 기질의 방해물질에 의한 background noise를 효과적으로 제거할수 있었다.
- 연구에서는 초고속원심분리법와 시료 희석 주입법을 이용하여 MA, 4HMA, AP 및 4HA를 LC-MS/MS로 동시 분석하여 신속ㆍ정확한 결과를 얻고자 하였다. 시료 전처리 방법의 효율성 확인을 위해 본 연구에 적용된 초고속원심분리법과 일반적으로 사용되는 시린지 여과(filtration) 방법을 적용하여 기질의 영향이 얼마나 제거되었는가를 비교하였다.
가설 설정
- 액체크로마토그래프에 연결된 질량분석기는 전자분무이온화 (Electrospray ionization, ESI) 장치가 장착된Sciex QTrap 6500 triple-quadrupole mass spectrometer(AB SCIEX, Foster city, CA, USA)를 사용하였다. 전자분무이온화 장치는 양이온 방식으로, nebulizing gas55, curtain gas 60, turbo ion spray heater gas 80으로설정하였다. Turbo-gas의 온도는 600 ℃, 이온화 전압은 5000 V로 설정하였다.
제안 방법
- 효율성(%)은 Matuszewski 등에 따라 A와 B 세트모두 여섯 개의 등분체로 시료를 제조한 후 분석하였다.28 세트 A는 이동상에 분석물질과 내부표준물질을첨가하여 제조하였고, 세트 B는 바탕시료에 분석물질과 내부표준물질을 첨가하여 제조하였다. 2세트의 등분체를 분석하여 얻은 피크 면적의 비를 구하여 효율성(PE=B/A×100)을 평가하였다.
- 2세트의 등분체를 분석하여 얻은 피크 면적의 비를 구하여 효율성(PE=B/A×100)을 평가하였다.
- MS/MS 변수는 분석물질이 최대 감도를 나타낼 수있도록 최적화하였다. 분석물질의 머무름 시간을 특정하고 특징적인 MRM 이온쌍(MRM ion pair)을 선정하여 분석에 사용하였다.
- 검량선 작성을 위해 바탕시료에 AP는 1, 5,10, 25, 50, 100, 500, 800 ng/mL가 되도록 제조하였고, 4HA와 4HMA는 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200,500 ng/mL의 농도로 제조하였으며, MA는 10, 25,50, 125, 250, 500, 1000, 2500 ng/mL로 제조하였다. QC시료 제조를 위해 바탕시료에 AP는 3, 30, 300 ng/mL,4HA와 4HMA는 6, 30, 300 ng/mL, MA는 30, 150,1500 ng/mL가 되도록 제조하였다.
- 바탕시료는 약물을 복용하지 않은 사람의 소변을사용하였으며, 검량선 작성 및 QC 시료 제조 시 사용하였다. 검량선 작성을 위해 바탕시료에 AP는 1, 5,10, 25, 50, 100, 500, 800 ng/mL가 되도록 제조하였고, 4HA와 4HMA는 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200,500 ng/mL의 농도로 제조하였으며, MA는 10, 25,50, 125, 250, 500, 1000, 2500 ng/mL로 제조하였다. QC시료 제조를 위해 바탕시료에 AP는 3, 30, 300 ng/mL,4HA와 4HMA는 6, 30, 300 ng/mL, MA는 30, 150,1500 ng/mL가 되도록 제조하였다.
- 동일한 분석물질에 대한 재현성 (repeatability) 확인을 위해 일내 (intra-day), 일간 (inter-day) 정밀도 및정확도를 측정하였다. 균질화된 시료로부터 취한 여러개의 등분체(aliquots)로 반복 분석하였을 때 측정값의근접성을 의미하는 정밀도와 실제값과 측정값 사이의차이를 나타내는 분석법의 정확도는 3가지 농도(저,중, 고)의 QC 시료를 제조하여 각 농도별 6회 반복측정하였다. 이때 측정된 평균값의 정확도는 실측값의15 % (bias) 이내로 하였고, 정밀도는 변동계수가 15 %를 넘지 않도록 하였다.
- 기질효과 측정을 위하여 Harvard Syringe Pump(Harvard Apparatus)를 사용하여 5 ng/min으로 분석물질 및 내부표준물질을 분리관 후단에 주입하는 postcolumn infusion 방법을 적용하였고, 전처리 과정을 거친 바탕시료를 LC-MS/MS에 주입하여 확인하였다.
- 액체크로마토그래프의 자동시료주입기 안정성(autosampler stability)은 시료가 든 바이알(vial)을 15 ℃에서 12시간동안보관한 후 다시 주입하여 분석한 결과를 비교하여 평가하였다. 농도별 QC 시료들을 각각 5 개씩 분석하여처음 분석하였던 농도별 QC 시료들과 비교분석하여계산하였다. 소변 내 분석물질의 안정성은 정확도는85-115 % 이내, 정밀도는 15 %를 넘지 않는 경우 안정성이 있는 것으로 판단하였다.
- 소변 내 분석물질의 안정성 측정을 위해 AP는 3,30, 300 ng/mL, 4HA와 4HMA는 6, 30, 300 ng/mL,MA는 30, 150, 1500 ng/mL의 농도로 QC 시료(n=5)를 제조한 뒤 반복 측정하였다. 단기 안정성(shortterm stability)은 시료를 전처리하고 분석하는 조건에해당하는 12시간과 24시간 동안 상온에 노출되는 경우를 평가하였고, 장기 안정성(long-term stability)은시료 보관 조건에 해당하는 10일에서 20일 동안에 4 ℃냉장보관 뒤 시료를 상호 비교하였다. 액체크로마토그래프의 자동시료주입기 안정성(autosampler stability)은 시료가 든 바이알(vial)을 15 ℃에서 12시간동안보관한 후 다시 주입하여 분석한 결과를 비교하여 평가하였다.
- 동일한 분석물질에 대한 재현성 (repeatability) 확인을 위해 일내 (intra-day), 일간 (inter-day) 정밀도 및정확도를 측정하였다. 균질화된 시료로부터 취한 여러개의 등분체(aliquots)로 반복 분석하였을 때 측정값의근접성을 의미하는 정밀도와 실제값과 측정값 사이의차이를 나타내는 분석법의 정확도는 3가지 농도(저,중, 고)의 QC 시료를 제조하여 각 농도별 6회 반복측정하였다.
- 시료 전처리 방법의 효율성 확인을 위해 본 연구에 적용된 초고속원심분리법과 일반적으로 사용되는 시린지 여과(filtration) 방법을 적용하여 기질의 영향이 얼마나 제거되었는가를 비교하였다. 또한 개발된LC-MS/MS 분석법의 유효성을 평가하였고, 실제 복용자 12명의 소변 시료를 분석하여 그 활용 가능성을확인하였다.
- 바탕시료는 약물을 복용하지 않은 사람의 소변을사용하였으며, 검량선 작성 및 QC 시료 제조 시 사용하였다. 검량선 작성을 위해 바탕시료에 AP는 1, 5,10, 25, 50, 100, 500, 800 ng/mL가 되도록 제조하였고, 4HA와 4HMA는 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200,500 ng/mL의 농도로 제조하였으며, MA는 10, 25,50, 125, 250, 500, 1000, 2500 ng/mL로 제조하였다.
- 본 연구에서는 LC-MS/MS 분석 시 시료 전처리 과정을 단순화하고 시간을 단축할 수 있는 방법으로 시료 희석 주입법을 도입하였다. 이러한 시료 희석 주입법은 시료 중 분석물질의 손실 방지에 유용하다.
- 초고속원심분리법의 효율성 평가를 위해 AP, 4HA,4HMA의 농도가 30 ng/mL, MA의 농도가 150 ng/mL가 되도록 QC 시료를 5 개의 등분체로 제조하여 분석하였다. 본 연구의 전처리 방법에 의한 분석물질의 크로마토그램 피크 면적과 LC-MS/MS 분석에 일반적으로 사용되는 시린지 필터 후 시료 희석 주입법을 적용한 분석물질의 크로마토그램 피크 면적을 비교하여상대적인 효율성(%)을 평가하였다. 본 연구의 전처리방법을 적용하였을 때 효율성은 AP는 9 %, 4HA와4HMA는 6 %, MA는 15 % 향상되었다(Fig.
- MS/MS 변수는 분석물질이 최대 감도를 나타낼 수있도록 최적화하였다. 분석물질의 머무름 시간을 특정하고 특징적인 MRM 이온쌍(MRM ion pair)을 선정하여 분석에 사용하였다. MA, 4HMA, AP 및 4HA에대한 대표적인 LC-MS/MS 크로마토그램은 Fig.
- 분석법의 유효성은 선택성, 검출한계(limit ofdetection, LOD), 최저정량한계(lower limit of quantification, LLOQ), 직선성(linearity), 정확도(accuracy) 및정밀도(precision), 희석무결성(dilution integrity), 기질효과(matrix effect), 효율성(process efficiency, PE), 안정성(stability)의 항목을 평가하였다.26-27
- 선택성은 서로 다른 소변시료를 분석하여 분석물질및 내부표준물질의 머무름 시간(retention time)에서 방해물질에 의한 영향이 있는지 여부를 크로마토그램상의 피크를 확인하여 비교 평가하였다.
- 소변 내 분석물질의 안정성 측정을 위해 AP는 3,30, 300 ng/mL, 4HA와 4HMA는 6, 30, 300 ng/mL,MA는 30, 150, 1500 ng/mL의 농도로 QC 시료(n=5)를 제조한 뒤 반복 측정하였다. 단기 안정성(shortterm stability)은 시료를 전처리하고 분석하는 조건에해당하는 12시간과 24시간 동안 상온에 노출되는 경우를 평가하였고, 장기 안정성(long-term stability)은시료 보관 조건에 해당하는 10일에서 20일 동안에 4 ℃냉장보관 뒤 시료를 상호 비교하였다.
- 연구에서는 초고속원심분리법와 시료 희석 주입법을 이용하여 MA, 4HMA, AP 및 4HA를 LC-MS/MS로 동시 분석하여 신속ㆍ정확한 결과를 얻고자 하였다. 시료 전처리 방법의 효율성 확인을 위해 본 연구에 적용된 초고속원심분리법과 일반적으로 사용되는 시린지 여과(filtration) 방법을 적용하여 기질의 영향이 얼마나 제거되었는가를 비교하였다. 또한 개발된LC-MS/MS 분석법의 유효성을 평가하였고, 실제 복용자 12명의 소변 시료를 분석하여 그 활용 가능성을확인하였다.
- 시료 희석 주입 LC-MS/MS 분석법의 유효성 확인을 위해 선택성, LOD 및 LLOQ, 직선성, 정확도 및정밀도, 희석무결성, 기질효과, 효율성, 안정성을 확인하였다. 선택성 확인을 위해 약물을 복용하지 않은 10명의 소변시료를 분석한 결과, MA, HMA, AP 및HAP 분석에 영향을 미치는 방해 성분은 없었다.
- 액체크로마토그래프에 연결된 질량분석기는 전자분무이온화 (Electrospray ionization, ESI) 장치가 장착된Sciex QTrap 6500 triple-quadrupole mass spectrometer(AB SCIEX, Foster city, CA, USA)를 사용하였다. 전자분무이온화 장치는 양이온 방식으로, nebulizing gas55, curtain gas 60, turbo ion spray heater gas 80으로설정하였다.
- 단기 안정성(shortterm stability)은 시료를 전처리하고 분석하는 조건에해당하는 12시간과 24시간 동안 상온에 노출되는 경우를 평가하였고, 장기 안정성(long-term stability)은시료 보관 조건에 해당하는 10일에서 20일 동안에 4 ℃냉장보관 뒤 시료를 상호 비교하였다. 액체크로마토그래프의 자동시료주입기 안정성(autosampler stability)은 시료가 든 바이알(vial)을 15 ℃에서 12시간동안보관한 후 다시 주입하여 분석한 결과를 비교하여 평가하였다. 농도별 QC 시료들을 각각 5 개씩 분석하여처음 분석하였던 농도별 QC 시료들과 비교분석하여계산하였다.
- 초고속원심분리법의 효율성 평가를 위해 AP, 4HA,4HMA의 농도가 30 ng/mL, MA의 농도가 150 ng/mL가 되도록 QC 시료를 5 개의 등분체로 제조하여 분석하였다. 본 연구의 전처리 방법에 의한 분석물질의 크로마토그램 피크 면적과 LC-MS/MS 분석에 일반적으로 사용되는 시린지 필터 후 시료 희석 주입법을 적용한 분석물질의 크로마토그램 피크 면적을 비교하여상대적인 효율성(%)을 평가하였다.
- 피크의 머무름 시간(retention time)과 모양(shape)을 최적화하기 위해 ammonium formate, ammonium acetate,formic acid, acetic acid의 농도를 달리하여 이동상 A용매로 제조하였고, 메탄올과 아세토니트릴을 이동상B 용매로 선정하였다. 이동상 A와 B를 조합하여 사용한 결과 MA, 4HMA, AP 및 4HA 분석에 가장 효과적인 조합은 0.
- 효율성(%)은 Matuszewski 등에 따라 A와 B 세트모두 여섯 개의 등분체로 시료를 제조한 후 분석하였다.28 세트 A는 이동상에 분석물질과 내부표준물질을첨가하여 제조하였고, 세트 B는 바탕시료에 분석물질과 내부표준물질을 첨가하여 제조하였다.
- 희석무결성은 최고정량한계(upper limit of quantification)의 3 배에 해당하는 에 농도로 제조한 소변시료를 준비한 후, 바탕시료를 첨가하여 순차적으로 5, 10,20 농도로 희석하였다. 희석된 시료는 6 개의 등분체로 나누어 제조하였으며 전처리 과정을 거쳐 분석하였다.
- 희석무결성은 최고정량한계(upper limit of quantification)의 3 배에 해당하는 에 농도로 제조한 소변시료를 준비한 후, 바탕시료를 첨가하여 순차적으로 5, 10,20 농도로 희석하였다. 희석된 시료는 6 개의 등분체로 나누어 제조하였으며 전처리 과정을 거쳐 분석하였다.
대상 데이터
- 모두 Cerilliant사 (Austin, TX, USA)에서 구입하였다. 4HA hydrobromide는 USP사 (Rockville, MD, USA)에서 구입하였고, 4HMA는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis,MO, USA)에서 구입하였다. Fig.
- T. Baker/Avantor사(Center Valley, PA, USA)에서 구입하였고, 증류수(LiChrosolv grade)는 Merck (Darmstadt,Germany)에서 구입하였다. 이외의 시약은 ACS 등급에 해당하는 시약을 사용하였고, polypropylene microcentrifuge tube (1.
- 면역화학분석기 Cobas C311 (Roche, Hitachi)와Amphetamine II (Roche, Hitachi) 시약으로 분석한 결과 1차 예비감정결과 양성인 소변 시료 12건을 본 연구를 통해 개발된 분석법의 유용성 확인을 위한 분석시료로 사용하였다. 메스암페타민 복용자의 소변시료분석결과를 LC-MS/MS 크로마토그램으로 Fig.
- 본 연구에 사용한 액체크로마토그래프는 진공탈기장치(vacuum degasser), 이차 펌프(binary pump), 자동시료주입기 및 컬럼오븐으로 구성된 NanospaceNASCA HPLC(Shiseido Co., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 컬럼은 Hypersil Gold C18 column (150 × 2.
- 실제 복용자의 소변 시료는 수도권지역 지방검찰청에서 의뢰한 12명의 소변을 사용하였다. 시료는 20일동안 4 ℃ 조건에서 보관하였고, 재분석이 필요한 소변 시료의 경우 별도로 분류하여 사용 전까지 -20 ℃에서 보관 하였다.
- 1에 분석대상물질의대사 경로 및 화학적 구조를 나타내었다. 이동상에 첨가된 formic acid (LC-MS LiChropur grade)는 SigmaAldrich사에서 구입하였다. 이동상으로 쓰인 HPLC 등급의 메탄올(methanol)과 아세토니트릴(acetonitrile)은J.
- 표준물질 MA와 AP 및 내부표준물질 AP-d8과 MAd11 모두 Cerilliant사 (Austin, TX, USA)에서 구입하였다. 4HA hydrobromide는 USP사 (Rockville, MD, USA)에서 구입하였고, 4HMA는 Sigma-Aldrich사 (St.
이론/모형
- 이러한 시료 희석 주입법은 시료 중 분석물질의 손실 방지에 유용하다. 또한시료 기질에 의한 방해물질의 간섭현상을 효과적으로배제하기 위해 전처리 과정에 초고속원심분리법을 적용하였다.
- Turbo-gas의 온도는 600 ℃, 이온화 전압은 5000 V로 설정하였다. 정량분석을 위해 MRM(multiple reaction monitoring) 방법을 사용하였고, 모이온(precursor ion)의 조각화(fragmentation)를 위한 충돌기체(collision gas)로 질소 가스를 사용하였다.
성능/효과
- 반면 고농도의 MA를 포함하고 있는 소변시료의 경우 4HA를 포함하여 4 종의 분석물질 모두를 확인할 수 있었다. 12번 시료의 측정 결과 AP와AP의 대사체인 4HA의 2 종만이 검출되었고, 이는AP 복용의 증거로 볼 수 있다. 본 연구에서 개발된분석법은 소변 중 4HA, AP, 4HMA, MA 동시 분석에적합하였으며, 정성 및 정량분석 결과를 통해 MA,AP 중 어느 약물을 복용했는가에 대한 구분이 가능할것으로 판단된다.
- 증류수-메탄올의 이동상 조합은 증류수-아세토니트릴 조합보다 기질에 의한 방해물질의 간섭요소를 최소화시키는 것에 효과적인 것으로 나타났다. ammonium formate, ammonium acetate,formic acid 및 acetic acid 등의 첨가물질의 농도를 달리한 결과, 분석물질의 머무름 시간 이동, 피크 사이의 분리능 변화, 검출 강도의 차이를 확인할 수 있었다. 이동상 조합을 총 22가지로 달리하여 확인한 결과,0.
- 검출한계는 동일 농도의 시료 6 개를 분석한 결과값의 시그널(signal, S)과 6 개의 바탕시료로부터 얻은노이즈(noise, N)의 표준편차를 이용하여 S/N 비가 3이상인 농도를 검출한계, 정량한계는 10 이상으로 검량선에서 정밀도(% CV, coefficient of variance)가20 % 미만, 정확도(% bias)는 ±20 % 이내인 가장 낮은 농도로 결정하였다.
- 99 이상으로 정량범위 내에서 직선성을 나타내었다. 검출한계와 최저 정량한계는 0.3-3.0 ng/mL및 1.0-10 ng/mL의 범위로 확인되었다(Table 2)
- 기질효과(matrix-effect) 측정을 위해 post-columninfusion 방법으로 주입된 분석물질의 시그널을 모니터링한 결과, 각각의 분석물질의 머무름 시간에서의MRM 크로마토그램 상 피크의 상승 또는 감소(ionsuppression or enhancement)가 나타나지 않았다. 분석물질에 대한 분석법의 효율성 평가 결과는 4HA는79.
- 전처리 과정에 시료 희석 주입법을 적용함으로써 시료의 손실을 최소화하고 처리 시간을 줄일수 있었다. 본 연구를 통해 개발된 분석법을 실제 복용자 12 명의 소변 시료에 적용했을 때 방해물질의간섭 없이 신속히 MA, 4HMA, AP, 4HA에 대한 정량분석을 수행할 수 있었다.
- 12번 시료의 측정 결과 AP와AP의 대사체인 4HA의 2 종만이 검출되었고, 이는AP 복용의 증거로 볼 수 있다. 본 연구에서 개발된분석법은 소변 중 4HA, AP, 4HMA, MA 동시 분석에적합하였으며, 정성 및 정량분석 결과를 통해 MA,AP 중 어느 약물을 복용했는가에 대한 구분이 가능할것으로 판단된다.
- 본 연구의 전처리 방법에 의한 분석물질의 크로마토그램 피크 면적과 LC-MS/MS 분석에 일반적으로 사용되는 시린지 필터 후 시료 희석 주입법을 적용한 분석물질의 크로마토그램 피크 면적을 비교하여상대적인 효율성(%)을 평가하였다. 본 연구의 전처리방법을 적용하였을 때 효율성은 AP는 9 %, 4HA와4HMA는 6 %, MA는 15 % 향상되었다(Fig. 2). 이러한 결과로부터 시료의 기질에 의한 방해물질의 간섭현상을 최소화하는데 초고속원심분리법이 효과적임을알 수 있었다.
- 기질효과(matrix-effect) 측정을 위해 post-columninfusion 방법으로 주입된 분석물질의 시그널을 모니터링한 결과, 각각의 분석물질의 머무름 시간에서의MRM 크로마토그램 상 피크의 상승 또는 감소(ionsuppression or enhancement)가 나타나지 않았다. 분석물질에 대한 분석법의 효율성 평가 결과는 4HA는79.9-89.7 %, AP는 89.6-100.1 %, 4HMA는 85.1-89.6 %,MA는 82.9-90.8 %로 나타났다(Table 4).
- 시료 희석 주입 LC-MS/MS 분석법의 유효성 확인을 위해 선택성, LOD 및 LLOQ, 직선성, 정확도 및정밀도, 희석무결성, 기질효과, 효율성, 안정성을 확인하였다. 선택성 확인을 위해 약물을 복용하지 않은 10명의 소변시료를 분석한 결과, MA, HMA, AP 및HAP 분석에 영향을 미치는 방해 성분은 없었다.
- 농도별 QC 시료들을 각각 5 개씩 분석하여처음 분석하였던 농도별 QC 시료들과 비교분석하여계산하였다. 소변 내 분석물질의 안정성은 정확도는85-115 % 이내, 정밀도는 15 %를 넘지 않는 경우 안정성이 있는 것으로 판단하였다.
- 소변 내 분석물질의 안정성을 측정한 결과, 단기 안정성은 24시간 동안 상온에서 보관했을 때 변화의 정도는 8.5 % 미만이었으며, 장기 안정성은 20일간 4 ℃조건에서 시료를 보관하였을 때 12.7 % 미만이었다.액체크로마토그래프의 자동시료주입기 안정성은 5%이내로 측정되었다.
- 피크의 머무름 시간(retention time)과 모양(shape)을 최적화하기 위해 ammonium formate, ammonium acetate,formic acid, acetic acid의 농도를 달리하여 이동상 A용매로 제조하였고, 메탄올과 아세토니트릴을 이동상B 용매로 선정하였다. 이동상 A와 B를 조합하여 사용한 결과 MA, 4HMA, AP 및 4HA 분석에 가장 효과적인 조합은 0.4 % formic acid가 포함된 증류수(A)와메탄올(B)이었다.
- ammonium formate, ammonium acetate,formic acid 및 acetic acid 등의 첨가물질의 농도를 달리한 결과, 분석물질의 머무름 시간 이동, 피크 사이의 분리능 변화, 검출 강도의 차이를 확인할 수 있었다. 이동상 조합을 총 22가지로 달리하여 확인한 결과,0.4 % formic acid가 포함된 증류수와 메탄올 조합이기질에 의한 방해물질의 간섭요소를 최소화하면서 피크의 검출 강도가 높게 나타났으며, 대부분의 분석물질에 대한 크로마토그램 상의 피크 분리능이 탁월하여 이동상으로써 가장 적합한 것으로 확인되었다. 다만, 이동상 A에 formic acid 또는 acetic acid를 첨가한경우 보다 ammonium formate 또는 ammonium acetate를 이동상에 첨가하였을 때 분석물질의 머무름 시간을 뒤로 밀려 분석시간이 증가하였다.
- 2). 이러한 결과로부터 시료의 기질에 의한 방해물질의 간섭현상을 최소화하는데 초고속원심분리법이 효과적임을알 수 있었다.
- 추가적인 정제과정 없이 50000 g에서3 min 동안 초고속원심분리를 진행하여 기질의 방해물질에 의한 background noise를 효과적으로 제거할수 있었다. 전처리 과정에 시료 희석 주입법을 적용함으로써 시료의 손실을 최소화하고 처리 시간을 줄일수 있었다. 본 연구를 통해 개발된 분석법을 실제 복용자 12 명의 소변 시료에 적용했을 때 방해물질의간섭 없이 신속히 MA, 4HMA, AP, 4HA에 대한 정량분석을 수행할 수 있었다.
- 3 %로 측정되었다. 정확도 및 정밀도 모두 15 % 이내의 편차와 -15 %-15 %를 넘지 않는 변동계수 값을갖는 양호한 결과를 얻었다
- 증류수-아세토니트릴로 구성된 이동상 조합은 MA의 MRM 크로마토그램의 강도(intensity)를 증가시키는 것으로 확인되었다. 증류수-메탄올의 이동상 조합은 증류수-아세토니트릴 조합보다 기질에 의한 방해물질의 간섭요소를 최소화시키는 것에 효과적인 것으로 나타났다. ammonium formate, ammonium acetate,formic acid 및 acetic acid 등의 첨가물질의 농도를 달리한 결과, 분석물질의 머무름 시간 이동, 피크 사이의 분리능 변화, 검출 강도의 차이를 확인할 수 있었다.
- 증류수-아세토니트릴로 구성된 이동상 조합은 MA의 MRM 크로마토그램의 강도(intensity)를 증가시키는 것으로 확인되었다. 증류수-메탄올의 이동상 조합은 증류수-아세토니트릴 조합보다 기질에 의한 방해물질의 간섭요소를 최소화시키는 것에 효과적인 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 전처리 과정이 간단하면서도 정량적신뢰성을 확보한 소변 중 MA, 4HMA, AP 및 4HA에대한 LC-MS/MS 분석법을 개발하였고 그 유효성을확인하였다. 추가적인 정제과정 없이 50000 g에서3 min 동안 초고속원심분리를 진행하여 기질의 방해물질에 의한 background noise를 효과적으로 제거할수 있었다. 전처리 과정에 시료 희석 주입법을 적용함으로써 시료의 손실을 최소화하고 처리 시간을 줄일수 있었다.
- 희석무결성 실험을 통해 최고정량한계를 4HA, AP,4HMA는 1500 ng/mL, MA는 7500 ng/mL까지 확장할 수 있었다. 최고정량한계를 3배 넘어서는 시료를5, 10, 20 배 희석하여 측정된 정밀도(% CV)는 1.
후속연구
- 16-17 1차 면역화학분석법은 두 화합물 사이의 유사한 분자 구조 또는 대사과정을 거친화합물을 모두 감지한다. 이러한 이유로 면역학적 검사만으로는 소변에서 AP를 복용하였는지, MA를 복용하였는지를 구분할 수 없어 추가적인 확인감정을 진행해야 한다.18 GC-MS는 마약류 분석에 가장 널리사용되는 분석기기이다.
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