본 연구는 LLE(liquid-liquid extraction) 전처리 방법과 HPLC/UV를 이용하여 혈장에서 이트라코나졸을 정량 분석하는 방법을 연구하였다. 이트라코나졸과 내부표준물질(펠로디핀)을 디에틸에테르로 추출하고 C18 컬럼을 이용하여 분리한 후 UV 검출기를 통하여 254 nm에서 검출하였다. 이동상은 10 mM 아세트산암모늄완충액(pH 7) :아세토나이트릴(35:65, v/v) 혼합용액을 사용하였으며, 유속은 0.2 mL/min.으로 하였다. 정량범위는 2~1,000 ng/mL 이며, 상관관계($R^2$)는 0.9991로 좋은 직선성을 보였다. 정량한계는 2 ng/mL, 재현성은 변동계수가 10.8 이하, 정확도는 97.2~108.2% 였다. 이 분석방법은 혈장 중의 약물 정량 및 약물의 약동력학에 유용함을 보여주었다.
본 연구는 LLE(liquid-liquid extraction) 전처리 방법과 HPLC/UV를 이용하여 혈장에서 이트라코나졸을 정량 분석하는 방법을 연구하였다. 이트라코나졸과 내부표준물질(펠로디핀)을 디에틸에테르로 추출하고 C18 컬럼을 이용하여 분리한 후 UV 검출기를 통하여 254 nm에서 검출하였다. 이동상은 10 mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 7) :아세토나이트릴(35:65, v/v) 혼합용액을 사용하였으며, 유속은 0.2 mL/min.으로 하였다. 정량범위는 2~1,000 ng/mL 이며, 상관관계($R^2$)는 0.9991로 좋은 직선성을 보였다. 정량한계는 2 ng/mL, 재현성은 변동계수가 10.8 이하, 정확도는 97.2~108.2% 였다. 이 분석방법은 혈장 중의 약물 정량 및 약물의 약동력학에 유용함을 보여주었다.
This method is used for the determination of itraconazole in human plasma by liquid-liquid extraction and high performance liquid chromatography. Felodipine was used as an internal standard. After extraction of the plasma with diethyl ether, the centrifuged upper layer was then transferred. The supe...
This method is used for the determination of itraconazole in human plasma by liquid-liquid extraction and high performance liquid chromatography. Felodipine was used as an internal standard. After extraction of the plasma with diethyl ether, the centrifuged upper layer was then transferred. The supernantant was evaporated and then reconsituted with mobile phase. The mobile phase was composed of 10 mM ammonium acetate adjusted to pH 7 by phosphoric acid with a flow rate of 0.2 mL/min. A C18 reversed-phase column with a pre-column was used as the analytial column. Linear detection responses were obtained for itraconzole concentration range for 2~1,000 ng/mL. The correlation coefficient of linear regression($R^2$) was 0.9991, limit of quantification (LOQ) was 2 ng/mL, reproducibility was less than 10.8 %, and accuracy was 97.2~108.2%. This method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of itraconazole in human plasma.
This method is used for the determination of itraconazole in human plasma by liquid-liquid extraction and high performance liquid chromatography. Felodipine was used as an internal standard. After extraction of the plasma with diethyl ether, the centrifuged upper layer was then transferred. The supernantant was evaporated and then reconsituted with mobile phase. The mobile phase was composed of 10 mM ammonium acetate adjusted to pH 7 by phosphoric acid with a flow rate of 0.2 mL/min. A C18 reversed-phase column with a pre-column was used as the analytial column. Linear detection responses were obtained for itraconzole concentration range for 2~1,000 ng/mL. The correlation coefficient of linear regression($R^2$) was 0.9991, limit of quantification (LOQ) was 2 ng/mL, reproducibility was less than 10.8 %, and accuracy was 97.2~108.2%. This method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of itraconazole in human plasma.
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문제 정의
현재까지 보고 되어진 HPLC를 이용한 분석법으로 혈장 중 이트라코나졸의 농도를 분석할 경우 반감기 22시간 이상에서는 정량이 되지 않아 약물역학적 특성, 즉 생체이용률(흡수 속도와 흡수 정도)을 구할 수가 없었다. 본 연구에서는 정량한계를 2 ng/mL까지 낮출 수 있는 HPLC/UV 분석법을 개발하여 혈장 중 이트라코나졸의 농도를 최대 72시간까지 정량할 수 있게 하여 약물정량 및 약물의 약동력학에 활용할 수 있게 하였다.
제안 방법
12명의 건강한 남성 지원자에게 이트라코나졸 200mg을 경구투여한 후 경시적으로 채혈하여 본 분석조건에 따라 분석한 혈장 중 평균 이트라코나졸의 농도-시간 곡선을 나타내었다. 본 분석조건에 의해서는 이트라코나졸 200 mg을 경구투여한 후 72시간까지 이트라코나졸의 혈장 중 농도를 측정할 수 있었다(Fig.
30세 미만의 건강한 남자 12명에게 200 mg의 이트라코나졸을 240 mL 물과 함께 경구투약 후 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 36, 48 및 72 hr에서 채혈한 혈장시료 1 mL를 15 mL 시험관에 넣고 여기에 내부표준물질 20 µL와 1 M 수산화나트륨 100 µL를 가한 다음 탁상용 혼합기에서 1분간 혼합하였다. 이용액에 디에틸에테르 6 mL를 넣어 왕복진탕기에서 30분 동안 진탕혼합하여 이트라코나졸과 내부표준물질인 펠로디핀을 추출하였다.
HPLC 장치는 waters사의 HPLC 시스템을 사용하였고, 각각의 구성원은 in-line degasser AF, waters 717plus auto sampler, HPLC용 waters 1525u 펌프, waters 5CH 컬럼 오븐 그리고 waters 2487 UV-VIS 검출기로 이루어졌다. 데이터 처리장치로는 waters사의 Breeze를 사용하였다.
본 실험에서는 시료 70 µL를 자동주입기로 주입한 후, Grace vydac guard cartridge(10×2.1 mm, 5 µm)와 Capcell pak UG C18(150×2.0 mm, 5 µm)을 이용하여 10 mM 아세트산 암모늄 완충액: 아세토나이트릴 (35:65, v/v) 혼합용매를 유속 0.2 mL/min으로 통과시키면서 이트라코나졸을 분리하고, 유출액은 UVVIS검출기를 이용하여 254 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 중 이트라코나졸의 농도는 내부표준물질인 펠로디핀(felodipine)의 peak 면적에 대한 이트라코나졸의 peak 면적의 비로부터 구한 검량선을 바탕으로 하여 분리된 펠로디핀과 이트라코나졸의 면적비를 구하여 정량하였다.
이트라코나졸 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 1,000 µg/mL가 되도록 제조한 후 차광하여 4℃에서 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 공혈장으로 희석하여 혈장 중 이트라코나졸 농도가 각각 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000 ng/mL가 되도록 표준혈장을 만들었다. 또한 내부 표준물질인 펠로디핀은 메탄올에 녹여 1,000 µg/mL가 되도록 한 후 탈이 온수로 희석하여 50 µg/mL가 되도록 제조하여 4℃에서 보관시켰다.
2 mL/min으로 통과시키면서 이트라코나졸을 분리하고, 유출액은 UVVIS검출기를 이용하여 254 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 중 이트라코나졸의 농도는 내부표준물질인 펠로디핀(felodipine)의 peak 면적에 대한 이트라코나졸의 peak 면적의 비로부터 구한 검량선을 바탕으로 하여 분리된 펠로디핀과 이트라코나졸의 면적비를 구하여 정량하였다. 상기에서 얻어진 모든 데이터는 Breeze 3.
혈장 중 이트라코나졸의 농도를 2 ng/mL까지 측정할 수 있는 정밀성과 정확성을 갖춘 비교적 간단한 분석법을 확립하였다. 정량한계를 낮춤으로써 이트라코나졸의 반감기인 22시간이상 최대 72시간까지 혈장 중 이트라코나졸의 농도를 측정할 수 있게 되어 생체내의 약물의 흡수율과 생체 이용률을 알 수 있게 되었다.
대상 데이터
HPLC 장치는 waters사의 HPLC 시스템을 사용하였고, 각각의 구성원은 in-line degasser AF, waters 717plus auto sampler, HPLC용 waters 1525u 펌프, waters 5CH 컬럼 오븐 그리고 waters 2487 UV-VIS 검출기로 이루어졌다. 데이터 처리장치로는 waters사의 Breeze를 사용하였다. 기타 장비로는 원심분리기(MF 300, 한일과학, 한국), 탁상용 혼합기(Maxi Mix II, Thermolyne, lowa, 미국), 왕복진탕기(J-SGM, 제일과학, 한국) 및 질소증발기(N-EVAPIII, Orgaromation inc.
이동상은 10 mM 아세트산 암모늄 완충액 : 아세토나이트릴 (35:65, v/v) 혼합용액을 사용하였으며, 디에틸아민을 전체 용액에 0.05% 첨가하였고 인산을 이용하여 pH를 7로 맞추었다. 추출 용매는 디에틸에테르를 사용하였다.
이트라코나졸은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 표준품을 구입하였고, 내부표준물질로 사용한 펠로디핀은 한미약품공업주식회사로부터 공급받았다. 그 외의 시약들은 특급이나 HPLC용 등급을 사용하였다.
05% 첨가하였고 인산을 이용하여 pH를 7로 맞추었다. 추출 용매는 디에틸에테르를 사용하였다.
성능/효과
각기 다른 4가지 농도 (2, 20, 200 및 1,000 ng/mL)의 이트라코나졸의 표준혈장을 분석하였을 때 본 분석방법의 정밀성 C.V.%는 일내 정밀성이 2.03~9.67%, 일간 정밀성은 5.52~10.86%로 나타났고 정확성은 97.2~108.2%로 나타났으며(Table 1), 전처리를 통한 이트라코나졸과 펠로디핀의 회수율은 각각 77±5%, 83±3%로 나타났다.
따라서 상기의 분석방법에 의한 이트라코나졸의 분석은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
12명의 건강한 남성 지원자에게 이트라코나졸 200mg을 경구투여한 후 경시적으로 채혈하여 본 분석조건에 따라 분석한 혈장 중 평균 이트라코나졸의 농도-시간 곡선을 나타내었다. 본 분석조건에 의해서는 이트라코나졸 200 mg을 경구투여한 후 72시간까지 이트라코나졸의 혈장 중 농도를 측정할 수 있었다(Fig. 4).
혈장 중 이트라코나졸의 농도를 2 ng/mL까지 측정할 수 있는 정밀성과 정확성을 갖춘 비교적 간단한 분석법을 확립하였다. 정량한계를 낮춤으로써 이트라코나졸의 반감기인 22시간이상 최대 72시간까지 혈장 중 이트라코나졸의 농도를 측정할 수 있게 되어 생체내의 약물의 흡수율과 생체 이용률을 알 수 있게 되었다. 이와 같은 분석법은 혈장 중의 약물 정량 및 약물의 약동력학에 활용할 수 있을 것으로 사료되었다.
후속연구
정량한계를 낮춤으로써 이트라코나졸의 반감기인 22시간이상 최대 72시간까지 혈장 중 이트라코나졸의 농도를 측정할 수 있게 되어 생체내의 약물의 흡수율과 생체 이용률을 알 수 있게 되었다. 이와 같은 분석법은 혈장 중의 약물 정량 및 약물의 약동력학에 활용할 수 있을 것으로 사료되었다.
참고문헌 (14)
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V. Srivatsan, A. K. Dasgupta, Prashant Kale, Rama Raju Datla, Devangi Soni, Mahendra Patel, Rakesh Patel, and Chandrakant Mavadhiya, J. Chromatogr. A, 1031, 307 (2004)
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