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문제 정의
- 본 연구는 Transmission Disequilibrium Test(이하 TDT)를 이용한 가족 기반 연구로써, ASD를 가진 아동들과 그 부모로 이루어진 trio를 대상으로 ASD와 NMDA 수용체 유전자, 그 가운데 GRIN2B 유전자와의 관련성을 규명하고자 하였다.
- 본 연구는 아시아 국가들 가운데 최초로 ADI-R과 ADOS 등 체계적인 자폐장애 진단 도구를 사용하여 대상군을 평가한 연구이다. 이들은 자폐장애의 연구에 있어 국제적인 표준으로 받아들여지고 있는 진단 도구들이므로 향후 본 연구의 결과를 타인종에서의 연구 결과들과 비교분석 하는 데에 유용한 기반을 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
- 아직까지 한국 내에서 한국인 자폐장애 아동을 대상으로 한 가족기반 유전연구는 발표된 바 없다. 본 연구는 자폐스펙트럼장애 아동 및 생물학적 부모 trio를 대상으로 한 가족기반 유전연구로 GRIN2B 유전자의 SNP와 자폐스펙트럼장애 사이에 유의한 연관성을 보였다. 이는 glutamate NMDA 수용체 유전자가 이 질환의 발생에 관여할 가능성을 시사하는 것이라 생각된다.
- 본 연구의 목적은 자폐스펙트럼장애를 가진 아동들과 그 부모로 이루어진 trio를 대상으로 이 장애와 NMDA 수용체 유전자, 그 가운데 GRIN2B 유전자와의 관련성을 규명하고자 하는 것이다.
제안 방법
- 6μg genomic DNA, 10pmole of primers를 함유하고 있는 40µl reaction volume에서 수행되었다. GRIN2B 유전자에서 모두 4개의 단일유전자다형성(single nucleotide polymorphism, 이하 SNP)을 분석하였는데(rs7301328, rs1806201, rs1805247, rs1805502), 각각은 적정한 annealing temperature에서 30-60초-30초에 걸쳐 40 cycle의 PCR을 반복하였다. PCR 과정에 사용된 oligonucleotide primer들의 염기 서열 및 제한효소, 그리고 온도(annealing and incubation temperature)는 표 1과 같다.
- 선별된 아동과 부모들에게는 한국판 자폐증 진단 관찰 스케줄(Autism Diagnostic Observation Schedule, 이하 ADOS) 및 자폐증 진단 면담-개정판(Autism Diagnostic Interview-Revised, 이하 ADI-R)를 실시하였다. PCR-RFLP법을 이용, GRIN2B 유전자에서 모두 4개의 단일 염기 다형성을 분석하였다(rs7301328, rs1806201, rs1805247, rs1805502). 각각의 SNPs에 대한 allelic association 을 평가하기 위하여 TDT 방법이 시행되었으며, 이를 통해 자폐장애 아동이 부모로부터 후보유전자의 특정 alleles들을 유의하게 더 많이 전달받았는지의 여부를 관찰한 뒤 McNemar chi-square test(df=1)에 의거하여 분석하였다.
- SNP들의 각 allele들에 대한 transmission ratio(transmitted/not transmitted)와 그에 대한 95% CI(confidence interval)를 구하였다. 통계 프로그램은 SAS(Ver.
- 05). 각각의 SNP에 대한 GRIN2B 유전자의 allelic frequencies와 genotypic frequencies, TDT 분석 결과를 각각 표 2와 표 3에 각각 제시하였다.
- 모든 대상군 부모들에게는 연구자가 직접 제작한 발달력과 가족력에 대한 기초적인 인적사항 설문을 실시하였으며, 대상군 아동에게는 발달수준과 검사 적용 가능성여부에 따라 한국판 웩슬러 지능검사(Korean Educational Developmental Institute-Wechsler Intelligence Scale for Children; KEDI-WISC)32)와 한국판 사회성숙도 검사(Korean version of Vineland Social Maturity Scale；K-VSMS)33)를 시행하였다.
- 선별된 아동과 부모들에게는 미국의 원저자로부터 도구 사용에 대한 훈련과정을 통하여 신뢰도 평가 과정을 마친 검사자가 한국판 자폐증 진단 관찰 스케줄(Autism Diagnostic Observation Schedule, 이하 ADOS)30) 및 자폐증 진단 면담-개정판(Autism Diagnostic Interview-Revised, 이하 ADI-R)31)을 실시하였다.
- DSM-IV 진단체계를 이용하여 2명의 소아정신과 의사가 자폐 스펙트럼 장애로 진단한 아동이 일차적인 연구 대상으로 선별되었다. 선별된 아동과 부모들에게는 한국판 자폐증 진단 관찰 스케줄(Autism Diagnostic Observation Schedule, 이하 ADOS) 및 자폐증 진단 면담-개정판(Autism Diagnostic Interview-Revised, 이하 ADI-R)를 실시하였다. PCR-RFLP법을 이용, GRIN2B 유전자에서 모두 4개의 단일 염기 다형성을 분석하였다(rs7301328, rs1806201, rs1805247, rs1805502).
- 자폐장애의 발병에 영향을 줄 수 있는 신체 질환이나 신경학적 질환을 배제하기 위하여 과거력 조사, 이학적 신체검사 및 신경학적 검사, 뇌파검사를 시행하였고, 임상적/신경학적으로 필요하다고 판단된 경우에는 뇌자기 공명 촬영술과 염색체 검사 등이 시행되었다. 이러한 과정을 통해 신경섬유종증(neurofibromatosis), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 원인 불명의 뇌병증(encephalopathy) 및 기타 뇌기질적 질환, 취약 X 염색체 증후군, 다운 증후군, 기타 염색체 이상과 같이 자폐스펙트럼 장애의 발병에 원인을 제공할 수 있는 타 의학적 상태가 동반되었거나 갖고 있는 것으로 강하게 의심되는 환자들은 연구 대상에서 배제하기로 하였다.
- 각각의 PCR product들은 특정 제한 효소들을 처치한 후(표 1) 적정 온도의 수조에 20시간 동안 반응시켰다. 제한효소에 의해 절단된 절편들은 0.5xTBE running buffer 내 3.5% agarose gel에서 전기영동이 실시되었으며 ethidium bromide를 이용하여 염색하고 UV trans-illuminator를 사용하여 관찰하였다.
대상 데이터
- 1) 연구 대상군의 특성：총 126명의 자폐 스펙트럼장애 아동과 그들의 생물학적 부모가 최종 분석 대상에 포함되었다. 전체 대상자 중 109명(86.
- 7) 많은 연구자들이 PDD의 분류에 있어 범주적 구분(categorical classification)보다는 차원적 구분(dimensional classification)인 자폐스펙트럼장애의 개념이 임상적, 학문적으로 유용함을 인정하고 있다.45)48) 따라서 본 연구에서는 다양하고 서로 이질적인 발달장애들 가운데 언어 및 상호작용, 제한된 관심범위 및 상동적 행동이라는 세 가지 공통된 증상의 요인을 가지는 질병군을 하나의 스펙트럼으로 묶을 수 있다는 관점 하에, 자폐장애보다는 자폐스펙트럼장애를 분석의 대상으로 삼았다.
- 41：1이었다. 대상군의 진단 분포는 자폐장애 107명(85.1%), 달리 분류되지 않는 전반적 발달장애(PDD, NOS) 17명(13.5%), 아스퍼거 씨 장애(Asperger’s disorder) 2명(1.6%)이었다. 대상군 아동의 평균 연령은 71.
- 41：1이었다. 대상군의 진단 분포는 자폐장애 107명(85.1%), 달리 분류되지 않는 전반적 발달장애(Pervasive developmental disorders, not otherwise specified；이하 PDD, NOS) 17명(13.5%), 아스퍼거 씨 장애(Asperger’s disorder) 2명(1.6%)이었다. 대상군 아동의 평균 연령은 71.
- 발달지연을 주소로 가천의대 길병원과 경상대학교병원 소아정신과 외래를 내원한 아동을 선별 대상으로 하였다. DSM-IV 진단체계를 이용하여 2명의 소아정신과 의사가 자폐 스펙트럼 장애로 진단한 아동이 일차적인 연구 대상으로 선별되었다.
- 연구 대상군은 자폐 스펙트럼 장애로 일차 진단된 아동과 그들의 생물학적 부, 모를 대상으로 하였으며 이들은 모두 국내에 거주하는 한민족으로 구성되었다. 연구 대상군은 발달지연을 주소로 가천의대 길병원과 경상대학교병원 소아정신과 외래를 내원한 아동이나 해당 지역사회 내 복지관, 특수교육기관 및 부모협회 등으로부터 연구에 참여할 것을 동의하여 의뢰된 아동을 선별 대상으로 하였다. 이 가운데 DSM-IV 진단체계를 이용하여 2명의 소아정신과 의사가 자폐 스펙트럼 장애로 진단한 아동이 일차적인 연구 대상으로 선별되었다.
- 연구 대상군은 자폐 스펙트럼 장애로 일차 진단된 아동과 그들의 생물학적 부, 모를 대상으로 하였으며 이들은 모두 국내에 거주하는 한민족으로 구성되었다. 연구 대상군은 발달지연을 주소로 가천의대 길병원과 경상대학교병원 소아정신과 외래를 내원한 아동이나 해당 지역사회 내 복지관, 특수교육기관 및 부모협회 등으로부터 연구에 참여할 것을 동의하여 의뢰된 아동을 선별 대상으로 하였다.
데이터처리
- PCR-RFLP법을 이용, GRIN2B 유전자에서 모두 4개의 단일 염기 다형성을 분석하였다(rs7301328, rs1806201, rs1805247, rs1805502). 각각의 SNPs에 대한 allelic association 을 평가하기 위하여 TDT 방법이 시행되었으며, 이를 통해 자폐장애 아동이 부모로부터 후보유전자의 특정 alleles들을 유의하게 더 많이 전달받았는지의 여부를 관찰한 뒤 McNemar chi-square test(df=1)에 의거하여 분석하였다.
이론/모형
- 각각의 SNPs에 대한 allelic association 을 평가하기 위하여 TDT 방법이 시행되었다.34) TDT는 가족내 연계성 검사(within-family test of linkage disequilibrium)의 한 방법으로, 자폐장애 아동이 부모로부터 후보 유전자의 특정 alleles들을 유의하게 더 많이 전달받았는지의 여부를 관찰한 뒤 McNemar chi-square test(df=1)에 의거하여 분석하였다.
- 이 가운데 DSM-IV 진단체계를 이용하여 2명의 소아정신과 의사가 자폐 스펙트럼 장애로 진단한 아동이 일차적인 연구 대상으로 선별되었다. 선별을 돕기 위해 대상군 모두에게 한국판 자폐평정척도(Korean version of Childhood Autism Rating Scale, 이하 K-CARS)가 사용되었다.
성능/효과
- 이학적, 신경학적, 뇌기능 및 뇌영상학적 검사 결과 1명은 신경섬유종증, 1명은 정확한 진단을 내리기 어려운 광범위한 뇌병증을 가지고 있어서 분석 대상에서 제외하였다. 16명(12.7%)의 환자들이 뇌파검사 결과 부분발작(partial seizure) 또는 광범위한 대뇌 기능부전(diffuse cerebral dysfunction)을 시사하는 이상소견을 보였으나 임상적으로 의미 있는 경련성 질환을 갖고 있는 환자는 없었으며, 다른 신경학적 이상 없이 뇌파이상만을 보인 아동들은 분석에 모두 포함시켰다.
- 5~46)로 나타났다.2) 유전자 분석：분석한 GRIN2B 유전자의 4개 SNPs 가운데 하나의 SNP(rs1805247)에서 의미 있는 allelic transmission의 차이를 보였다. 이 SNP에서 transmission ratio(transmitted alleles/non-transmitted alleles)는 A allele과 G allele에서 각각 2.
- 일란성 쌍생아의 경우 자폐장애에서 40~60%, ASD에서 70~90%의 일치율을 보인 반면, 이란성 쌍생아에서는 0~25%의 일치율이 보고되었다.2)3) 형제간 일치율은 2~6%로, 이는 일반 인구에서의 위험률인 .03~1%에 비해 50~100배나 높다.4-7) 또한 자폐장애의 5%에서 이미 알려진 염색체 이상 질환이 동반되며, 10%에서는 fragile X 증후군이나 결절성 경화증(tuberous sclerosis)과 같이 멘델리안 유전 법칙을 따르는 질환을 가지는 점 등은 자폐장애의 유전적 요인을 뒷받침하는 강력한 증거가 되어 왔다.
- 45) 특히 PDD, NOS는 전반적 발달장애의 진단 기준을 만족시키면서 자폐장애의 진단기준을 모두 만족시키지 않는 residual diagnosis로서 그 진단적 타당성이 명백하게 제시되지 못하는 경향이 있고, 고기능 자폐증과 아스퍼거 증후군의 경계 또한 명확하지 않다.46)47) 뿐만 아니라 그 동안의 유전연구들은 자폐장애와 PDD 내의 다른 소수 질환들(lesser variants)이 동일한 유전적 메커니즘을 공유하고 있다는 것을 지지하고 있다.
- 그 결과, 총 126명의 자폐 스펙트럼장애 아동과 그들의 생물학적 부모가 최종 분석 대상에 포함되었다. 전체 대상자 중 109명(86.
- NR2B를 암호화하는 유전자(이하 GRIN2B)는 12번 염색체의 단완(12p12)에 위치해 있다. 동물과 사람 모두에서 NR2B subunit는 피질, 뇌해마, 선조체, 시상, 후신경구(olfactory bulb) 등 전뇌부에 주로 분포해 있는 것으로 알려졌다.11-15)
- NMDA 수용체는 뇌신경계의 발달과 시냅스 전달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 GRIN2B 유전자의 작은 변화는 MNDA 2B 수용체가 매개하는 신경 전달 경로에 영향을 미치고, 따라서 glutamate의 신호 전달 기능을 감소시킬 수 있을 것으로 보인다. 이런 신호 전달 기능의 변화는 뇌신경계가 발달하는 과정에서 뇌의 광범위한 부위, 특히 NMDA 2B 수용체가 집중적으로 존재하는 뇌해마, 시상, 피질, 그리고 기저핵과 소뇌 등에 영향을 미치고,40) 그 결과로 언어, 학습, 기억, 사회적 행동 양식, 상동증적 관심 및 행동 등을 포함한 자폐장애 관련 표현형으로 나타나게 할 가능성이 있다고 추론할 수 있다.
- 본 연구에서 GRIN2B 유전자의 단일유전자 다형성과 자폐스펙트럼장애 사이에 유의한 연관성을 보였다. 이는 glutamate NMDA 2B수용체 유전자가 이 질환의 발생에 관여할 가능성을 시사하는 것이라 생각된다.
- 분석한 GRIN2B 유전자의 4개 SNPs 가운데 하나의 SNP(rs1805247)에서 의미 있는 allelic transmission의 차이를 보였다. 이 SNP에서 transmission ratio(transmitted alleles/non-transmitted alleles)는 A allele과 G allele에서 각각 2.
- 분석한 GRIN2B 유전자의 4개 SNPs 가운데 하나의 SNP(rs1805247)에서 의미 있는 allelic transmission의 차이를 보였다. 이 SNP에서 transmission ratio(transmitted alleles/non-transmitted alleles)는 A allele과 G allele에서 각각 2.03과 .49로, A allele이 G allele에 비해 부모로부터 환자군에게 더 빈번하게 전달(preferential transmission) 되었음이 확인되었다(TDT χ2=12.89, p=.0003). 이는 Bonferroni correction 후에도 여전히 유의미한 수준을 유지하였다(p=.
후속연구
- 43) 또한 이 부위는 한국인을 대상으로 한 알코올 의존의 유전연구에서 탐색된 바 있었으나 알코올 의존군과 대조군 사이에 유의미한 전달의 차이를 보이지 않았다.44) 따라서 이 SNP 부위는 자폐관련 장애에 있어서는 새롭게 탐색된 것이며, 향후 이 부위가 자폐스펙트럼장애 전반뿐 아니라 자폐장애의 특정 행동 표현형과 관련성이 있는지를 규명하는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구는 아시아 국가들 가운데 최초로 ADI-R과 ADOS 등 체계적인 자폐장애 진단 도구를 사용하여 대상군을 평가한 연구이다. 이들은 자폐장애의 연구에 있어 국제적인 표준으로 받아들여지고 있는 진단 도구들이므로 향후 본 연구의 결과를 타인종에서의 연구 결과들과 비교분석 하는 데에 유용한 기반을 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
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