단백 효소 가수분해물의 천연 항균제로서의 응용성을 검토하기 위하여 casein에 5종의 단백질 가수분해 효소를 작용시켜 얻어진 가수 분해물의 항균활성을 측정하고 활성이 가장 높은 가수분해물을 부분 정제하여 그 응용성을 검토하였다. Casein에 5종 단백질 분해효소를 작용시켜 얻은 가수분해물의 항균활성은 Aspergillus oryzae protease에 의한 것이 가장 높았다. 효소처리에 의하여 얻어진 가수분해 물을 30,000, 10,000, 3,000 membrane filter로 한외여과 하였을 때 항균활성은 3,000이하 분획물에 대부분 함유되어 있었으며 공시균주에 대한 최소저해농도는 $1.0\~1.5\;mg/mL$이었다. Aspergillus oryzae pretense로 작용시킨 casein 가수분해물은 $121^{\circ}C$에서 10분간 가열했을 때도 그 항균 활성을 유지하는 것으로 보아 열에 안정하였다. 가수분해물을 HPLC로 220 nm 280 nm에서 검출된 peak 별로 수집하여 항균활성을 측정 한 결과 retentiontime 12.6, 13.2 분에서 분취된 peptide가 활성이 있었다. 가수분해 동결건조물을 된장에 첨가하였을 때 미생물의 생육이 저해되었으며 실용성이 있었다.
단백 효소 가수분해물의 천연 항균제로서의 응용성을 검토하기 위하여 casein에 5종의 단백질 가수분해 효소를 작용시켜 얻어진 가수 분해물의 항균활성을 측정하고 활성이 가장 높은 가수분해물을 부분 정제하여 그 응용성을 검토하였다. Casein에 5종 단백질 분해효소를 작용시켜 얻은 가수분해물의 항균활성은 Aspergillus oryzae protease에 의한 것이 가장 높았다. 효소처리에 의하여 얻어진 가수분해 물을 30,000, 10,000, 3,000 membrane filter로 한외여과 하였을 때 항균활성은 3,000이하 분획물에 대부분 함유되어 있었으며 공시균주에 대한 최소저해농도는 $1.0\~1.5\;mg/mL$이었다. Aspergillus oryzae pretense로 작용시킨 casein 가수분해물은 $121^{\circ}C$에서 10분간 가열했을 때도 그 항균 활성을 유지하는 것으로 보아 열에 안정하였다. 가수분해물을 HPLC로 220 nm 280 nm에서 검출된 peak 별로 수집하여 항균활성을 측정 한 결과 retention time 12.6, 13.2 분에서 분취된 peptide가 활성이 있었다. 가수분해 동결건조물을 된장에 첨가하였을 때 미생물의 생육이 저해되었으며 실용성이 있었다.
This study was carried out to produce antimicrobial peptides from casein using various proteases. To examine whether the hydrolysis of casein would produce antimicrobial substance and the application as natural antimicrobial material, casein was hydrolyzed by five different proteases. The casein hyd...
This study was carried out to produce antimicrobial peptides from casein using various proteases. To examine whether the hydrolysis of casein would produce antimicrobial substance and the application as natural antimicrobial material, casein was hydrolyzed by five different proteases. The casein hydrolysate was fractionated with regenerated membrane filter (molecular weight cut-off 30,000 10,000 and 3,000) and antimicrobial activity was measured for each fraction. Antimicrobial activity appeared great in the fraction below 3,000 molecular weight The fraction was re-fractionated by high performance liquid chromatography and substance of main peak (retention time: 13.2 min) collected was used as a sample to measure antimicrobial activity. Among the casein hydrolysates produced by protease, antimicrobial activity was observed the greatest in hydrolysate treated with Aspergillus oryzae protease. The minimum inhibition concentrations of the Asp. oryzae protease hydrolysate were 1.0-1.5 mg/mL. This hydrolysate was a heat stable peptide since antimicrobial activity was maintained after treating with heat for 20 min at $121^{\circ}C$.
This study was carried out to produce antimicrobial peptides from casein using various proteases. To examine whether the hydrolysis of casein would produce antimicrobial substance and the application as natural antimicrobial material, casein was hydrolyzed by five different proteases. The casein hydrolysate was fractionated with regenerated membrane filter (molecular weight cut-off 30,000 10,000 and 3,000) and antimicrobial activity was measured for each fraction. Antimicrobial activity appeared great in the fraction below 3,000 molecular weight The fraction was re-fractionated by high performance liquid chromatography and substance of main peak (retention time: 13.2 min) collected was used as a sample to measure antimicrobial activity. Among the casein hydrolysates produced by protease, antimicrobial activity was observed the greatest in hydrolysate treated with Aspergillus oryzae protease. The minimum inhibition concentrations of the Asp. oryzae protease hydrolysate were 1.0-1.5 mg/mL. This hydrolysate was a heat stable peptide since antimicrobial activity was maintained after treating with heat for 20 min at $121^{\circ}C$.
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문제 정의
본인 등은 이용성 이 높은 她. orywe 기원의 protease을 casein에 작용시켜 가수 분해물을 제조하고 항균활성을 확 인하여 분자량 별로 분획하여 부분 정제하고 그 실용성을 검토하여 보고하는 바이다.
가설 설정
B : Filtrate of casein hydrolysate by 30,000 molecular weight membrane.
C : Filtrate of casein hydrolysate by 10,000 molecular weight membrane.
D : Filtrate of casein hydrolysate by 3,000 molecular weight membrane.
제안 방법
단백 효소 가수분해물의 천연 항균제로서의 응용성을 검토하기 위하여 casein에 5종의 단백질 가수분해 효소를 작용시켜 얻어진 가수 분해물의 항균활성을 측정하고 활성이 가장 높은 가수분해물을 부분 정제하여 그 응용성을 검토하였다. Casein에 5종 단백질 분해효소를 작용시켜 얻 은 가수분해물의 항균활성 은 Aspergillus oryzae protease 에 의한 것이 가장 높았다.
10% casein 용액을 85℃, 15분간 열처리하고 기질과 효소 비율이 30:l(w/w)이 되도록 효소를 첨가하여 효소의 최적 반응 온도인 37 ℃ 에서 4시간 진탕항온조에서 가수분해 시 켜 12,000 X g에서 15분간 원심분리 한 후 상징액을 취하여 항균활성을 측정하였다.
효소의 반응시간에 따른 casein의 가수분해 도는 trinHro- benzene-sulphonic acid (TNBS) 법 (40) 에 의해 측정하였다. 1% sodium dodecyl sulfate용액에 희석된 재료 0.25 uiL와 0.1 M-phosphate buffer (pH 8.2) 2 mL를 혼합 후 0.1% TNBS 용액 2 mL를 첨가하여 50℃에서 1시간 동안 빛을 차단한 상태에서 반응시켜 0.1N HC1 4 mL로 반응을 중지한 후 340 nm에서 흡광도를 측정하여 가수분해율을 계산하였다
1 mL을 무균적으로 첨가하여 잘 혼합한 후 기층용 배지 위에 고르게 펴지도록 도포 한 뒤 응고시켜 2중의 균 접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 0.45 iim membrane filter로 여과하여 제균하고 멸균한 단백질 가수분해물 상징 액 200 ㎕을 paper disc 에 loading하여 시험용 평판배지 위에 밀착시킨 후 37℃ 에서 24시간 배양 후 disc 주변 inhibition clear zone의 직경을 mm단위로 측정하여 항균활성을 비교하였다.
분자량 3, 000이 하의 가수분해 동결건조물을 0.5 mg-2.5 mg/mL이 되도록 영양한천배지에 첨가하여 응고시킨 후 공시균주 배양 현탁액을 도말한 다음 37℃, 24시간 배양하여 균이 증식 되지 않는 농도를 최소저해농도로 하였다.
Casein 가수분해물을 한외여과장치 (Amicon Co.)에 각각의 molecular weight cut-off 3, 000, 10, 000, 30, 000 인 membrane filter를 장착시키고 질소가스로 50 psi의 압력을 가하여 여과 한 후 분자량별 분획에 대하여 항균활성을 측정하였다.
각 psk의 분획물을 반복 수집하여 항균활성을 측정하였다.
항균활성이 있는 분자량 3, 000이하의 분획물을 동결건조 하여 된장에 3 mg/mLe 농도로 첨가하고 저장하면서 일반 세 균수를 측정 함으로서 식 품보존제로서의 응용성 여부를 검토하였다.
Asp. orywe 기원의 protease로 처리한 것 casein가수분해 물이 항균활성이 가장 높아 차후의 실험에서는 이 효소를 작용시켜 얻어진 가수분해물을 이용하여 실험을 행 하였다.
대상 데이터
단백질 가수분해물을 제조하기 위한 bovine casein과 단백질 가수분해 효소 pepsin (porcine stomach mucosa EC3.4.23.1), bromelain (EC 3.4.22.32), Aspergillus saitoi protease(EC 3.4.23.18), Aspergillus sojae protease, Aspergillus orywe proteasee는 Sigma -Aldrich사 제품을 사용하였다. Ultrafiltration cell 은 Amicon.
항균활성 측정 에 사용된 공시 균주인 Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus baureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium KCTC 1925, Escherichia coli ATCC 9637, Listeria monocytogenes ATCC 19115는 한국 생명공학연구 원에서 분양받아 사용하였으며 항균활성 측정에 사용된 배지는 Difco 사의 영양한천배지를 기층용 배지, Mueller Hinton medium을 중층용 배지로 사용하였다.
이론/모형
효소의 반응시간에 따른 casein의 가수분해 도는 trinHro- benzene-sulphonic acid (TNBS) 법 (40) 에 의해 측정하였다. 1% sodium dodecyl sulfate용액에 희석된 재료 0.
항균활성은 paper disc법(41)으로 측정하였다. 영 양한천 고체배지를 살균한 후 perti dish에 15 mL/씩 분주하여 기층 배지로 하고, 이에 0.
성능/효과
단백 효소 가수분해물의 천연 항균제로서의 응용성을 검토하기 위하여 casein에 5종의 단백질 가수분해 효소를 작용시켜 얻어진 가수 분해물의 항균활성을 측정하고 활성이 가장 높은 가수분해물을 부분 정제하여 그 응용성을 검토하였다. Casein에 5종 단백질 분해효소를 작용시켜 얻 은 가수분해물의 항균활성 은 Aspergillus oryzae protease 에 의한 것이 가장 높았다. 효소처리에 의하여 얻어진 가수분해 물을 30, 000, 10, 000, 3, 000 membrane filter로 한외여과 하였 을 때 항균활성은 3, 000이하 분획물에 대부분 함유되어 있 었으며 공시균주에 대한 최소저해농도는 1.
Casein 가수분해물의 항균활성은 일반적으로 미생물 기 원의 protease로 처리한 것이 식물기원의 protease로 처리한 것보다 높았으며 공시균주에 따라 항균활성이 달랐다.
Asp. oryzae protease에 의한 casein의 가수분해율은 Fig.1.에서 보는 바와 같이 효소 반응 12시간까지 증가하였으며 항균활성 과 가수분해 율과는 상관관계 가 있었다.
가수분해 물은 고체배지에서 측정한 최소저해 농도 1.0~1.5 mg/mL보다 약간 높은 농도에서 두 공시균주에 대하여 성장을 저해하였지만 완전히 정지시키지는 못하였고 균의 증식을 억제하는 결과를 나타내었다.
3와 같았다. 각 membrane으로 분획 한 상징 액 이 항균활성을 나 타내었고 분자량 3, 000이하에서도 항균활성을 나타내었으 므로 비교적 저분자량의 peptide가 항균활성을 가지는 것으로 확인할 수 있었다.
Casein에 5종 단백질 분해효소를 작용시켜 얻 은 가수분해물의 항균활성 은 Aspergillus oryzae protease 에 의한 것이 가장 높았다. 효소처리에 의하여 얻어진 가수분해 물을 30, 000, 10, 000, 3, 000 membrane filter로 한외여과 하였 을 때 항균활성은 3, 000이하 분획물에 대부분 함유되어 있 었으며 공시균주에 대한 최소저해농도는 1.0~1.5 mg/mL 이었다. Aspergillus oryzae protease로 작용시킨 casein 가수 분해물은 121℃에서 10분간 가열했을 때도 그 항균 활성을 유지하는 것으로 보아 열에 안정하였다.
5 mg/mL 이었다. Aspergillus oryzae protease로 작용시킨 casein 가수 분해물은 121℃에서 10분간 가열했을 때도 그 항균 활성을 유지하는 것으로 보아 열에 안정하였다. 가수분해물을 HPLC로 220 nm, 280 nm에서 검출된 peak 별로 수집하여 항균활성을 측정한 결과 retention time 12.
Aspergillus oryzae protease로 작용시킨 casein 가수 분해물은 121℃에서 10분간 가열했을 때도 그 항균 활성을 유지하는 것으로 보아 열에 안정하였다. 가수분해물을 HPLC로 220 nm, 280 nm에서 검출된 peak 별로 수집하여 항균활성을 측정한 결과 retention time 12.6, 13.2 분에서 분취된 peptide가 활성이 있었다. 가수분해 동결건조물을 된장에 첨가하였을 때 미생물의 생육이 저해되었으며 실용 성이 있었다.
후속연구
2분. 280 nm에서는 retention time 12.6분에서 항균 활성을 나타내었으며 항균활성 peplide에 대한 정확한 분자 량, 아미노산 결합 순서에 대하여 차후에 연구를 수행할 계획이다.
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