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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 DPPH 라디칼 소거활성을 HTS 기법을 통하여 알아보고자 실험과정의 제어 및 관리를 위한 자동화 시스템을 구축하고 제주산 해조류 46종을 20℃와 70℃에서 추출하여 92종의 추출물을 이용하여 HTS기법을 통해 DPPH 라디칼 소거활성을 대량 검색하여 항산화 활성 물질을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- DPPH 라디칼 소거활성은 Blosis [2] 방법에 맞게 Polara 2.0을 이용하여 프로그램을 만들어 전체적인 작동을 조절하였다 (Fig. 2). 즉, 메탄올에 녹인 여러 농도의 시료는 Liquid Handling System에 의해 96-well plate에 각각 100 μl씩 분주하였다.
- 분말화된 해조류 시료를 이용하여 메탄올 추출을 수행하였다. 즉 해조류에 메탄올을 첨가시켜 상온(20℃)과 70℃ 반응기에서 24시간 동안 추출을 하였고, 추출물은 rotary evaporator를 이용하여 40±1℃ 범위 내에서 감압 농축하여 실험에 사용하였다.
- 특히 해조류의 항산화 활성에 관한 연구가 많이 이루어지고 있으며 해조류의 높은 항산화 활성이 연구 보고되어지고 있다. 이에 본 연구에서는 다양한 해조류(녹조류 6종, 갈조류 18종 및 홍조류 22종)를 메탄올을 이용하여 20℃와 70℃에서 추출하여 항산화 활성 연구에 많이 사용되어지는 DPPH 라다칼을 이용하여 HTS를 통한 실험과정의 제어 및 관리를 위한 자동화 시스템을 구축하였고 HTS 기법을 통해 DPPH 라디칼 소거활성을 대량 검색하였다.
- 제주지역에서 서식하고 있는 해조류를 채취하여 형태학적으로 분류한 후 흐르는 물에 세척하여 동결건조하였다. 이것을 25 mesh 이하가 되도록 분쇄하여 분말화 하였다.
대상 데이터
- 반응 후 Robotic arm에 의해 96-well plate는 Victor3으로 옮겨져 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로는 ascorbic acid, butylated hy- droxy anisole (BHA), quercertin 및 trolox를 사용하였다. DPPH radical 소거활성은 아래의 식으로 산출하였고, DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도를 IC50로 표시하였다.
성능/효과
- 홍조류의 20℃ 추출물에서는 왜떨기나무붉은실 (20R24)에서 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고 (약 95%), 갈래잎 (20R17), 굵은참우뭇가사리 (20R18), 부채분홍잎 (20R23) 에서도 약 94%의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었는데 이 값은 시판되는 항산화제 (100 μg/ml)들과 비교했을 때, 비슷하거나 더 우수한 소거활성을 나타내는 것이다. 70℃ 추출물의 경우에서도 왜떨기나무붉은실 (20R24)과 부채분홍잎 (70R23)에서 각각 98%와 94%의 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 혹돌잎(70R20)에서도 약 65%의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내는 것을 확인하였다. 최근 많은 연구들에서 해조류에 의한 DPPH 라디칼 소거활성이 보고되어지고 있으며 [1,8,9], 특히 허 등 [6]은 홍조류가 DPPH 라디칼 소거활성이 높음을 보고한바 있다.
- 불레기말 (20B12)에서도 60% 이상의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고 꽈배기모자반과 불레기말 추출물을 제외한 추출물들에서는 40% 미만의 낮은 소거활성을 나타내었다. 갈조류 70℃ 추출물에서도 꽈배기모자반 (70B17)에서 약 95% 소거활성을 보이며 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 참그물바탕말 (70B1), 큰잎모자반 (70B16), 감태 (70B26) 에서도 80% 이상의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 허 등 [7]의 보고에서 꽈배기모자반, 참그물바탕말, 큰잎모자반과 감태의 메탄올 추출물에서 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 보인 결과와 일치하는 결과이다.
- 5과 6에 나타내었다. 갈조류의 20℃ 추출물 (1 mg/ml)들 중에서는 꽈배기모자반 (20B17)에서 약 96%의 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 보였는데, 이 수치는 실험에 사용된 시판되는 항산화제들(100 μg/ml)과 비교했을 때 비슷하거나 높은 수치를 나타내었다. 불레기말 (20B12)에서도 60% 이상의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고 꽈배기모자반과 불레기말 추출물을 제외한 추출물들에서는 40% 미만의 낮은 소거활성을 나타내었다.
- 갈조류의 경우 20℃ 추출물의 IC50 값은 블레기말 (20B12)에서 644 μg/ml를 보였고 꽈배기모자반 (20B17)에서 117 μg/ml의 낮은 IC50 값을 보였다. 갈조류의 70℃ 추출물의 IC50 값은 참가죽그물바탕말 (70B21), 참그물바탕말 (70B1), 큰잎모자반 (70B16), 블레기말 (70B12) 및 꽈배기모자반 (70B17)에서 각각 603, 500, 459, 436과 215 μg/ml이 IC50 값을 보였고 특히 감태 (70B26)에서 가장 낮은 IC50값 (40 μg/ml)을 보였다. 이는 감태 추출물이 정제되지 않은 것을 감안할 때 감태 추출이 시판되는 항산화제들과 비교하여 비슷하거나 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 보일 것으로 생각되어진다.
- 3과 4에 나타내었다. 납작파래 (20G6)의 20℃ 추출물에서는 약 60%의 가장 우수한 소거활성을 나타냈으며, 참홑파래 (20G11)에서는 약 49%의 DPPH 라디칼 소거활성을 보였다. 납작파래와 참홑파래를 제외한 다른 녹조류 추출물 (1 mg/ml)에서는 대체적으로 10% 미만의 낮은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다.
- 납작파래와 참홑파래를 제외한 다른 녹조류 추출물 (1 mg/ml)에서는 대체적으로 10% 미만의 낮은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다. 녹조류 70℃ 추출물에서는 청각 (70G1)과 구멍갈파래 (70G5)에서 약 40%의 DPPH 라디칼 소거활성만을 보였으며 다른 녹조류 70℃ 추출물에서는 30% 미만이 소거활성을 보였다. 허 등 [7]에 의해 녹조류 추출물이 갈조류 추출에 비해 total polyphenol 함량이 낮다고 보고되어지고 있는데 이런 polyphenol 성분은 hydroxyl group을 많이 가지고 있어 자유라디칼 소거활성이 높다고 보고되어지고 있다[5].
- 갈조류의 20℃ 추출물 (1 mg/ml)들 중에서는 꽈배기모자반 (20B17)에서 약 96%의 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 보였는데, 이 수치는 실험에 사용된 시판되는 항산화제들(100 μg/ml)과 비교했을 때 비슷하거나 높은 수치를 나타내었다. 불레기말 (20B12)에서도 60% 이상의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고 꽈배기모자반과 불레기말 추출물을 제외한 추출물들에서는 40% 미만의 낮은 소거활성을 나타내었다. 갈조류 70℃ 추출물에서도 꽈배기모자반 (70B17)에서 약 95% 소거활성을 보이며 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 참그물바탕말 (70B1), 큰잎모자반 (70B16), 감태 (70B26) 에서도 80% 이상의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내는 것을 확인하였다.
- 7과 8에 나타내었다. 홍조류의 20℃ 추출물에서는 왜떨기나무붉은실 (20R24)에서 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고 (약 95%), 갈래잎 (20R17), 굵은참우뭇가사리 (20R18), 부채분홍잎 (20R23) 에서도 약 94%의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었는데 이 값은 시판되는 항산화제 (100 μg/ml)들과 비교했을 때, 비슷하거나 더 우수한 소거활성을 나타내는 것이다. 70℃ 추출물의 경우에서도 왜떨기나무붉은실 (20R24)과 부채분홍잎 (70R23)에서 각각 98%와 94%의 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 혹돌잎(70R20)에서도 약 65%의 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내는 것을 확인하였다.
후속연구
- 홍조류 70℃ 추출물의 경우 흑돌잎 (70R20), 부채분홍잎 (70R23)과 왜떨기나무붉은실 (70R24)에서 각각 651, 94 및 61 μg/ml이 낮은 IC50 값을 보였으며 그 외의 추출물에서는 1000μg/ml 이상의 IC50 값을 보였다. 이와 같이 감태, 굵은 참우뭇가사리와 왜떨기붉은실 추출물에서 정제되지 않았음에도 50 μg/ml 미만이 낮은 IC50 값을 보였는데 이 추출물들을 이용하여 정제하게 되면 시판되는 항산화제들과 비슷한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타낼 것으로 생각되어지며 보다 안전한 천연항산화제 개발에 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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