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문제 정의
- 한편 항백에는 berberine 이외의 다양한 약리활성을 가지는 주요 구성성분인 palmatine, limonin 등이 있으며 이들에 대한 약물상호작용능에 대한 조사는 이루어진 바는 없다. 따라서 본 연구에서는 황백의 사용으로 인한 약물상호작용 발생 가능성을 예측하기 위하여, 황백을 구성하고 있는 주요 생리활성물질인 berberine, palmatine, limonin 및 rutaecarpine (Fig. 1)을 대상으로 인체 CYP2D6 효소 활성 및 p-glycoprotein 단백 활성 저해 효과를 평가하고자 하였다.
- 본 연구는 황백에 함유되어 있는 주요 화합물인 berberine, palmatine, limonin 및 rutaecarpine의 CYP2D6 및 p-glycoprotein 활성에 대한 저해정도를 탐색함으로써, 황백을 다른 양약과 병용시 약물상호작용을 유발할 수 있는 가능성을 평가하고자 하였다. 인체 간 마이크로좀 시료에 CYP2D6 동효소의 기질약물인 dextromethorphan과 NADPH 재생성계 및 저해제 (200 μM)를 첨가한 후 반응시켜 생성된 대사물을 LC/MS/MS를 이용하여 정량하여 CYP2D6 동효소 활성의 변화를 평가하였다.
제안 방법
- 24시간 배양 후에 berberine (2.5및 25 μM)과 calcein AM (0.5 μM)을 각 well에 처리하였다.
- 5 μM)을 각 well에 처리하였다. 24시간 후, triton-X-100으로 1시간동안 lysis시킨 후, multilabel plate reader (Victro3, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA)를 이용하여 calcein의 형광 (여기파장 485 nm, 방출파장 535 nm) 을 측정하였다. 또한 기존에 p-glycoprotein 단백 활성 억제 효과가 알려져있는 cyclosporin A (10 μM) 및 para-aminohippuric acid (1 mM)을 각각 positive 및 negative control로 사용하여 본 실험결과의 적합성을 검정하였다.
- CYP2D6 활성도 억제에 대한 연구는 dextromethorphan O-demethylation 에 의해 생성되는 dextrorphan의 생성 속도를 측정함으로써 평가하였다 [8]. 즉, dextromethorphan (5 μM) 만을 혹은 dextromethorphan과 함께 억제제로 황백의 주요 구성 화합물 (2 - 200 μM)을 같이 0.
- Dextrorphan 및 내부표준물질인 levallorphan을 분리하기 위해 Phenomenex사의 Gemini C18 컬럼 (50 ×2.0 mm, 5 μm)을 사용하였고, 이동상은 water : acetonitrile (60 : 40, v/v)에 0.1%의 formic acid를 첨가하여 사용하였다.
- 또한 기존에 p-glycoprotein 단백 활성 억제 효과가 알려져있는 cyclosporin A (10 μM) 및 para-aminohippuric acid (1 mM)을 각각 positive 및 negative control로 사용하여 본 실험결과의 적합성을 검정하였다.
- 인체 간 마이크로좀 시료에 CYP2D6 동효소의 기질약물인 dextromethorphan과 NADPH 재생성계 및 저해제 (200 μM)를 첨가한 후 반응시켜 생성된 대사물을 LC/MS/MS를 이용하여 정량하여 CYP2D6 동효소 활성의 변화를 평가하였다. 또한 약물수송단백인 p-glycoprotein의 활성은 L-MDR1 세포주를 이용한 calcein AM 축적 실험을 통하여 평가하였다. 그 결과 식물 알카로이드인 berberine에서 강력한 CYP2D6 활성 저해능을 관찰하였으며, 저해 효과는 농도 의존적으로 증가하였으며, mechanism-based 저해 기전을 나타내었다.
- 분석 물질의 정량을 위하여 MRM (multiple reaction monitoring) 정량모드를 이용하였고, dextrorphan 및 levallorphan의 선택질량으로서는 각각 m/z 258>157 및 284>157를 사용하였다.
- 4)에서 37℃에서 5 분간 배양하였다. 이 후 NADPH 재생성계 (3.3 mM glucose-6-phosphate, 1.3 mM NADP, 3.3 mM MgCl2 및 1.0 unit/ml glucose-6-phosphate dehydrogenase)를 첨가함으로써 반응을 시작하고, 30분 간의 반응 후 각 tube를 얼음위에 놓고 내부표준 물질로서 levallorphan (30 ng/ml)을 포함하고 있는 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 화합물의 mechanism-based 저해 기전 규명 실험에서는 기질을 넣기 전에 억제제와 마이크로솜, NADPH 재생성계를 함께 37℃에서 30 분간 반응시킨 후, 기질을 첨가하여 30분간 추가 배양하였다.
- 인체 간 마이크로좀 시료에 CYP2D6 동효소의 기질약물인 dextromethorphan과 NADPH 재생성계 및 저해제 (200 μM)를 첨가한 후 반응시켜 생성된 대사물을 LC/MS/MS를 이용하여 정량하여 CYP2D6 동효소 활성의 변화를 평가하였다.
- 2 ml/min 로 유지하였으며, 탠덤질량분석기 (API300 LC/MS/MS system, Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 검출하였다. 탠덤질량분석시 이온소스는 electrospray 방법 (positive mode)을 사용하였고, 이온화 전압은 5 kV, 탈용매화 온도는 400℃, 오리피스 및 링 전압은 각각 80 V 및 400 V로 조정하였다. 질소가스 흐름속도의 분무가스는 1.
- 항암제의 다약제내성 발현과 관련하여 가장 대표적인 약물수송단백의 하나인 p-glycoprotein (p-gp) 단백 활성의 기능에 대한 황백의 주요 구성 성분의 저해효과는 p-gp가 과발현된 세포주인 L-MDR1 세포주를 이용하여 탐색하였다 [14]. P-gp의 저해제로 알려져있는 cyclosporin A의 경우는 강력하게 p-gp의 기능을 저해하였고, 저해활성이 없는 para-aminohippuric acid는 p-gp 기능 저해능을 보이지 않는 것으로 나타나 (Fig.
대상 데이터
- Berberine, palmatine, limonin, rutaecarpine, phenacetine, levallorphan, dextromethorphan, dextrorphan, glu- cose 6-phosphate, NADP, glucose-6-phosphate de- hydrogenase, calcein AM, cyclosporine A, para-amino- hippuric acid 및 triton-X-100 는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Pooled human liv- er microsomes (H161)은 BD Gentest (Woburn, MA)에서 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Pooled human liv- er microsomes (H161)은 BD Gentest (Woburn, MA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 본 연구에 이용된 시약은 모두 실험에 이용 가능한 최상급을 구입하여 사용하였다.
- 기타 본 연구에 이용된 시약은 모두 실험에 이용 가능한 최상급을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 L-MDR1 세포주는 Schinkel 박사 (Netherland Cancer Institute, Amsterdam, Netherlands)로부터 분양받았다.
데이터처리
- CYP2D6 동효소에 특이한 기질 약물인 dextromethorphan으로 부터 대사체인 dextrorphan 생성에 대한 저해제의 CYP2D6 활성 억제에 대한 경수(IC50)는 약동학 분석 프로그램인 WinNonlin (Version 2.0, Pharsight, Apex)을 이용하여 비선형 최소자승 회귀분석법을 이용하여 산출하였다.
성능/효과
- 항암제의 다약제내성 발현과 관련하여 가장 대표적인 약물수송단백의 하나인 p-glycoprotein (p-gp) 단백 활성의 기능에 대한 황백의 주요 구성 성분의 저해효과는 p-gp가 과발현된 세포주인 L-MDR1 세포주를 이용하여 탐색하였다 [14]. P-gp의 저해제로 알려져있는 cyclosporin A의 경우는 강력하게 p-gp의 기능을 저해하였고, 저해활성이 없는 para-aminohippuric acid는 p-gp 기능 저해능을 보이지 않는 것으로 나타나 (Fig. 4), 본 연구에 사용한 세포주 시스템이 p-gp 기능 억제능을 평가하기에 적합한 시스템이라는 것을 확인할 수 있었다 [13]. 본 연구에서 평가한 황백을 구성하고 있는 4가지 주요 성분들은 p-gp의 기능에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
- 또한 약물수송단백인 p-glycoprotein의 활성은 L-MDR1 세포주를 이용한 calcein AM 축적 실험을 통하여 평가하였다. 그 결과 식물 알카로이드인 berberine에서 강력한 CYP2D6 활성 저해능을 관찰하였으며, 저해 효과는 농도 의존적으로 증가하였으며, mechanism-based 저해 기전을 나타내었다. 그러나 limonine과 rutaecarpine은 CYP2D6 저해 활성을 보이지 않았고, p-glycoprotein 기능에 대해서는 평가한 어떤 화합물도 저해 활성을 나타내지 않았다.
- 2). 또한 berberine과 palmatine은 농도 의존적으로 CYP2D6 활성을 저해하는 것으로 나타났다 (Fig. 3). Berberine의 CYP2D6 매개 dextromethorphan O-demethylation 활성 저해능은 (IC50 = 17.
- 4), 본 연구에 사용한 세포주 시스템이 p-gp 기능 억제능을 평가하기에 적합한 시스템이라는 것을 확인할 수 있었다 [13]. 본 연구에서 평가한 황백을 구성하고 있는 4가지 주요 성분들은 p-gp의 기능에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 상기의 연구 결과는 이들 물질이 약물수송단백의 하나인 p-gp에 대한 저해 효과가 없음을 의미하며, 따라서 p-gp 기능의 매개를 통한 약물상호작용 가능성은 없을 것으로 기대된다.
- 6 μM) 나타내는 것으로 보아, CYP2D6 활성의 저해에 있어 methylenedioxyphenyl 그룹이 중요하게 관여함을 알 수 있다. 상기의 연구 결과는 berberine이 in viro에서 강력한 CYP2D6 활성 저해능을 가지고 있음을 의미한다. 그러나 이의 임상적 중요성을 규명하기 위해서는 임상시험을 통하여 in vitro에서 나타난 CYP2D6 저해 효과를 검정할 필요가 있을 것이다.
- 5 μM) 이전에 보고된 CYP2D6 매개 bufuralol 1'-hydroxylation 저해능과 (IC50 = 45 μM) 유사하였다 [2]. 한편, CYP2D6활성 저해능에 대한 사전배양 (pre-incubation) 효과를 조사한 결과, palmatine과 달리 berberine은 NADPH 재성성계와의 사전 배양에 의해 CYP2D6활성을 6배 정도 더 강하게 저해하는 것을 알 수 있었다 (Table 1).
- 황백의 주요 구성 화합물인 berberine, palmatine, rutaecarpine 및 limonin의 CYP2D6 동효소 저해 활성을 평가한 결과, 200 μM 농도에서 berberine과 palmatine은 강력한 저해 활성 (> 70%)을 나타내었으나, limonine과 rutaecarpine은 CYP2D6 활성 저해 효과를 가지고 있지 않는 것으로 나타났다 (Fig. 2).
후속연구
- 상기의 연구 결과는 berberine이 in viro에서 강력한 CYP2D6 활성 저해능을 가지고 있음을 의미한다. 그러나 이의 임상적 중요성을 규명하기 위해서는 임상시험을 통하여 in vitro에서 나타난 CYP2D6 저해 효과를 검정할 필요가 있을 것이다.
- Chatterjee와 Franklin의 연구 결과에 의하면, berberine은 마이크로솜에 의해 대사되고, 이 대사체가 CYP와 공유결합을 형성하는 것으로 되어 있다 [2]. 따라서 berberine의 CYP2D6 활성 저해효과 역시 berberine이 가지고 있는 methylenedioxyphenyl 그룹에 기인할 것으로 기대된다. 한편 berberine과 구조적으로 유사하나, methylenedioxy 그룹을 가지고 있지 않는 palmatine의 경우, berberine에 비해 낮은 CYP2D6 저해 활성을 (IC50 = 111.
- 본 연구에서 평가한 황백을 구성하고 있는 4가지 주요 성분들은 p-gp의 기능에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 상기의 연구 결과는 이들 물질이 약물수송단백의 하나인 p-gp에 대한 저해 효과가 없음을 의미하며, 따라서 p-gp 기능의 매개를 통한 약물상호작용 가능성은 없을 것으로 기대된다.
- 최근 한 보고에 따르면 berberine이 cytochrome P450(CYP) 효소군 중에서 흔히 임상상에서 처방되는 정신과계 또는 심혈관계 약제의 대사에 주요하게 관여하는 것으로 알려져 있는 CYP2D6에 대한 활성 저해능을 가지는 것으로 소개된 바 있다 [5]. 이러한 결과로부터 berberine이 함유된 항백을 복용할 경우 병용되는 CYP2D6 기질약제와의 상호작용 가능성을 예상해 볼 수 있겠다. 한편 항백에는 berberine 이외의 다양한 약리활성을 가지는 주요 구성성분인 palmatine, limonin 등이 있으며 이들에 대한 약물상호작용능에 대한 조사는 이루어진 바는 없다.
- 황백의 주요 성분인 berberine의 CYP2D6 활성 저해능을 고려할 때, 황백을 CYP2D6 기질약제와 병용시 약물상호작용을 유발할 가능성을 보여준다. 이러한 황백의 CYP2D6를 매개로한 임상적인 약물상호작용 가능성은 임상시험을 통하여 추가적인 검정이 필요할 것으로 사료된다.
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