HPLC 및 HPLC/MS를 이용한 유자 씨앗 중 플라보노이드 및 리모노이드 화합물의 분석 Determination of Flavonoid and Limonoid Compounds in Citron (Citrus junos Sieb. et Tanaka) Seeds by HPLC and HPLC/MS원문보기
유자씨앗 중의 플라보노이드 및 리모노이드 화합물을 methanol 및 ethanol로 추출 HPLC로 정량한 결과 ethanol추출의 경우가 거의 모든 화합물에서 높게 나타났고 화합물의 종류도 더 많이 검출되었다. Limonin이 methanol 추출의 경우 140.34 mg/100g, ethanol 추출의 경우 170.98 mg/100g으로 개별화합물 중 가장 높은 함량을 나타내었고 그다음이 caffeic acid, naringin, lutin, nomilin 등의 순으로 높았다. HPLC/MS에 의하여 약42가지 화합물의 분자량 측정이 가능하였으며 mass spectrum과 extracted current ion chromatogram으로 분자량 측정이 가능하였다.
유자씨앗 중의 플라보노이드 및 리모노이드 화합물을 methanol 및 ethanol로 추출 HPLC로 정량한 결과 ethanol추출의 경우가 거의 모든 화합물에서 높게 나타났고 화합물의 종류도 더 많이 검출되었다. Limonin이 methanol 추출의 경우 140.34 mg/100g, ethanol 추출의 경우 170.98 mg/100g으로 개별화합물 중 가장 높은 함량을 나타내었고 그다음이 caffeic acid, naringin, lutin, nomilin 등의 순으로 높았다. HPLC/MS에 의하여 약42가지 화합물의 분자량 측정이 가능하였으며 mass spectrum과 extracted current ion chromatogram으로 분자량 측정이 가능하였다.
Flavonoid and limonoid compounds were determined by HPLC on the methanol and ethanol extracts from citron seeds. The quantities of the compounds in these categories were higher in the ethanol extract than methanol extract. The types of these compounds were detected in larger numbers in the ethanol e...
Flavonoid and limonoid compounds were determined by HPLC on the methanol and ethanol extracts from citron seeds. The quantities of the compounds in these categories were higher in the ethanol extract than methanol extract. The types of these compounds were detected in larger numbers in the ethanol extract. The content of limonin was the largest in both methanol and ethanol extract among the detectable compounds ; 140.34 mg/100g and 170.98 mg/100g, respectively, and the contents of other compounds, caffeic acid, naringin, lutin, nomilin, were found in large amount in this order. The molecular weights of forty two compounds in ethanol extract were determined with mass spectrums and extracted ion current chromatograms by HPLC/MS.
Flavonoid and limonoid compounds were determined by HPLC on the methanol and ethanol extracts from citron seeds. The quantities of the compounds in these categories were higher in the ethanol extract than methanol extract. The types of these compounds were detected in larger numbers in the ethanol extract. The content of limonin was the largest in both methanol and ethanol extract among the detectable compounds ; 140.34 mg/100g and 170.98 mg/100g, respectively, and the contents of other compounds, caffeic acid, naringin, lutin, nomilin, were found in large amount in this order. The molecular weights of forty two compounds in ethanol extract were determined with mass spectrums and extracted ion current chromatograms by HPLC/MS.
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문제 정의
본 연구는 유자씨앗을 이용한 천연식품 첨가물제조 및 항암물질 추출연구를 위한 기초조사로 수행되었다.
제안 방법
LC-ESI-MS는 HP-1100 HPLC(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA)에 장착된 Quattro LC triple quadrauple tandam mass spectrometer(Warers Co., Milford, MA)을 사용하였고 ion source온도는 70°C, capillary voltage는 3700 V, cone voltage는 30 V, gas온도는 200°C, nebulizer gas flow는 90 L/hr, desolvation gas flow는 646 L/hi■로 하여 분석 하였다. 분석 에 사용한 column과 용매, 용매구배 등은 HPLC를 이 용한 정량분석 시와 동일하게 수행하였으나 HPLC분석 시 용매에 첨가된 인산은 acetic acid로 대체하였다.
Ethanol 추출의 경우 약 48개의 peak를 얻을 수 있었다. 각 peak의 동정은 시료에 개별 표준품을 첨가하는 방법과 LC/MS spec- trum과 ion current chromatogram 등을 확인하여 동정 하였다.
표준물질의 머무름 시간으로 정성된 p-hydroxy benzoic acid오} gentistic acid는 HPLC/MS로 정성할 수가 없었고 나머지 표준물질로 정성된 peak들은 HPLC/MS에 의한 정성결과와 잘 일치하였다. 본 연구에서는 표준물질의 HPLC/MS spectrum을 얻어 시료의 spectrum과 비교하여 확인하지 않고 시료의 각 peak에 대한 HPLCMS spectrum 과 TIC의 각 peak의 extracted ion current chromatogram— 로 동정하였다. Fig.
, Miliford, MA)을 사용하였고 용매 조성 은 A: 3 mM phosphoric acid/(H2O 90-acetonitrile' 10), B: 3 mM phosphoric acid/CH^O 30:acetonitrile 70), C: 3 mM phosphoric acid/acetonitrile^- 하였다. 용매구배는 A: 100%, B: 0%, C: 0%로 시작하여 5 min에 A: 88%, B: 12%, C: 0%, 10 min에 A: 75%, B: 25%, C: 0%, 15 min에 A: 65%, B: 35%, C: 0%, 20 min에 A: 55%, B: 45%, C: 5%, 25 min에 A: 45%, B: 45%, C: 20%, 30 min에 A: 20%, B: 50%, C: 30%, 35 min에 A: 5%, B: 30%, C: 65%, 40 min에 A: 0%, B: 0%, C: 100%로 하여 분석하였다, 용매 흐름속도는 1.2 mL/min으로 하였고 column온도는 30°C로 고정 하여 분석 하였다. 표준품은 me比anol에 녹여 L25 mg/mL, 2.
사용하였다. 자몽씨앗은 시중에서 구입한 자몽으로부터 분리하여 유자씨앗과 같이 처리하여 분석하였다. 몇 가지 aromatic acid류 및 플라보노이드 표준품, 즉 p-hy- droxybenzoic acid, gentisic acid, vannilic acid, caffeic acid, syringic acid, chlorogenic acid, tannic acid, p-coumaric acid, coumarin(cinnamic acid), 7-amino-4-methyl coumaric acid, trans-coumaric acid(Z-cinnamic acid), perilic acid, coumarin 35, carvone, limonene, lutin, naringin, hesperidia, quercetin dihydrate, luteolin, naringenin, kaemferol, hes- peretin, flavone, flavanone, 리 모노이 드 표준품인 limonin과 nomilin 그리고 HPLC 분석용매 acetonitrile 등은 Sigma사 (St.
지방을 추출하고 남은 잔사를 50°C 에서 건조하여 r「hexane을 제거 후 추출 용매 (in여:hanol, ethanol)를 잔사의 5배 량을 가하여 으¥ 5시간 역류 증류한 후 여 과하였다. 잔사를 동일 추출용매로 잘세척하여 여액과 합하여 100 mL로 정용하여 HPLC와 HPLC/NS를 이 용한 플라보노이 드 및 리 모노이 드 화합물의 정량 및 정성 분석에 이용하였다.
방법을 변형하여 다음과 같이 수행하였다. 즉 유자 씨앗 및 자몽씨앗 각 IQ g씩을 믹서기 에 넣고 n-hexa眼을 씨앗 무게의 2배량을 가하여 약 30분간 간 후 여과하여 여액을 모으고 잔사에 다시 n나lexane을 가하여 위 와 같은 방법으로 3회 더 반복하여 씨앗 중 지방을 추출하였다. 지방을 추출하고 남은 잔사를 50°C 에서 건조하여 r「hexane을 제거 후 추출 용매 (in여:hanol, ethanol)를 잔사의 5배 량을 가하여 으¥ 5시간 역류 증류한 후 여 과하였다.
플라보노이드 및 리모노이드 추출은 Ohta와 Hasegawa (14)의 방법을 변형하여 다음과 같이 수행하였다. 즉 유자 씨앗 및 자몽씨앗 각 IQ g씩을 믹서기 에 넣고 n-hexa眼을 씨앗 무게의 2배량을 가하여 약 30분간 간 후 여과하여 여액을 모으고 잔사에 다시 n나lexane을 가하여 위 와 같은 방법으로 3회 더 반복하여 씨앗 중 지방을 추출하였다.
자몽씨앗은 시중에서 구입한 자몽으로부터 분리하여 유자씨앗과 같이 처리하여 분석하였다. 몇 가지 aromatic acid류 및 플라보노이드 표준품, 즉 p-hy- droxybenzoic acid, gentisic acid, vannilic acid, caffeic acid, syringic acid, chlorogenic acid, tannic acid, p-coumaric acid, coumarin(cinnamic acid), 7-amino-4-methyl coumaric acid, trans-coumaric acid(Z-cinnamic acid), perilic acid, coumarin 35, carvone, limonene, lutin, naringin, hesperidia, quercetin dihydrate, luteolin, naringenin, kaemferol, hes- peretin, flavone, flavanone, 리 모노이 드 표준품인 limonin과 nomilin 그리고 HPLC 분석용매 acetonitrile 등은 Sigma사 (St. Louis, USA)로부터 구입 하여 사용하였다. 그 외 분석 시약은 특급시약을 사용하였다.
본 실험에 사용한 유자씨앗은 경남 거제 일원에서 수확되는 유자로 유자청 제조 시 부산물로 나오는 유자씨 앗을 물로 잘 세척한 후 이를 그늘에서 말려 수분함량을 5%정도로 조절하여 사용하였다. 자몽씨앗은 시중에서 구입한 자몽으로부터 분리하여 유자씨앗과 같이 처리하여 분석하였다.
성능/효과
98 mg/100g으로 개별화합물 중 가장 높은 함량을 나타내 었고 그 다음이 caffeic acid, naringin, lutin, nomilin 등의 순으로 높았다. HPLC/MS에 의 하여 약 42가지 화합물의 분자량 측정이 가능하였으며 mass spectrum과 extracted current ion chro- matogram으로 분자량 측정이 가능하였다.
더 많이 검출되 었다. Limonin이 methanol 추출의 경우 140.34 mg/100 g, ethanol 추출의 경우 170.98 mg/100g으로 개별화합물 중 가장 높은 함량을 나타내 었고 그 다음이 caffeic acid, naringin, lutin, nomilin 등의 순으로 높았다. HPLC/MS에 의 하여 약 42가지 화합물의 분자량 측정이 가능하였으며 mass spectrum과 extracted current ion chro- matogram으로 분자량 측정이 가능하였다.
98 mg/100 g로 나타났고 그 다음이 caffeic acid, naringin, lutin, nomilin 등의 순으로 나타났다. Methanol이 나 ethanol 추출 시 모두 자몽씨 앗에 비 하여 거 의 모든 화합물이 상당히 높게 나타났고 특히 플라보노이드(lutin, naringin, narin genin, hesperetin) 및 리 모노이 드(limonon, nomilin)의 함량은 월등히 높게 나타났다.
특히 lutin, hesperidin, naringenin, limonin 등이 높게 나타났고 quercetin dihyrate, luteolin, coumarin, flavone, flavanone, coumarin 35 등은 methanol추출 시는 없었으나 ethanol추출 시 상당량 추출되었다. 추출 용매 에 관계 없이 가장 높은 함량을 보인 것은 limonin으로 methanol 추출시 140.34 mg/100 g, ethanol 추출 시 에 170.98 mg/100 g로 나타났고 그 다음이 caffeic acid, naringin, lutin, nomilin 등의 순으로 나타났다. Methanol이 나 ethanol 추출 시 모두 자몽씨 앗에 비 하여 거 의 모든 화합물이 상당히 높게 나타났고 특히 플라보노이드(lutin, naringin, narin genin, hesperetin) 및 리 모노이 드(limonon, nomilin)의 함량은 월등히 높게 나타났다.
후속연구
자몽은 씨앗이 전체과일의 2% 정도에 불과하지만 우리나라에서 생산되는 유자는 씨앗이 전체의 10〜15%로 자몽에 비하여 5배 이상의 씨앗을 함유하고 있으나 적절한 이용방법이 개발되지 않아 매년 다량의 씨앗 이유 자청을 만드는 과정에서 폐기되고 있다. 우리나라 식품공전에 천연물 식품첨가물로 자몽씨앗 추출물이 들어있다 이물질이 매년 항산화제 식품첨가물로 다량 수입되는 점을 감안할 때 우리나라 유자씨 앗을 이용한 식품첨가물개발은 시급하다 할 것이며 유자씨앗에 들어 있는 생리활성물질의 추출이용 또한 앞으로 중요한 연구과제가 될 수 있을 것이다. 이러한 연구 개발은서구의 자몽에 대한 개발에 비하여 훨씬 경쟁력이 있을 것으로 판단된다.
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