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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 더덕의 마크로파지 활성 효과를 평가 하고, 발효유에 첨가할 경우 젖산균 성장에 미치는 영향에 대하여 실시하였다.
- 이에 본 연구에서는 더덕의 마크로파지 활성 효과를 평가 하고, 발효유에 첨가할 경우 젖산균 성장에 미치는 영향에 대하여 실시하였다.
가설 설정
- 2) Values are mean±S.D., n=3.
제안 방법
- 5%. 1.0%, 2% 수준으로 첨가 하여 멸균한 다음 상업용 젖산균 5종을 희석하여 각각 배지 에 104 CFU/mL 되게 접종하였다. 37℃에서 3시간 간격으로 배양하면서 O.
- 0%, 2% 수준으로 첨가 하여 멸균한 다음 상업용 젖산균 5종을 희석하여 각각 배지 에 104 CFU/mL 되게 접종하였다. 37℃에서 3시간 간격으로 배양하면서 O.D값(620 nm)과 pH를 측정하였다. 이때 O.
- 건조된 더덕을 중량비로 1 : 5로 가수하여 heating mantle 에서 환류냉각관을 부착하여 3시간 동안 추출하여 여과포로 여과(Brix측정)한 후 여액 1 g을 해사 15 g이 있는 항량 캔에 넣어 105C에서 항량이 될 때까지 측정하였고 전체 중량만큼 을 환산하여 곱해 주었다.
- 더덕 추출물이 젖산균 생육에 미치는 영향을 조사하기 위해서 더덕 추출물을 건물 기준으로 0%, 0.5%, 1%, 2%의 수 준으로 MRS 배지에 첨가하여, 5종의 젖산균을 접종한 후 O.D값과 pH를 측정한 결과는 Fig. 1과 Table 3과 같다.
- 시료 11 g을 무균적으로 채취하여 99 mL 펩톤 용액에 넣 어 7초 동안 30 cm 간격으로 25회 세게 흔들어 준 후 십진법 으로 희석하고 BCP(Bromocresol purple) 평판측정용 배지에 희석시료를 넣어 35℃에서 48시간 배양한 다음 발생한 황색 의 집락을 젖산균의 집락으로 계측하였다.
- 배양한 plate를 세척용 완충액으로 다시 5회 세척하고 HRP-conjugated anti-mTNF를 100L씩 넣어 25℃에서 30분 배양한 다음 세척용 완충액으로 5회 세척하였다. 여기에 기질(3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine)을 100/zL 첨가하여 25℃ 에서 30분간 발색반응을 시킨 후 1.0N sulfuric acid를 100 L씩 가해 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선에서 TNF-ff 함량을 계산하였다.
- 3까지 배양하였다. 여기에 더덕 추출액을 10%(w/w) 첨가하여 호상발효유 를 제조한 다음 5℃와 10℃에서 18일간 저장하면서 젖산균 수를 측정하였다.
- 여기에 발색 기질 용액(3, 3, , 5, 5'-tetramethyl benzidine)을 100 L 첨가하여 25℃에서 30분간 발색 반 응을 시킨 후 LON sulfuric acid를 100/zL씩 가해 반응을 정 지시켰다. 이것을 ELISA reader(Molecular device, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선에서 IL-la 함량을 계산하였다.
- 7(2xl05/well) 100L와 시료 20L를 96-well plate에 넣어 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 동안 배 양한 후 상징액을 취해 대식세포가 분비하는 Interleuldn-1 a (IL-1 a)을 enzyme-linked immuno-sorbent assay(ELISA)를 이용하여 측정하였다. 즉, anti-mIL-1 a 단일 클론 항체가 코팅된 microtiter platefMouse IL-1 a ELISA, Pierce Endogen, USA) 에 항체의 비 특이적인 반응을 방지하기 위하여 blocking 시약(3% BSA용액, w/v)을 가한 다음 Tween 20이 0.05%(v/v) 함유된 0.0IM PBS(PBST, pH 7.4) 세척용 완충액 으로 3회 세척하였다. 세척한 plate에 biotinylated anti-mIL-1 a 항체를 50“L씩 넣고, 표준 IL-1 a 또는 배양한 시료액을 50L씩 well에 주입하고, 25C에서 2시간 배양하였다.
- D 값은 증류수로 4배 희석하여 spectrophotometer(CEC/L, CE 4004, England)3. 측정하였으며, pH는 pH meter (Coming model 440, USA)로 측정하였다.
대상 데이터
- 이때 ELISA reader(Molecular Device, USA) 로 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. NO의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 시중 유업체에서 발효유에 사용 하는 상업용 균주로서 ABT-L(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus구성된 혼합균주, Groupe Rhone-poulence, USA), ABT~C(Lactoba- cillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus구성된 혼합균주, Groupe Rhone-poulence, USA) 와 ABT-L 및 ABT-C 혼합균주에 사용된 단일균주인 Lactobacillus acidophiluse Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus 등 5 종의 동결 건조된 균주를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 더덕은 서울 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
- 세포 배양 실험에 이용된 cell line인 RAW264.7(monocyte; macrophage, mouse)은 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다.
- 세포 배양시 사용된 배지는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, with or without phenol red, Gibco)을 사용하였다. 배양 플라스크, 피펫, microplate (96-well) 등은 멸균된 제품들을 이용하였으며, 배양병 등 초자 기구들은 autoclave 에서 121℃, 15 1b에서 15분간 가압 멸균한 후 사용하였다.
데이터처리
- 통계분석은 SAS program(1996)의 GLM(General Linear Model) Procedure를 통하여 분석하였고, 처리구간의 평균간 비교는 Dmcan의 다중검정방법으로 5% 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- RAW264.7(2xl05/well) 100L와 시료 20L를 96-well plate에 넣어 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 동안 배 양한 후 상징액을 취해 대식세포가 분비하는 Interleuldn-1 a (IL-1 a)을 enzyme-linked immuno-sorbent assay(ELISA)를 이용하여 측정하였다. 즉, anti-mIL-1 a 단일 클론 항체가 코팅된 microtiter platefMouse IL-1 a ELISA, Pierce Endogen, USA) 에 항체의 비 특이적인 반응을 방지하기 위하여 blocking 시약(3% BSA용액, w/v)을 가한 다음 Tween 20이 0.
- 7(2xl05/well) 100 L를 넣고 48시간 동안 CO2 incubator에서 37℃를 유지하면 서 배양하였다. 배양액 중의 NO 농도는 microplate assay를 이용하여 측정하였다. 먼저 48시간 동안 배양한 후 상징액50L aliquots를 취하여 같은 용량의 Griess 시약 (1% sulfanilamide/0.
성능/효과
- Streptococcus thennophihis는 더덕을 첨가하지 않은 대조구 에서 6시간 이후 지수성장기를 보였으나 더덕을 첨가한 처리구는 첨가량이 증가할수록 성장이 억제되었다. Lactobacillus acidophilhis는 12시간 이후 지수성장기를 보였으나, 더 덕 첨가구는 첨가량에 상관없이 성장이 억제되는 것으로 보 아 0.5%에서도 성장 억제에 영향을 미치는 것으로 나타났다. Bifidobacterium longume 15시간 이후 지수성장기를 보였으 나, Lactobacillus acidophillus와 같은 경향을 보였다.
- Streptococcus thennophihis는 더덕을 첨가하지 않은 대조구 에서 6시간 이후 지수성장기를 보였으나 더덕을 첨가한 처리구는 첨가량이 증가할수록 성장이 억제되었다. Lactobacillus acidophilhis는 12시간 이후 지수성장기를 보였으나, 더 덕 첨가구는 첨가량에 상관없이 성장이 억제되는 것으로 보 아 0.
- 대조구의 TNF-a 농도는 32.42 pg/mL이었으나 열수 더덕 추출액의 농도 1 ~100 g/mL에서는 검출되지 않았다. 그러나 시료농도 1,000 g/mL에서는 2, 450 pg/mL 이상으로 유 의하게(p<0.
- 마크로파지 활성은 더덕 알콜 추출물 보다 열수 추출물이 더 높았다. 더덕 열수 추출물이 젖산균 에 미치는 영향을 조사한 결과, 더덕 첨가량이 증가할수록 젖산균 성장이 억제되었고, pH는 완만히 감소됨에 따라 발효 유에 더덕 열수 추출물을 첨가할 경우 Set type보다는 Stirred type 이나 Drink type 으로 해야 발효유 제조에 적 합할 것으로 보인다.
- Suh(1996)는 더덕 물 추출물이 면역 세포에 미치는 영향에 관한 연구보고에서 마우스에 경구투 여한 경우 흉선세포의 증식을 촉진하였으나, 흉선세포에 직접 처리한 경우는 그다지 영향을 주지 않았다고 하였다. 또한 Th 세포가 활성화되었으며 복강 마크로파지의 NO 생성 이 억제되었고, 사람 PMN 세포의 식작용을 증가시켜 생체 내에서 면역작용을 증강시킬 수 있음을 시사하였다.
- 05) 증가하였다. 반면 70% 알콜 추출물에서는 열수 추출물과는 달리 첨가농도가 lg/mL 이 상에서 검출되었고, 첨가농도가 증가할수록 더 많은 NO를 생산하였지만 1,000 g/mL 농도에서는 열수 추출물보다 분 비능이 약간 낮은 결과를 보였다.
- 이러한 결과는 더덕 첨가량이 증가할수록 젖산균 성장이 억제되었고, pH는 완만히 감소됨에 따라 발효유에 더덕 열수 추출물을 첨가할 경우 Set type보다는 Stirrd type 이나 Drink type으로 해야 발효유 제조에 적합할 것으로 보인다. 이는 컵 충전기에 더덕 추출물과 배 양할 원료유를 미리 넣은 다음 젖 산균 스타터를 접종, 배양시키는 Set type의 경우 더덕 추출 물이 젖산균의 성장을 억제하므로, 미리 원료유에 젖산균을 접종하여 배양탱크에 넣고 배양한 후 더덕 추출물을 별도로 넣고 혼합하는 방식 인 Stirred type이나 Drink type으로 해야 젖산균 성장에 영향을 받지 않을 것으로 사료된다.
- 표의 결과를 보면 18일간 5에서는 무첨가군이 8.6 X 108 CFU/mL 이상, 더덕 추출물 첨가군이 1.0 X 109 CFU/mL 이 상이었고, 10에서는 무첨가군이 8.0 X 108 CFU/mL 이상, 더덕추출물 첨가군이 6.8 X 108 CFU/mL 이상으로 나타나 각 저장온도에서 유통기한 내에 축산물의 가공기준 및 성분규 격(2005)에서 정한 젖산균 수 이상으로 안정하게 유지할 수 있는 것으로 나타났다.
- Bifidobacterium longume 15시간 이후 지수성장기를 보였으 나, Lactobacillus acidophillus와 같은 경향을 보였다. 혼합균 주를 보면, ABT-Le 12시간 이후에 지수성장기를 보인 반 면, ABT-C는 6시간 이후로서 ABT-C가 균 성장속도가 빠른 것으로 나타났다. 그러나 더덕 처리구에서는 ABT-L이 약간 ABT-C보다 성장이 높은 결과를 얻었다.
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