율무, 홍화, 아욱종자의 혈전용해 효소활성 및 감마선 조사의 영향 Fibrinolytic Activities and Effects of Gamma-Irradiated on Seeds from Coix lacryma-jobi L. Carthamus tinctorius L. and Malva verticillata L.원문보기
미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해 활성을 조사하였다. 각각의 식물들로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin 평판법으로 확인한 결과 피브린 응집을 효과적으로 분해하였다. 그 중 율무종자의 수용성 추출물의 혈전용해 활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.3배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 50-75% 에탄올을 이용하여 농축하였으며 율무의 혈전용해효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하고 직접 추출하였다. SDS-PAGE에 의하여 추출효소의 분자량을 측정한 결과 7.8 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 효소 활성에 미치는 온도의 효과는 $50^{\circ}C$ 이상에서는 비교적 안정하였으나 더 낮은 온도에서는 급격히 효소활성이 감소하였다. 또한, 각종 단백질분해효소 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 APMSF, PMSF, pepstatin A 그리고 TPCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 추출효소는 chymotrypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EGTA와 EDTA 처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않았다. 더욱이, 종자저장 중에 미생물에 의한 부패, 활력저하, 생리활성물질의 감소와 장기저장에 따른 에너지소비 증가 등이 문제가 되고 있어 저선량의 감마선 조사를 통해 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 혈전용해 효소활성에 미치는 효과 및 선량에 따른 차이를 조사하였는데 비조사 종자인 대조구와 비교하여 1 Gy, 4 Gy, 16 Gy, 32 Gy선량에서는 낮은 활성을 보였으면 반면에 8 Gy와 64 Gy의 선량에서는 더 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Y선 조사가 종자의 혈전용해 활성을 향상시킬 가능성이 있을 것으로 생각된다. 이상의 모든 결과로 볼 때 율무의 추출 효소는 chymotrypsin-like serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.
미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해 활성을 조사하였다. 각각의 식물들로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin 평판법으로 확인한 결과 피브린 응집을 효과적으로 분해하였다. 그 중 율무종자의 수용성 추출물의 혈전용해 활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.3배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 50-75% 에탄올을 이용하여 농축하였으며 율무의 혈전용해효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하고 직접 추출하였다. SDS-PAGE에 의하여 추출효소의 분자량을 측정한 결과 7.8 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 효소 활성에 미치는 온도의 효과는 $50^{\circ}C$ 이상에서는 비교적 안정하였으나 더 낮은 온도에서는 급격히 효소활성이 감소하였다. 또한, 각종 단백질분해효소 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 APMSF, PMSF, pepstatin A 그리고 TPCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 추출효소는 chymotrypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EGTA와 EDTA 처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않았다. 더욱이, 종자저장 중에 미생물에 의한 부패, 활력저하, 생리활성물질의 감소와 장기저장에 따른 에너지소비 증가 등이 문제가 되고 있어 저선량의 감마선 조사를 통해 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 혈전용해 효소활성에 미치는 효과 및 선량에 따른 차이를 조사하였는데 비조사 종자인 대조구와 비교하여 1 Gy, 4 Gy, 16 Gy, 32 Gy선량에서는 낮은 활성을 보였으면 반면에 8 Gy와 64 Gy의 선량에서는 더 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Y선 조사가 종자의 혈전용해 활성을 향상시킬 가능성이 있을 것으로 생각된다. 이상의 모든 결과로 볼 때 율무의 추출 효소는 chymotrypsin-like serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.
The fibrinolytic activities of soluble proteins extracted from seeds of Coix lacryma-jobi L., Carthamus tinctorius L. and Malva venicillata L. were studied. Fibrinolytic activity of extract from C. lacryma-jobi L. showed 1.3 times higher than plasmin used as positive control. The fibrinolytic enzyme...
The fibrinolytic activities of soluble proteins extracted from seeds of Coix lacryma-jobi L., Carthamus tinctorius L. and Malva venicillata L. were studied. Fibrinolytic activity of extract from C. lacryma-jobi L. showed 1.3 times higher than plasmin used as positive control. The fibrinolytic enzyme was confirmed and extracted directly from seed of C. lacryma-jobi L. by a fibrin zymography. The protein was composed of a single polypeptide and its apparent molecular weight was found to be 7.8 kDa, as judged by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The effect of temperature for the proteolytic enzyme activity were stabilized above $50^{\circ}C$ and then dramatically decreased. Also, the enzyme activity was clearly inhibited by APMSF, PMSF and TPCK, suggesting that it is a member of the chymotrypsin-like serine pretense. In addition, effects of gamma-irradiated on seed of each plants were revealed that 8 Gy and 64 Gy were higher than others. This result shown that gamma-irradiation of seeds were capable to increase the fibrinolytic activity. All these results suggest the pretense is a fibrinolytic enzyme belong to a family of chymotrypsin-like serine pretense.
The fibrinolytic activities of soluble proteins extracted from seeds of Coix lacryma-jobi L., Carthamus tinctorius L. and Malva venicillata L. were studied. Fibrinolytic activity of extract from C. lacryma-jobi L. showed 1.3 times higher than plasmin used as positive control. The fibrinolytic enzyme was confirmed and extracted directly from seed of C. lacryma-jobi L. by a fibrin zymography. The protein was composed of a single polypeptide and its apparent molecular weight was found to be 7.8 kDa, as judged by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The effect of temperature for the proteolytic enzyme activity were stabilized above $50^{\circ}C$ and then dramatically decreased. Also, the enzyme activity was clearly inhibited by APMSF, PMSF and TPCK, suggesting that it is a member of the chymotrypsin-like serine pretense. In addition, effects of gamma-irradiated on seed of each plants were revealed that 8 Gy and 64 Gy were higher than others. This result shown that gamma-irradiation of seeds were capable to increase the fibrinolytic activity. All these results suggest the pretense is a fibrinolytic enzyme belong to a family of chymotrypsin-like serine pretense.
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문제 정의
따라서 본 연구는 식물에서 새로운 혈전용해 효소개발을 위한 기초 연구로 율무 (Coix lacryma-jobi L.), 홍화(Carthamus tinctorius L.), 아욱 (Mal.,a verticillata L.)의 종자로부터 혈전용해효소 생산성를 조사하고 직접 추출하여 혈전용해 효소의 활성과 부분적인 특성을 조사하고 저선량의 감마선 조사가 혈전용해 효소의 활성에 미치는 영향을 조사하였다.
미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해 활성을 조사하였다. 각각의 식물들로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin 평판법으로 확인한 결과 피브린 응집을 효과적으로 분해하였다.
제안 방법
각종 protease 저해제에 의한 영향: APMSF, PMSF, TLCK, TPCK, EDTA, EGTA, aprotinin, 그리고 pepstatin A등 protease 저해제을 첨가하여 단백질 분해활성을 비교하여 Table 2에 나타내었다. APMSF, PMSF, TLCK 및 TPCK는 serine protease inhibitor (세린계 단백질 분해효소 저해제)이고 그 중 TLCK는 trypsin-like serine protease inhibitor (트립신유사 세린계 단백질 분해효소 저해저]) 그리고 TPCK는 chymotrypsin-like serine protease inhibitor (키모트립신 유사세린계 단백질 분해효소 저해제) 로 알려져 있으며, aprotinine trypsin-like serine protease inhibit。!.
각종 저해제의 영향: 일반적인 단백질분해효소 저해제로 알려진 APMSF, PMSF, TLCK, TPCK, EDTA, EGTA, aprotinin, pepstatin A등을 1~5 mM의 농도로 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)용액으로 제조한 다음 추출효소를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 효소활성을 측정하여 활성을 비교하였다.
감마선 조사가 혈전용해 효소활성에 미치는 영향
종자저장 중에 미생물에 의한 부패, 활력저하, 생리활성 물질의 감소와 장기저장에 따른 에너지 소비 증가 등이 문제가 되고 있어 저선량의 감마선 조사를 통해 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 혈전용해 효소활성에 미치는 효과 및 선량에 따른 차이를 조사하였다. 저선량 방사선 조사는 한국원자력연구소의 저준위 조사시설 Leo)을 이용하여 0, 1, 4, 8, 16, 32 그리고 64 Gray의 Y선을 실온에서 건조 종자에 직접 조사하였다.
1 ㎖의 100 NIH U/㎖의 thrombin 용액을 첨가하여 잘 혼합한 다음, 동일한 완충용액으로 만든 2% agarose 용액을 5 i戒첨가하여 다시 잘 혼합하고 페트리 디쉬에 부어 상온에 30분간 방치하여 피브린 응집을 형성시켜 fibrin 평판을 제조한다. 그리고 나서 구멍을 뚫어 10 ㎖의 각각의 시료를 떨어뜨린 후 37℃에서 18시간 반응시키고 난 다음 형성된 투명환의 직경을 표준시료인 plasmin과 비교하여 측정하였다.
4)에 상온에서 30분간 고정한 다음 증류수로 세척하고 다시 효소반응 완충용액에 넣어 37℃에서 12시간 반응한 다음 염색하고 탈색하여 확인하였다. 그리고 혈전용해효소에 해당하는 부분의 단백질을 추출하여 효소의 부분적 특성을 조사하였다.
단백질 분해 활성: 모든 실험과정은 4℃에서 수행하였으며, 율무, 홍화 그리고 아욱의 종자 10 g을 40 ㎖의 25 mM 인산 완충용액 (pH 7.4)을 첨가하여 분쇄하고 균질화한 후, 6500 rpm 4℃에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 회수하였다. 상층액 중의 이물질을 제거한 후, 50%의 에탄올 농도로 적정하여 1시간 동안 4℃에서 교반한 다음 원심분리 하여 상층액을 회수한 다음 100%의 에탄올을 조금씩 가하여 최종적으로 에탄올 농도를 75%로 적정하여 1시간동안 원심분리 하였다.
단백질분해 효소활성: 단백질 분해활성은 azocasein (아조카제인)이 분해되어 나오는 azo기의 양을 측정함으로서 단백질 분해 활성을 판정하는 azocasein 법(53)을 약간 변형하여 사용하였다. 즉, 1% azocasein (50 mM Tris-HCl, 0.
이는 율무의 혈전용해 효소는 피브린 응집에 직접적으로 작용하는 혈전용해 효소인데 반하여 홍화와 아욱의 혈전용해 활성은 t-PA나 urokinase 같은 피브린응집에 간접적으로 작용하는 효소일 것으로 생각된다. 따라서 율무의 혈전용해 효소를 직접 gel로부터 추출하여 단일효소임을 확인하고 활성염색을 실시하여 율무에서 추출된 혈전용해 효소의 부분적인 특성을 조사하였다.
4)을 첨가하여 분쇄하고 균질화한 후, 6500 rpm 4℃에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 회수하였다. 상층액 중의 이물질을 제거한 후, 50%의 에탄올 농도로 적정하여 1시간 동안 4℃에서 교반한 다음 원심분리 하여 상층액을 회수한 다음 100%의 에탄올을 조금씩 가하여 최종적으로 에탄올 농도를 75%로 적정하여 1시간동안 원심분리 하였다. 그리하여 형성된 침전물을 25 mM 인산 완충용액 (pH 7.
율무, 홍화 그리고 아욱의 종자 10 g을 40 ㎖의 25 mM 인산 완충용액 (pH 7.4)을 첨가하여 4℃에서 막자사발로 분쇄하여 균질화한 후, 6500 rpm 4℃에서 30분간 원심분리한 다음 상층액을 회수하였다. 상층액 중의 이물질을 제거하기 위해 거즈를 이용해 여과한 후, -70℃로 처리된 100%의 에탄올을 조금씩 가하여 최종적으로 50%의 에탄올 농도로 적정하여 1시간 동안 4P에서 교반한 다음 6500 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 하여 상충액을 회수하였다.
선량에 따른 차이를 조사하였다. 저선량 방사선 조사는 한국원자력연구소의 저준위 조사시설 Leo)을 이용하여 0, 1, 4, 8, 16, 32 그리고 64 Gray의 Y선을 실온에서 건조 종자에 직접 조사하였다.
전기영동 분석: 단백질의 전기영동은 12% gel을 이용하여 Laemmli 방법(56)을 약간 변형하여 수행하였으며, native polyacrylamide gel electrophoresis (비변성 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동)은 10% gel을 이용하여 수행하였다. 혈 전용해효소의 분자량은 표준단백질을 이용하여 상대적인 이동도인 Rf 값과 분자량의 semi-logarithmic plot에 의하여 결정하였으며 단백질은 Coomassie brilliant Blue R-250으로 염색하였고, 5% 메탄올과 7.
3배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 50-75% 에탄올을 이용하여 농축하였으며 율무의 혈전용해효소는 fibrin zymography 를 수행하여 확인하고 직접 추출하였다. SDS-PAGE에 의하여 추출효소의 분자량을 측정한 결과 7.
종자저장 중에 미생물에 의한 부패, 활력저하, 생리활성 물질의 감소와 장기저장에 따른 에너지 소비 증가 등이 문제가 되고 있어 저선량의 감마선 조사를 통해 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 혈전용해 효소활성에 미치는 효과 및 선량에 따른 차이를 조사하였다. 저선량 방사선 조사는 한국원자력연구소의 저준위 조사시설 Leo)을 이용하여 0, 1, 4, 8, 16, 32 그리고 64 Gray의 Y선을 실온에서 건조 종자에 직접 조사하였다.
하여 측정하였다. 즉, 25 mM 인산 완충용액 (pH 7.4)로 fibrinogen의 최종농도가 0.5%가 되도록 완전히 용해한 다음, 그 용액 5 ㎖에 0.1 ㎖의 100 NIH U/㎖의 thrombin 용액을 첨가하여 잘 혼합한 다음, 동일한 완충용액으로 만든 2% agarose 용액을 5 i戒첨가하여 다시 잘 혼합하고 페트리 디쉬에 부어 상온에 30분간 방치하여 피브린 응집을 형성시켜 fibrin 평판을 제조한다. 그리고 나서 구멍을 뚫어 10 ㎖의 각각의 시료를 떨어뜨린 후 37℃에서 18시간 반응시키고 난 다음 형성된 투명환의 직경을 표준시료인 plasmin과 비교하여 측정하였다.
최적온도 및 온도안정성: 온도에 따른 효소의 활성도 변화를 알아보기 위하여 3(rc에서 80℃까지 HTC의 간격으로 각각 온도별로 1시간 반응시킨 후 azocasein 법과 fibrin 평판법을 수행하여 각각의 온도에 의한 단백질분해효소와 혈전용해효소의 활성변화를 측정하여 온도에 대한 효소의 안정성을 조사하였다.
수행하였다. 혈 전용해효소의 분자량은 표준단백질을 이용하여 상대적인 이동도인 Rf 값과 분자량의 semi-logarithmic plot에 의하여 결정하였으며 단백질은 Coomassie brilliant Blue R-250으로 염색하였고, 5% 메탄올과 7.5% 초산의 용액으로 탈색하였다.
혈전분해 효소활성: 각각의 율무, 홍화, 아욱의 종자 추출물에 대한 혈전분해 활성은 fibrin 평판을 이용하여 각각의 추출물에 의하여 투명환을 형성함으로써 혈전용해 활성을 확인할 수 있었헜으며, 기존의 혈전용해제인 plasmin을 양성 대조구로 그 활성을 비교하였다. Fig.
혈전용해 효소활성: 혈전용해 효소활성의 측정은 fibrin 평판법(54)을 약간 변형하여 혈전용해 효소인 plasmin을 표준시료로 하여 측정하였다. 즉, 25 mM 인산 완충용액 (pH 7.
이론/모형
Fibrin zymography. Fibrin zymography는 Kim 등(7) 방법에 의하여 수행하였다. 즉, 0.
단백질 정량은 Bradford방법(55)에 의해 단백질 정량 Kit(Bio-Rad, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였으며 표준시료로는 Bovine serum albumim (BSA)를 사용하였다.
성능/효과
양성 대조구로 그 활성을 비교하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 대조구로 사용한 정제된 혈전용해 효소인 plasmin과 비교하였을 때 율무에서 약 2.2배의 높은 활성을 나타내었으며, 홍화와 아욱의 효소 활성은 plasmin과 비교 하였을 때 상대적으로 그 활성이 낮게 나타났다. 또한 율무의 효소 활성은 홍화와 아욱의 효소 활성에 비하여 상대적으로 약 2.
SDS-PAGE 및 fibrin zymography: 전체 수용성 단백질에서 혈전용해 효소를 확인하고, 분리하기 위하여 율무, 홍화 그리고 아욱의 종자 농죽 주출물로부터 native PAGE (비환원 SDS-PAGE)를 행하고 fibrin zymography를 수행한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 율무에서만 활성이 나타났으며, 홍화와 아욱에서는 혈전용해 효소의 활성이 나타나지 않았다. 이는 율무의 혈전용해 효소는 피브린 응집에 직접적으로 작용하는 혈전용해 효소인데 반하여 홍화와 아욱의 혈전용해 활성은 t-PA나 urokinase 같은 피브린응집에 간접적으로 작용하는 효소일 것으로 생각된다.
전체 수용성 단백질은 50-75% 에탄올을 이용하여 농축하였으며 율무의 혈전용해효소는 fibrin zymography 를 수행하여 확인하고 직접 추출하였다. SDS-PAGE에 의하여 추출효소의 분자량을 측정한 결과 7.8 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 효소 활성에 미치는 온도의 효과는 50℃ 이상에서는 비교적 안정하였으나 더 낮은 온도에서는 급격히 효소활성이 감소하였다. 또한, 각종 단백질분해효소 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 APMSF, PMSF, pepstatin A 그리고 TPCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 추출효소는 chymotrypsin 과 유사한 serine protease 의 하나로 생각되었다.
각각의 식물들로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin 평판법으로 확인한 결과 피브린 응집을 효과적으로 분해하였다. 그 중 율무종자의 수용성 추출물의 혈전용해 활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.
조사하였다. 그 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같이 율무의 종자에 있어서는 비조사 종자의 fibrin 평판에서의 투명환 지름 1.2 cm와 비교하여 1, 4, 16, 32 Gy의 선량에서 각각 투명 환의 지름이 1.1, 1.14, 1.05, 1.03 cm를 나타내어 상대적으로 낮은 활성을 보인 반면에 8 Gy와 64 Gy의 선량에서는 투명환의 지름이 1.5와 1.68 cm를 나타내어 상대적으로 높은 활성을 나타내었다. 홍화의 종자에서는 비조사 종자의 투명환 지름이 0.
1에 나타내었다. 그 결과 각각 아욱, 홍화, 율무의 종자로부터 수용성 단백질이 효과적으로 추출되어 농축되었음을 알 수 있었다. 혈전 분해효소는 단백질 분해 효소의 일종으로 주로 serine protease (세린계 단백질분해효소)나 metalloprotease (금속성의 단백질분해효소)로 알려져 있어 혈전분해 활성을 검증하기 위해서는 단백질분해 활성 검증이 선행되어야 한다.
각각의 식물들로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin 평판법으로 확인한 결과 피브린 응집을 효과적으로 분해하였다. 그 중 율무종자의 수용성 추출물의 혈전용해 활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.3배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 50-75% 에탄올을 이용하여 농축하였으며 율무의 혈전용해효소는 fibrin zymography 를 수행하여 확인하고 직접 추출하였다.
그러나 EGTA와 EDTA 처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않았다. 더욱이, 종자저장 중에 미생물에 의한 부패, 활력저하, 생리활성물질의 감소와 장기저장에 따른 에너지소비 증가 등이 문제가 되고 있어 저선량의 감마선 조사를 통해 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 혈전용해 효소활성에 미치는 효과 및 선량에 따른 차이를 조사하였는데 비조사 종자인 대조구와 비교하여 1 Gy, 4 Gy, 16 Gy, 32 Gy선량에서는 낮은 활성을 보였으면 반면에 8 Gy와 64 Gy의 선량에서는 더 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Y선 조사가 종자의 혈전용해 활성을 향상시킬 가능성이 있을 것으로 생각된다.
혈전 분해효소는 단백질 분해 효소의 일종으로 주로 serine protease (세린계 단백질분해효소)나 metalloprotease (금속성의 단백질분해효소)로 알려져 있어 혈전분해 활성을 검증하기 위해서는 단백질분해 활성 검증이 선행되어야 한다. 따라서 각각의 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 추출한 수용성 단백질로부터 Azocasein 법을 이용하여 단백질 분해활성을 검증한 결과를 Table 1에 나타내었는데 그 결과 농축된 전체 단백질의 양에 비하여 비활성이 각각 율무는 18.1 units/mg, 홍화는 11.2 units/mg, 그리고 아욱에서는 8.1 units/mg로 나타나 율무의 경우 전체 수용성 단백질의 양에 대한 단백질 분해효소의 비활성이 홍화와 아욱의 단백질 분해효소의 활성에 비하여 약 1.6~2.3배 높은 활성을 나타내었다.
2배의 높은 활성을 나타내었으며, 홍화와 아욱의 효소 활성은 plasmin과 비교 하였을 때 상대적으로 그 활성이 낮게 나타났다. 또한 율무의 효소 활성은 홍화와 아욱의 효소 활성에 비하여 상대적으로 약 2.6~3.5배의 강력한 혈전용해 활성을 나타내었으나 홍화와 아욱에서는 전체 단백질에 비하여 상대적으로 낮은 혈전용해 활성을 나타내었다.
8 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 효소 활성에 미치는 온도의 효과는 50℃ 이상에서는 비교적 안정하였으나 더 낮은 온도에서는 급격히 효소활성이 감소하였다. 또한, 각종 단백질분해효소 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 APMSF, PMSF, pepstatin A 그리고 TPCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 추출효소는 chymotrypsin 과 유사한 serine protease 의 하나로 생각되었다. 그러나 EGTA와 EDTA 처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않았다.
이고 EDTA와 EGTA는 metalloprotease inhibitor (금속성 단백질 분해효소 저해제)이며 pepstatin A는 acid protease inhibitor (산성 단백질 분해효소 저해제)로 알려져 있다. 본 연구의 결과 각종 저해제에 대한 저해효과는 금속이온의 chelate (킬레이트 화합물)인 5 mN의 EDTA와 EGTA에서는 오히려 활성이 증진되고, TLCK, aprotinin 그리고 pepstatin A는 30~40%의 저해효과를 보인 반면, APMSF와 PMSF를 비롯해서 TPCK를 1 mM의 농도로 첨가한 경우 활성이 60~70%의 저해효과를 나타낸 것으로 보아 율무에서 추출한 혈전용해 효소는 chymotrypsin과유사한 serine protease로 생각된다.
이러한 결과는 Y선 조사가 종자의 혈전용해 활성을 향상시킬 가능성이 있을 것으로 생각된다. 이상의 모든 결과로 볼 때 율무의 추출 효소는 chymotrypsin-like serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.
76 cm를 보여 활성이 크게 증가하였으나 나머지 선량에서는 상대적으로 낮은 활성을 나타내었다. 한편 아욱의 종자에 있어서는 0.56 cm의 비조사 종자에 비하여 4와 32 Gy의 선량에서 0.77과 0.75 cm로 상대적으로 강한 활성을 보였으며, 나머지 선량에서는 같거나 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 각각의 시료에 대한 저선량의 방사선의 조사는 각각 서로 다른 선량에서 효소의 활성을 증진시키거나 감소시키는 효과를 나타내었는데 이러한 결과는 Y선 조사가 저장종자의 발아력을 증진시키고 생리활성 향상에 영향을 미친다고 알려져 있어 유사한 결과를 나타내었다.
효소의 분자량: 율무 추출효소의 단일성 확인과 분자량 측정을 위해 활성 염색과 SDS-PAGE를 수행한 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 추출 단백질의 활성염색을 실시한 결과 추출효소가 혈전용해 효소임을 확인하였고, 추출효소의 분자량은 단일 polypeptides. 이루어진 약 7.
후속연구
그러나 아직까지 그 기작은 밝혀지지 않았다. 이상의 결과로 볼때, 저선량의 감마선의 조사가 율무, 홍화, 아욱 종자의 혈전용해 활성을 향상시킬 가능성을 나타낼 수 있을 것으로 생각되며, 효소활성의 증진과 감소에 저선량의 감마선의 효과에 대한 기작이 연구되어야 할 것으로 사료된다.
이와 같은 결과는 기존에 보고된 혈전용해 효소의 분리에 있어 식물류에 대한 보고가극히 적어 식물류의 혈전용해 활성에 대한 검토와 강력한 혈전 용해 활성을 가지는 식물류의 탐색이 필요하다고 생각된다. 특호], 율무에서 분리된 혈전용해 효소가 분자량이 작아 경구 투여 가능성이 있을 것으로 사료되며 추후 효과적인 정제과정과 분석 실험을 통하여 효소의 특성을 명확히 파악하고 작용기전을 조사해야 할 것으로 생각된다.
참고문헌 (56)
Markland, F. S. (1998), Snake venom and hemostatic system, Toxicon. 36(12), 1749-1800
Reed, G. L., L. F. Lin, B. Parhaml-Seren, and P. Kussie (1995), Identification of plasminogen binding. region in streptokinase that is necessary for the creation of streptokinase plasminogen activator complex, Biochemistry 34, 10266-10271
Mullertz, S. and M. Lassen (1953), An activator system in blood indispensable for formation of plasmin by streptokinas,. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 82, 264
D'Costa, S. S. and M. D. P. Boyle (1998), Interaction of a group A Streptococcus within human plasma results in assembly of a surface plasminogen activator that contributes to accupancy of surface plasmin-binding structures, Microbial Pathogenesis 24, 341-349
Sumi, H., M. Seiki, N, Morimoto, H. Tsushima, M. Maruyama, and H. Mihara (1985), Plasma fibrinolysis after intraduodenal administration of urokinase in rats, Enzyme. 33, 121-127
Kim, S. H. (1998), New trends of studying on potential activities of Doen-jang. Korea Soybean Diges. 15(1), 8-15
Holden, R. W. (1990), Plasminogen activators: pharmacology and theraphy, Radiology 174, 993-1001
Hamouda, B. M. H. and M. Ammar (1984), Demonstration of plasminogen activators in the saliva of a predatory insect of the family of Reduviidae, Arch. Inst. Pasteur. Tunis. 61, 73-95
Amarant, T. W. Burkltart, H. D. LeVine, C. L. Arocha-Pinango, and I. Parikh (1991), Isolation and complete amino acid sequence of two fibrinolytic proteases from the toxic Saturnid caterpillar Lonomia achelous, Biochim. Biophys. Acta. 1079, 214-221
Matsushima, A., K. Shioya, M. Kobayashi, Y. Kodera, and Y. Inada (1993), Activation of fibrinolysis with the protease from Dermatophagoides farinae, Thromb. Haemost. 70, 545
Park, H-J. and S-D. Park (1998), Purification and chrarcteristics of fibrinolytic enzyme having molecular weight 45,000 dalton from Holotrachia extract, J. Herbology 13(1), 119-137
Hahn, B. S., S. Y. Cho, M. Y. Ahn, and Y. S. Kim (2001), Purification and characterization of plasmin-like protease from Tenodera sinensis (Chinese mantis), Insect Biochemistry and molecular biology 31, 573-581
Chung, K. H. and D. S. Kim (1992), Fibrinolytic and Cogulation Activities of Korean Snake Venoms, Korean Biochem. J. 25, 696-701
Ouyang, C. and T. F. Huang (1976), Purification and properties of the fibrinolytic principle of Agkistrodon acutus venom, Biochimica et Biochemica Acta. 439, 146-153
Bajwa, S. S., H. Kirakossian, K. N. N. Reddy, and F. S. Markland (1982), Thrombin-like and fibrinolytic enzymes in the venoms from the gaboon viper (Bitis gabonica), eastern cottomnouth moccasin (Agkistrodon p. piscivorus) and southern copperhead (Agkistrodon c. contortrix) snakes, Toxicon. 20, 427-432
Dauod, E., A. Tu, and M. F. el-Asmar (1986), Isolation and characterization of an anticoagulant proteinase cerastase F-4 from Cerastes cerastes (Egyptian sand viper) venom, Thromb. Res. 42, 55-62
Ahmed, N. K., K. D. Tennant, F. S. Markland, and J. P. Lacz (1990), Biochemical characteristics of fibrolase, a fibrinolytic protease from snake venom, Haemostasis 20, 147-154
Siigur, E. and J. Siigur (1991), Purification and characterization of lebetase, a fibrinolytic enzyme from Vipera lebetina (snake) venom, Biochim. Biophys. Acta. 1074, 223-229
Siigur, J., M. Samuel, K. Tonismagi, J. Subbi, E. Siigur, and A. T. Tu (1998), Biochemical characterization of lebetase, a direct-acting fibrinolytic enzyme from Vipera lebetina snake venom, Thrombosis research 90, 39-49
Chiou, S. H., C. C. Hung, and K. F. Huang (1992), Characterization of a protease with alpha- and beta-fibrinogenase activity from the western diamondback rattlesnake, Crotalus atrox, Biochim. Biophys. Res. Commun. 187, 389-396
Datta, G., A. Dong, J. Witt, and A. T. Tu (1995), Biochemical characterization od basilase, a fibrinolytic enzyme from Crotalus basilicus basilicus, Achieves Biochemistry and Biophysics 317, 365-373
Hahn, B. S., I. M. Chang, and Y. S. Kim (1995), Purification and characterization of picivorase I and II, the fibrinolytic enzymes from eastern cottomnouth moccasin venom (Agkistrodon piscivorus piscivorus), Toxicon. 33(7), 929-941
Sugiki, M., Yoshida, E., Anai, K., and M. Maruyama (1998), Activation of single-chain urokinase-type plasminogen activator by a hemorrhagic metalloproteinase, jararafibrase I, in Bothrops Jararaca venom, Toxicon. 36, 993-1000
Ramirez, M. S., E. E. Sanchez, C. Garcia-Prieto, J. C. Perez, G. R. Chapa, M. R. McKeller, R. Ramirez, and Y, D. Anda (1999), Screening for fibrinolytic activity in eight viperid venoms, Com. Biochem. Physiol. 124(C), 91-98
Sanchez, E. F., C. I. Santos, A. Magalhaes, C. R. Diniz, S. Figueiredo, J. Giloy, and M. Richardson (2000), Isolation of a proteinase with plasminogen-activating activity from Lachesis muta muta (bushmaster) snake venom, Achives of Biochemistry and Biophysics. 378(1), 131-141
Trummal, K., H. Vija, J. Subbi, and J. Siigur (2000), MALDI-TOF mass spectrometry analysis of substrate specificity of lebetase, a direct-acting fibrinolytic metalloproteinase from Vipera lebetina snake venom, Biochimica et Biochemica Acta. 1476, 331-336
Swenson, S., L. R. Bush, and F. S. Markland (2000), Chimeric derivative of fibrolase, a fibrinolytic enzyme from southern copperhead venom, processes inhibitory activity on platelet aggregation, Achieves Biochemistry and Biophysics 384(2), 227-237
Koh, Y. S., K-H. Chung, and D. S. Kim (2001), Bionchemical characterization of a thrombin-like enzyme and a fibrinolytic serine protease from snake (Agkistrodon saxatilis) venom, Toxicon. 39, 555-560
Xiuxia, L., C. Jiashu, Z. Yingna, Q. Pengxin, and Y. Grangmei (2001), Purification and biochemical characterization of F IIa a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutusvenom, Toxicon. 39, 1133-1139
Guo, Y. W., T. Y. Chang, K-T. Lin, H-W. Liu, K-C. Shih, and S-H. Cheng (2001), Cloning and functional expression of the mucrosobin protein, a $\beta$ -fibrinogenase of Trimeresurus mucrosquaqmatus (Taiwan Habu), Protein Expression and Purification 23, 483-490
Jin, Y., Q. M. Lu, J. F. Wei, D. S. Li, W. Y. Wang, and Y. L. Xiong (2001), Purification and characterization of jerdofibrase, a serine protease from the venom of Trimeresurus jerdonii snake, Toxicon. 39, 1203-1210
Chudzinski-Tavassi, A. M., E. M. Kelen, A. P. Paula-Rosa, S. Loyau, C. A. Sampaio, C. Bon, and E. Angles-Cano (1998), Fibrino(geno)lytic properties of purified hementerin, a metallo-proteinase from the leech Haementeria depressa, Thromb. Haemost. 80, 155-160
Hrzenjak, T., M. Popovic, T. Bozic, M. Grdisa, D. Kobrehel, and L. Tiska-Rudman (1998), Fibrinolytic and anticoagulative activities from the earthworm Eisenia foetida,. Comp. Biochem. Physiol B. 119, 825-832
Fan, Q., C. Wu, L. Li, R. Fan, C. Wu, Q. Hou, and R. He (2001) Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III-1 from Lumbricus rubellus, Biochimica et Biochemica Acta. 1526, 286-292
Nakajima, N., H. Mihara, and H. Sumi (1993), Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthwarm, Lumbricus rubellus, Biosci. Biotech. Biochem. 57(10), 1726-1730
Mihara, H., N. Nakajima, and H. Sumi (1993), Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus, Biosci. Biotech. Biochem. 57, 1730
Mihara, H., H. Sumi, T. Yoneta, H. Mizumoto, R. Ikeda, M. Seiki, and M. Maruyama (1991), A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rebellus, Japanese journal of Physiology 41, 461
Kim, Y. T., W. K. Kim, and H. S. Oh (1995), Screening and Identification of the Fibrinolytic Bacterial Strain from ChungKooK-jang, Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 2(3), 1-5
Kim, H. K., G. T. Kim, D. K. Kim, W. A. Choi, S. H. Park, Y. K. Jeong, and I. S. Kong (1997), Purification and Characterization of a novel Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. KA38 Originated from Fermented Fish, J. Fermentation and Bioengineering 84(4), 307-312
Fujita, M., K. NoMura, K. Hong, Y. Ito, A. Asada, and S. Nishimura (1993), Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan, Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 1340-1347
Sumi, H., H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara, H., and H. A. Muraki (1987), A nobel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto: a typical and popular soybean food in the Japanese diet, Experientia. 43, 1110-1111
Nakajima, N., N. Taya, and H. Sumi (1993), Potent fibrinolytic enzyme from the lysate of Katsuwonus pelamis digestive tract (shiokara): purification and characterization, Biosci. Biotech. Biochem. 57(9), 1604-1605
Sumi, H., N. Nakajima, and C. Yatagai (1995), A unique strong fibrinolytic enzyme (katsuwokinase) in skipjack Shiokara, a Japanes traditonalmfermented food, Comp. Biochem. Physiol B. 112(3), 543-547
Matsubara, K., H. Sumi, K. Hori, and K. Miyazawa (1998), Purification and characterization of two fibrinolytic enzymes from a marine green alga, Codium intricatum, Comparative Biochemistry and Physiology 119B(1), 177-181
Matsubara, K., K. Hori, Y. Matsuura, and K, Miyazawa (1999), A fibrinolytic enzyme from a marine green alga, Codium latum, Phytochemistry 52, 993-999
Matsubara, K., K. Hori, Y. Matsuura, and K. Miyazawa (2000), Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme and identification of fibrinogen clotting enzyme in a marine green alga, Codium divaricatum, Comparative Biochemistry and Physiology 125, 137-143
Kim, J. H. (2000), Purification and Characterization of Fibrinolytic enzyme from Tricholoma saponaceum, The korean Society of Mycology 28(1), 60-65
Kim, J. H. and Y. S. Kim (1998), Purification and Characterization of Fibrinolytic enzyme from Armillariella mellea, The korean Society of Mycology 26(4), 583-588
Patton, L. M., D. Pretzer, B. S. Schulteis, K. D. Saggart, K. D. Tennant, and N. K. Ahmed (1993), J. Biochem. Biophysi. Met. 27(1), 11-23
Bradford, M. M. (1976), A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry 72, 248-254
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