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문제 정의
- 따라서 이용도가 높아지고 있는 다양한 허브는 그 향기나 풍미가 탁월하고 독특하여 식품 소재로서 기호성을 증진시킬 수 있으며 피로회복, 진정효과, 항균작용, 노화방지 등의 효능이 알려져 있어 생리 활성 측면에 있어 가치 있는 소재라 할 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 천연 허브류의 자유기 소거능을 측정함으로써 항산화성을 살펴보았으며, 세포주를 이용하여 세포 독성 및 산화적 스트레스 에 대한 보호효과를 측정함으로써 생리 활성을 살펴보았다. 세포주의 선택에 있어서는 폐가 산화적 스트레스에 매우 민감한 기관이라고 보고되고 있는(Pryor 등 1998) 점을 감안하여, 산화적 스트레스에 대한 허브 추출물의 효과를 살펴보기 위해 폐 조직에서 유래된 Chinese hasmter lung fibroblast(V79-4)라는 세포주를 이 용하였다(Kang 등 2005).
- 본 연구에서는 천연 허브류의 항산화성 및 세포주를 이용한 세포 독성, 산화적 스트레스에 대한 보호 효과, 항산화 효소 활성 등을 살펴보았다. Chinese Hamster lung fibroblasts인 V79-4에서는 green tea 추출물, 고농 도의 lemon vervena, eucalyptus 등의 추출물에서 세포 독성을 보였다.
- 세포주의 선택에 있어서는 폐가 산화적 스트레스에 매우 민감한 기관이라고 보고되고 있는(Pryor 등 1998) 점을 감안하여, 산화적 스트레스에 대한 허브 추출물의 효과를 살펴보기 위해 폐 조직에서 유래된 Chinese hasmter lung fibroblast(V79-4)라는 세포주를 이 용하였다(Kang 등 2005). 이에 더하여 항산화성 및 생리 활성이 높은 몇 가지의 허브류에 대하여서는 세포 주를 이용한 항산화 효소계의 활성을 관찰함으로써 허브류의 식품 소재로서의 가치를 검토하고자 하였다.
제안 방법
- Superoxide dismuatase 활성의 측정은 Crapo JD 등 (1978)의 방법을 변형하여 이루어졌다. 3 mM xanthine, 0.
- Superoxide radical 소거 반응은 Nishikimi M 등(1972)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, superoxide radical을 78 pM NADH(Sigma Chemical Co.
- 세포에 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유발 하고 허브 추출물의 세포에 대한 보호 효과를 Table 2에 나타내었다. V79-4 세포에 허브 추출물을 H2O2 보다 1시간 미리 처리하고 일정 시간 배양시킨 후 상대적인 세포 생존율을 통하여 추출물의 보호효과를 측정하였다. H2O2만을 처리한 세포의 경우 그 생 존율은 세포 독성을 살펴본 것에 비하여 현저하게 낮은 43% 정도였다.
- , Korea)를 이용하여 교반하여 추출액을 모았다. 각각의 추출액을 여과지로 거른 후 남은 잔사를 이용하여 같은 방법으로 1회 더 반복 추출하여 메탄올 추출액을 얻었다. 추출액은 감압하면서 농축, 건조하여 무게를 즉정하여 수율을 구하였고 중류수를 사용하여 1 g/mL 의 농도로 제조하여 항산화 실험 및 세포독성 검색에 사용하였다.
- 낮은 농도의 lavender, rose hip, peppermint 등의 추출물은 세포 생존율에 있어 대조군 과 유의적 차이가 없는 것으로 미루어 보아 세포 성장 에 크게 영향을 미치지 않는다고 여겨진다. 양성대조 군으로 사용된 비타민 C의 경우 허브 추출물과 같은 농도에서는 세포 생존율이 매우 낮았기 때문에 실험군 과의 비교를 위해 200 ug/mL의 낮은 농도에서 실험을 실시하였다. 그 결과 비타민 C를 처리하였을 때, 허브 추출물에 비해 낮은 농도에서 비슷한 효과가 나타났으 며 농도가 높아질수록 세포 생존율이 떨어지는 농도 의존적인 결과를 보였다.
- Louis, MO,USA) 시약을 사용하여 측정하였다. 즉, V79-4 세포를 5X105 cell/mL의 농도로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기(MCO-175, Sanyo, Japan)에서 24시간 배양한 후, 배양에 사용된 배지는 병아리관을 이용하여 빨아들여 제거한 후, 새로운 배지에 400, 800, 1600 Pg/mL 농도로 녹인 시료액을 분주하였다. 다시 72시간 배양한 후, 5 mg/mL 농도의 MTT 시약을 well당 10 pL 씩 분주한 다음 4시간 후, 2-propanol에 녹인 0.
- Louis, MO, USA) 시약을 사용하여 세포 생존율을 측정함으로써 실시하였다. 즉, 세포 독성 실험과 마찬가지로 5xl05 cell/mL의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간 배양한 후, 배양에 사용된 DMEM 배지를 제거하고 배지에 녹인 여러가지 농도(400, 800, 1600 iig/mL) 의 시료를 분주하였다. 1시간 후 1 mM의 H2O2를 분주함으로써 세포에 산화적 스트레스를 유발시켰다.
- 각각의 추출액을 여과지로 거른 후 남은 잔사를 이용하여 같은 방법으로 1회 더 반복 추출하여 메탄올 추출액을 얻었다. 추출액은 감압하면서 농축, 건조하여 무게를 즉정하여 수율을 구하였고 중류수를 사용하여 1 g/mL 의 농도로 제조하여 항산화 실험 및 세포독성 검색에 사용하였다.
- 허브 추출물의 superoxide radical 소거활성 및 세포 성장에 미치는 영향 등의 결과를 토대로 활성이 높게 나타났던 lemon vervena, chamomile, green tea와 상대적으로 활성이 낮게 나타났던 lemon grass, jasmine의 5종의 허브 추출물로 V79-4세포에서 대표적 항산화계 효소인 superoxide dismuatase(SOD), glutathione peroxidase(GPx), catalase(CAT) 활성 변화를 측정하였고 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 1600 ug/mL green tea 추출물을 제외하고는 허브 추출물을 처리하지 않은 대조군(44 unit/mg protein)에 비해 SOD 활성이 대체로 높게 나타났다.
대상 데이터
- Chinese Hamster lung fibrobl&sts 인 V79-4 세포(ATCC, CCL-93)는 ATCC(American Tissue Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 10% fetal bovine serum(FBS ; Gibco™ Invitrogen, Camarillo, CA, U.S.A.)과 100 unit/mL의 penicillin 및 100 ug/mL의 streptomycin(Gibco™ Invitrogen, Camarillo, CA, U.S.A.) 이 포함된 DMEM(Dulbecco4 5s modified Eagle Medium ; Gibco™ Invitrogen, Camarillo, CA, U.S.A.)을 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기(MCO-175, Sanyo, Japan)에서 배양하였으며 2일 간격으로 배지 교환 및 계대 배양을 실시하였다.
- 본 실험에는 총 15종의 허브가 사용되었고 건조되어 판매되는 것으로 2005년 4월 27일 이사벨아로마 (Isabellaroma)에서 구입하였다. Table 1과 같이 사용된 15종의 건조 허브는 분쇄기(FM-681 food mixer, Han Ⅱ, Korea)< 이용하여 가루로 만들어 -20 ℃에 보관하며 실험하였다.
데이터처리
- All Mean value are triplicate determinations. Mean + S.D. values in the same column(each herb) that are followed by a different letter are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- ’’Values in the same column that are followed by a different letter are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 통계처리는 SAS 프로그램을 이용하여 시료간의 superoxide radical 소거 활성의 차이 및 세포주를 이용한 실험에 있어서 대조군과 실험군 사이의 유의성 및 실험군 내의 농도에 따른 차이는 ANOVA(analysis of variance) 처리하였으며 Duncan's multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Catalase 활성의 측정은 Carrillo MC 등(1991)의 방법에 따라 H2O2(Fluka Co., Switzeland)가 분해되는 정도 에 의해 시행하였다. 효소액과 12 yL의 3%(v/v) H2O2 가 포함되어 있는 50 mM의 phosphate buffer(pH 7.
- Glutathione Peroxidase 활성 측정은 Pa 응lia DE 와 Valentien WN(1967)의 방법에 따라 측정하였는데 1 mM EDTA, 10 mM glutathione(GSH), 1 mM NaN* 1 unit의 glutatione reductase?} 포함되어 있는 0.1 M의 phosphate buffer(pH 7.
- 산화적 스트레스를 받은 V79-4 세포에 대한 허브 추출물의 보호효과를 Lee SE 등(2001)의 방법에 따라 3-(4, 5-dimethylthiazolyl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT ; Sigma Qiemical Co., St. Louis, MO, USA) 시약을 사용하여 세포 생존율을 측정함으로써 실시하였다. 즉, 세포 독성 실험과 마찬가지로 5xl05 cell/mL의 농도로 96 well plate에 분주하고 24시간 배양한 후, 배양에 사용된 DMEM 배지를 제거하고 배지에 녹인 여러가지 농도(400, 800, 1600 iig/mL) 의 시료를 분주하였다.
- 허브 추출물의 세포 독성 실험은 Lee SE 등(2001)의 방법에 따라 살아있는 세포의 mitochondrial dehydrogenase 에 의해 tetrazolium salt의 cleavage로 형성된 보라색 formazan의 정도를 측정함으로써 상대적인 세포의 생존율을 3-(4, 5-dimethylthiazolyl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT ; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,USA) 시약을 사용하여 측정하였다. 즉, V79-4 세포를 5X105 cell/mL의 농도로 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기(MCO-175, Sanyo, Japan)에서 24시간 배양한 후, 배양에 사용된 배지는 병아리관을 이용하여 빨아들여 제거한 후, 새로운 배지에 400, 800, 1600 Pg/mL 농도로 녹인 시료액을 분주하였다.
성능/효과
- 1에 나타내었다. 1600 ug/mL green tea 추출물을 제외하고는 허브 추출물을 처리하지 않은 대조군(44 unit/mg protein)에 비해 SOD 활성이 대체로 높게 나타났다. 1600 ug/mL lemon vervena 추출물을 처리하였을 경우 73 unit/mg protein으로 유의적으로 가장 높은 SOD 활성을 보였고, 800 yg/mL lemon vervena, 1600 pg/mL chamomile 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 SOD 활성에서 유의적인 차이가 보였다.
- 1600 ug/mL green tea 추출물을 제외하고는 허브 추출물을 처리하지 않은 대조군(44 unit/mg protein)에 비해 SOD 활성이 대체로 높게 나타났다. 1600 ug/mL lemon vervena 추출물을 처리하였을 경우 73 unit/mg protein으로 유의적으로 가장 높은 SOD 활성을 보였고, 800 yg/mL lemon vervena, 1600 pg/mL chamomile 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 SOD 활성에서 유의적인 차이가 보였다. 이 허브 추출물들은 농도가 증가할수록 효소 활성이 증가하는 경향을 보였다.
- 5종의 허브 추출물을 처리한 V79-4 세포의 GPx 효 소 활성은 대조군을 비롯한 모든 허브 추출물에서 8~ 15 unit/mg protein 정도로 나타났으며 허브 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 그 활성이 높아지는 경향을 보였고, 농도 의존적으로 효소 활성이 증가하였으나 유의적인 차이를 보이지는 않았다. Alpinia katsumadaie: 비롯한 여러 약용 식물 추출물을 처리한 V79-4 세포 의 GPx 활성의 경우 농도 의존적으로 증가하였고 그 효소 활성의 범위는 본 연구와 유사하였다Qee SE 등 2003a, Lee SE 등 2003b).
- V79-4 세포에서의 CAT 효소활성을 살펴보면 허 브 추출물을 처리하지 않은 대조군의 CAT 활성은 24 unit/mg protein정도였고 1600 pg/mL chamomile, jasmine 추출물, 800 pg/mL 비타민 C를 처리 하였을 때의 CAT 효소 활성도 비슷한 범위에서 나타났으 나 유의적인 차이는 보이지 않았다. Alpinia katsumadai 추출물을 V79-4 세포에 처리하였을 경우 CAT 활성은 SOD, GPx와 활성과 마찬가지로 농도 의존적이면서 대조군에 비하여서는 활성이 높게 나타났던 연구(Lee SE 등 2003b)와 달리 본 연구에서는 lemon vervena, green tea 추출물을 처리 한 경우에는 앞에서의 SOD, GPx 활성 결과와는 달리 대조군에 비하여 그 활성이 낮게 나타났으며 농도가 증가할수록 그 활성이 증가하는 경향도 보이지 않았다. 신유진 등(2004)은 GPx가 주로 세포 질에 널리 분포되어 있는 반면, H2O2를 분해하는 또 다른 효소인 CAT는 세포내의 peroxisome에 존 재하기 때문에 GPx와는 달리 반응이 제한적이거나 생성된 H2O2 분해에는 관여하지 않고, 세포수 감 소에 수반되는 것으로 보여 그 활성이 나타나지 않았다고 보고하였다.
- 45 g/100mL 로 활성이 가장 높은 것으로 나타났다. Chamomile, dandelion, lemon vervena 추출물도 각각 1.49 g/100mL, 1.50 g/100mL, 1.55 g/lOOmL로 green tea 추출물과 마찬가지로 다른 허브 추출물에 비해 유의적으로 높은 소거활성을 보였다. Eucalyptus, thymee 다른 허브 추출 물에 비해 유의적으로 낮은 superoxide radical 소거능을 보였다.
- MTT assay를 통하여 허브 추출물의 Chinese Hamster lung fibroblast인 V79-4 세포에 대한 세포 독성 효과를 Table 2에 나타내었다, 400~1600 ug/mL 농도의 허브 추출물을 투여한 결과 모든 농도의 green tea 추출물(16%, 21%, 41%)과 고농도의 lemon vervena, eucalyptus, thyme, fennel 추출물에서 세포 생존율이 각각 54%, 44%, 63%, 66%로 모두 유의적으로 낮게 나타났다. superoxide radical 소거 활성이 높게 나타난 green tea 추출물의 경우 모든 농도에서 세포 생 존율은 대조군에 비해 유의적으로 낮게 나타났는데 이는 강한 소거 활성이 세포 성장에 있어서도 영향을 미친 것으로 사료된다.
- V79-4 세포에서의 CAT 효소활성을 살펴보면 허 브 추출물을 처리하지 않은 대조군의 CAT 활성은 24 unit/mg protein정도였고 1600 pg/mL chamomile, jasmine 추출물, 800 pg/mL 비타민 C를 처리 하였을 때의 CAT 효소 활성도 비슷한 범위에서 나타났으 나 유의적인 차이는 보이지 않았다. Alpinia katsumadai 추출물을 V79-4 세포에 처리하였을 경우 CAT 활성은 SOD, GPx와 활성과 마찬가지로 농도 의존적이면서 대조군에 비하여서는 활성이 높게 나타났던 연구(Lee SE 등 2003b)와 달리 본 연구에서는 lemon vervena, green tea 추출물을 처리 한 경우에는 앞에서의 SOD, GPx 활성 결과와는 달리 대조군에 비하여 그 활성이 낮게 나타났으며 농도가 증가할수록 그 활성이 증가하는 경향도 보이지 않았다.
- 결과적으로 superoxide radical 소거 활성이 크고 세포 성장을 효과적으로 억제하였던 lemon vervena, chamomile 추출물이 항산화 효소 SOD와 GPx 활성에 있어서도 대조군에 비해 활성이 높게 나타나 효과적으로 활성 산소종을 제거하였을 것이라 사료된다. 다양한 허브 추출물의 활성 검색을 토대로 허브를 차(tea) 로 우려마실 경우 그 기능성 성분으로 인한 항산화 활 성 효과를 얻을 수 있음을 짐작할 수 있다.
- 양성대조 군으로 사용된 비타민 C의 경우 허브 추출물과 같은 농도에서는 세포 생존율이 매우 낮았기 때문에 실험군 과의 비교를 위해 200 ug/mL의 낮은 농도에서 실험을 실시하였다. 그 결과 비타민 C를 처리하였을 때, 허브 추출물에 비해 낮은 농도에서 비슷한 효과가 나타났으 며 농도가 높아질수록 세포 생존율이 떨어지는 농도 의존적인 결과를 보였다.
- 신유진 등(2004)은 GPx가 주로 세포 질에 널리 분포되어 있는 반면, H2O2를 분해하는 또 다른 효소인 CAT는 세포내의 peroxisome에 존 재하기 때문에 GPx와는 달리 반응이 제한적이거나 생성된 H2O2 분해에는 관여하지 않고, 세포수 감 소에 수반되는 것으로 보여 그 활성이 나타나지 않았다고 보고하였다. 본 연구의 CAT 활성도 이러한 이유로 대조군과 추출물 사이의 CAT 활성 차이가 SOD나 GPx에 비해 뚜렷하지 않은 것으로 사 료된다.
- 1600 ug/mL lemon vervena 추출물을 처리하였을 경우 73 unit/mg protein으로 유의적으로 가장 높은 SOD 활성을 보였고, 800 yg/mL lemon vervena, 1600 pg/mL chamomile 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 SOD 활성에서 유의적인 차이가 보였다. 이 허브 추출물들은 농도가 증가할수록 효소 활성이 증가하는 경향을 보였다. 양성 대조군으로 사용한 비타민 C의 경우 상대적 비교를 위하여 세포 독성 실험에서 와 마찬가지로 낮은 농도를 처리하였는데, 추출물에 비해 낮은 농도에서 비슷한 효소 활성을 보였다.
- ) 식물은 erythrocytes와 leucocytes에서 산화적 스트레스를 받은 대조군에 비하여 항산화계 효소 체계에 효과 적임을 보였으며 이것으로 이 식물 추출물이 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 가지고 있음을 보여주었다(Konyalioglu S와 Karamenderes C 2005). 이러한 연구들에 비추어 허브 추출물의 경우 산화적 스트레스에 대해 모든 추출물이 농도 의존적으로 V79-4 세포를 보호하지는 않으나 대조군과 유의적인 차이를 보이며50%가 넘는 생존율을 나타낸 lemon verven, green tea, hawthorn, peppermnt, rosemary 추출물의 경우 V79-4 세포에 대해 보호 효과를 일부 가지고 있다고 사료된다.
- 값으로 Table 1에 표현하였다. 총 15종의 허 브 추출물 중에서 green tea의 ICso 값이 1.45 g/100mL 로 활성이 가장 높은 것으로 나타났다. Chamomile, dandelion, lemon vervena 추출물도 각각 1.
- H2O2로 유발한 산화적 스트레스에 대해 허브 추출물의 V79-4 세포 보호효과는 모든 추출 물이 농도 의존적으로 효과를 갖지는 않으나 chamomile, fennel, dandelion을 제외한 대부분의 고농도 추출물에서 대조군에 비해 세포 보호 효과를 가지고 있다고 보인다. 항산화 활성 및 세포 독성 실험을 토대로 활성이 높은 5가지 허브 추출물의 V79-4 세포를 이용한 항산화 효소 활성에서 lemon vervena, chamomile을 처리하면 superoxide dismutase, glutathione peroxidase 활성이 대조군보다 증가하는 결과를 보였다. 이러한 다양한 허브 추출물의 항산화 활성 검색을 토대로 허브류의 식품 소재로서의 가능성을 평가할 수 있을 것이다.
후속연구
- 항산화 활성 및 세포 독성 실험을 토대로 활성이 높은 5가지 허브 추출물의 V79-4 세포를 이용한 항산화 효소 활성에서 lemon vervena, chamomile을 처리하면 superoxide dismutase, glutathione peroxidase 활성이 대조군보다 증가하는 결과를 보였다. 이러한 다양한 허브 추출물의 항산화 활성 검색을 토대로 허브류의 식품 소재로서의 가능성을 평가할 수 있을 것이다.
- 다양한 허브 추출물의 활성 검색을 토대로 허브를 차(tea) 로 우려마실 경우 그 기능성 성분으로 인한 항산화 활 성 효과를 얻을 수 있음을 짐작할 수 있다. 활성의 차이를 보이는 허브류를 중심으로 그 기능성 성분의 종 류와 함량 등에 관한 연구가 진행되어야 할 것이며 이 로써 허브류의 식품 소재로서의 가능성을 평가, 예측 할 수 있을 것이다.
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