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문제 정의
- 본 연구에서는 허브 식물로부터 생리활성 성분을 추출하기 위한 연구의 일환으로 오랫동안 사용되어 온 20종의 허브 식물로부터 추출물을 제조하고 폴리페놀과 플라보노이드 함량, 항산 화 활성을 비교하여 이 중 플라보노이드 추출수율이 높은 타임을 선별하였다. 또한 타임으로부터 플라보노이드 추출 수율을 비교하여 최적의 추출 용매를 선정하고, 실험계획법으로 타임 플라보노이드의 추출 조건을 최적화함으로서 향후 타임 추출물의 생산에 관한 기초적인 자료를 확보하고자 하였다.
- 본 연구에서는 허브 식물로부터 생리활성 성분을 추출하기 위한 연구의 일환으로 오랫동안 사용되어 온 20종의 허브 식물로부터 추출물을 제조하고 폴리페놀과 플라보노이드 함량, 항산 화 활성을 비교하여 이 중 플라보노이드 추출수율이 높은 타임을 선별하였다. 또한 타임으로부터 플라보노이드 추출 수율을 비교하여 최적의 추출 용매를 선정하고, 실험계획법으로 타임 플라보노이드의 추출 조건을 최적화함으로서 향후 타임 추출물의 생산에 관한 기초적인 자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법[21]에 의해 측정하였다. 0.1 mL의 시료에 0.05 mL의 Folin-Ciocalteu phenol reagent를 혼합 후 4분간 방치시키고, 20%의 Na2CO3 1.5 mL를 가하여 2분간 반응시킨 다음 760 nm에서 흡광도를 측정하여 총 폴리페 놀 함량을 계산하였다. 표준물질로는 chlorogenic acid를 사용하였으며, 함량은 추출물 g 당 chlorogenic acid equivalent (CAE)로 나타냈다.
- 80% 에탄올을 이용하여 20가지의 허브 식물을 추출하였다. 80% 에탄올은 극성과 비극성의 성질을 모두 가진 양친매성 용매로, 에탄올 수용액의 형태는 식물체 내부로 침투가 용이하여 페놀성 물질의 추출에 유리한 특징을 가지고 있다[24].
- DPPH radical 소거능은 Blois의 방법[23]을 일부 변형하여 분석하였다. 시료 40 µL와 메탄올에 0.
- 겨자(mustard), 계피(cinnamon), 딜씨드(dillseed), 로즈마리 (rosemary), 마조람(marjoram), 메이스(mace), 바질(basil), 백후추 (white pepper), 샐러리(celery), 세이지(sage), 월계수 잎(bay leaf), 오레가노(oregano), 카다몬(cadamon), 커민(cumin), 코리안더(coriander), 클러브(clove), 타임(thyme), 튜메릭(turmeric), 페뉴그릭(fenugreek), 흑후추(black pepper)의 20가지 건조 분말에 각각 1:20 (w:v) 비율로 80% ethanol (v/v)을 혼합한 후 30 ℃에서 2시간 동안 진탕추출하였다. 추출액을 원심분리(1,600×g, 10분) 후 상등액을 취해 감압여과(Whatman, Buckinghamshire, UK)한 다음 감압농축 및 동결건조하여 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹인 후 분석용 시료로 사용하였다.
- 독립변수(Xn)는 추출온도(X1), 시료농도(X2), 추출시간(X3)을 각각 −1, 0, 1의 3가지 범위로 추출조건을 계획하였으며(Table 1), 총 플라 보노이드 함량(Y1)으로 종속변수(Yn)를 설계하였다.
- 타임 분말로부터 n-헥산을 이용하여 플라보노이드를 추출하기 위한 최적의 조건을 찾기 위하여 반응표면분석법(RSM)을 사용하였다. 독립변수로서 추출온도(X1), 시료농도(X2) 및 추출시간(X3)을 선정하였고, 종속변수로서 총 플라보노이드 함량(Y1) 을 선정하였다. 독립변수를 3가지 범위(−1, 0, 1)에서 20가지 조건으로 추출실험을 실시하여 추출물의 총 플라보노이드 함량을 분석하였다.
- 독립변수를 3가지 범위(−1, 0, 1)에서 20가지 조건으로 추출실험을 실시하여 추출물의 총 플라보노이드 함량을 분석하였다.
- 80% 에탄올은 극성과 비극성의 성질을 모두 가진 양친매성 용매로, 에탄올 수용액의 형태는 식물체 내부로 침투가 용이하여 페놀성 물질의 추출에 유리한 특징을 가지고 있다[24]. 추출액을 감 압농축한 후 동결건조하고 DMSO에 1 mg/mL의 농도가 되도록 녹여 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 및 DPPH radical 소거활성을 측정하였다. 각 허브 원료로부터 에탄올 추출의 고형분 수 율을 고려하여 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량을 Table 2에 표시하였다.
- 추출액을 원심분리(1,600×g, 20분)하여 상등액을 취하고 감압여과 (Whatman, Buckinghamshire, UK)한 다음 진공농축한 후 동일 부피만큼 에탄올을 가하여 총 플라보노이드 함량을 분석하였다.
- 타임 분말로부터 플라보노이드 추출을 위한 적절한 용매 선정을 위해 물과 순도 99% 이상의 용매(에탄올, 메탄올, n-헥산)로 각각 타임 추출물을 제조하여 플라보노이드 함량을 분석하였다. 타임이 함유하고 있는 플라보노이드계 물질의 극성 및 비극성 도를 고려하여 극성이 다른 세 용매를 사용하여 추출하였다.
- 타임 분말로부터 플라보노이드 추출을 위한 적절한 용매 선정을 위해 물과 순도 99% 이상의 용매(에탄올, 메탄올, n-헥산)로 각각 타임 추출물을 제조하여 플라보노이드 함량을 분석하였다. 타임이 함유하고 있는 플라보노이드계 물질의 극성 및 비극성 도를 고려하여 극성이 다른 세 용매를 사용하여 추출하였다. 그 결과 Fig.
대상 데이터
- 24 mg NE/100 g이었고, 물 추출물에서는 검출되지 않았다. 그러므로 총 플라보노이드 함량이 높은 용매인 n-헥산을 추출용매로 선정하였다. 플라보노이드의 추출에 고온의 물을 용매로도 사용하나[28] 본 연구에서는 비교적 낮은 온도인 25 ℃ 에서 추출하여 플라보노이드가 검출되지 않은 것으로 판단된다.
- 본 실험에 사용한 허브 원료는 모두 ㈜ 이에스기술연구소(군포, 대한민국)에서 건조 분말을 구입하여 원료 표준화를 위해 분쇄 한 후 입도 500 µm 이하의 것만을 추출용 시료로 사용하였다.
- 추출액을 원심분리(1,600×g, 10분) 후 상등액을 취해 감압여과(Whatman, Buckinghamshire, UK)한 다음 감압농축 및 동결건조하여 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹인 후 분석용 시료로 사용하였다.
- 5 mL 1N NaOH를 추가하여 1시간 동안 37 °C에서 반응시킨 다음 흡광도를 420 nm에서 측정하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였다. 표준물질로는 naringin을 사용하였으며, 추출물 g 당 naringin equivalent(NE)로 함량을 나타냈다.
이론/모형
- 독립변수(Xn)는 추출온도(X1), 시료농도(X2), 추출시간(X3)을 각각 −1, 0, 1의 3가지 범위로 추출조건을 계획하였으며(Table 1), 총 플라 보노이드 함량(Y1)으로 종속변수(Yn)를 설계하였다. 실험모델 설계는 Design Expert 6.0 (Stat-Ease Inc,. Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법[21]에 의해 측정하였다. 0.
- 타임 분말로부터 n-헥산을 이용하여 플라보노이드를 추출하기 위한 최적의 조건을 찾기 위하여 반응표면분석법(RSM)을 사용하였다. 독립변수로서 추출온도(X1), 시료농도(X2) 및 추출시간(X3)을 선정하였고, 종속변수로서 총 플라보노이드 함량(Y1) 을 선정하였다.
- 타임 분말의 플라보노이드 추출조건 최적화를 위한 실험을 반응표면분석법(response surface method, RSM)의 하나인 중심합성계획법(central composite design)으로 설계하였다. 독립변수(Xn)는 추출온도(X1), 시료농도(X2), 추출시간(X3)을 각각 −1, 0, 1의 3가지 범위로 추출조건을 계획하였으며(Table 1), 총 플라 보노이드 함량(Y1)으로 종속변수(Yn)를 설계하였다.
성능/효과
- 9011로, 5% 이내의 수준에서 유의성이 인정되었다. ANOVA 분산분석으로 독립변수에 대한 종속변수의 상호관계를 확인한 결과, 독립변수 중에서 추출온도(X1)를 제외한 추출농도 (X2)와 추출시간(X3)이 유의성이 있는 것으로 나타났다(5%의 유의수준 이내). 능선분석 그래프를 통해 3가지 인자의 상호관계를 확인하였으며, 추출농도(X2)가 0.
- 각 허브 원료로부터 에탄올 추출의 고형분 수 율을 고려하여 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량을 Table 2에 표시하였다. Table 2에서 보는 바와 같이 총 폴리페놀 함 량은 클러브, 타임, 로즈마리, 계피의 순으로 각각 7.08, 6.90, 4.88, 3.35 mg CAE/100 g을 나타냈으며, 총 플라보노이드 함량 은 타임, 오레가노, 로즈마리, 클러브의 순으로 1.71, 0.77, 0.80, 0.97 mg NE/100 g을 나타냈다. 또한, DPPH radical 소거활성은 타임, 월계수 잎, 세이지, 클러브, 오레가노, 마조람, 바질, 계피, 로즈마리 추출물에서 90% 이상의 높은 항산화 활성을 보였다.
- 그 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이, 에탄올, 메탄올 및 n-헥산 추출물의 총 플라보노이드 함량은 2.86±0.64, 2.09±0.30 및 10.09±1.24 mg NE/100 g이었고, 물 추출물에서는 검출되지 않았다.
- 능선분석 그래프를 통해 3가지 인자의 상호관계를 확인하였으며, 추출농도(X2)가 0.50-1.63%로 증가할수록 총 플라보노이드 함량이 유의성 있게 증가하는 것으로 확인되었다 (p <0.0003).
- 97 mg NE/100 g을 나타냈다. 또한, DPPH radical 소거활성은 타임, 월계수 잎, 세이지, 클러브, 오레가노, 마조람, 바질, 계피, 로즈마리 추출물에서 90% 이상의 높은 항산화 활성을 보였다. 총 플라보노이드 함량은 타임 추출물에서 가장 높았으며, 총 폴리페놀 함량 및 DPPH radical 소거활성도 타임 추출물에서 높은 수준을 보여 20가지 허브 식물 중 타임을 추출시료로, 플라 보노이드를 추출 화합물로 선택하였다.
- 예측된 조건으로 타임 n-헥산 추출물을 제조한 후 플라보노이드 함량을 분석한 결과 6.79±0.46 mg NE/100 g로 예측 값의 96.3%를 나타내어 실험계획법에 의한 추출조건 최적화의 신뢰성이 검증되었다.
- 0227). 총 플라보노이드 함량에 대한 추출온도(X1)의 영향은 미미하였으나 추출 농도(X2)는 1.63%까지 증가하여 총 플라보노이드 함량은 뚜렷 하게 증가하는 경향을 보였다(Fig. 2). 타임의 일종인 섬백리향 에서 75% 에탄올을 용매로 microwave를 이용한 항산화 성분 의 추출조건 최적화에 관한 연구에서도 본 연구와 동일하게 플 라보노이드 추출량의 추출시간은 5% 유의수준에서 유의한 것 으로 보고되었다[29].
- 또한, DPPH radical 소거활성은 타임, 월계수 잎, 세이지, 클러브, 오레가노, 마조람, 바질, 계피, 로즈마리 추출물에서 90% 이상의 높은 항산화 활성을 보였다. 총 플라보노이드 함량은 타임 추출물에서 가장 높았으며, 총 폴리페놀 함량 및 DPPH radical 소거활성도 타임 추출물에서 높은 수준을 보여 20가지 허브 식물 중 타임을 추출시료로, 플라 보노이드를 추출 화합물로 선택하였다. 시판되는 6종의 허브류 중에서 로즈마리 추출물의 폴리페놀 함량이 높다는 보고[25]와 11종의 허브 중 배초향, 페퍼민트 등의 DPPH radical 소거활성이 우수하다는 보고[26]가 있다.
- 추출시간(X3)은 30-193분으로 증가할수록 총 플라보노이드 함량이 유의적으로 증가하였다(p <0.0227).
- 타임으로부터 온도, 농도, 시간의 추출조건에 따른 총 플라보노이드 함량의 반응표면분석에서 예측된 총 플라보노이드 함량은 7.05 mg NE/100 g이었고, 이 때의 추출조건은 추출온도 35.87 ℃, 추출농도 1.63%, 추출시간 192.28분이었다. 예측된 조건으로 타임 n-헥산 추출물을 제조한 후 플라보노이드 함량을 분석한 결과 6.
후속연구
- 또한 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 물론 항산화 활성 모두 높은 (+)의 상관관계를 나 타낸 연구 결과[31]와 유사한 결과이다. 결론적으로 본 연구에서 최적화한 추출 조건은 플라보노이드의 생산을 위한 타임의 용매추출 조건으로서 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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