[논문]녹차추출물의 산화적 스트레스에 대한 억제효과

김남이; 이진하; 허문영

녹차추출물의 산화적 스트레스에 대한 억제효과
Protective Effect of Green Tea Extracts on Oxidative Stress 원문보기

韓國藥用作物學會誌 = Korean journal of medicinal crop science, v.14 no.6, 2006년, pp.322 - 328

김남이 (강원대학교 약학대학) , 이진하 (강원대학교 바이오산업공학부) , 허문영 (강원대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Green tea is of particular source as it has been found to have strong antioxidant activities. The extracts of green tea during the commercial harvest seasons from April, 2003 to August, 2003 were compared. The purpose of this study was to determine the correlation between the polyphenol content of green teas and its antioxidant activities. The con-tent of total polyphenols was analyzed and several antioxidant testings were performed. The levels of total polyphenols were higher in the green teas (e.g. Woojeon, Sejak) harvested during very early spring and lower in the green teas harvested late(eg. Ipha, Yepcha). In particular, the free radical scavenging, the inhibition of LDL oxidation, the cytoprotective effect and the inhibition of DNA damage were correlated with the total polyphenol contents of green tea extracts harvested early spring such as Woojeon, Sejak and Jungjak. The results obtained here show that all extracts of green teas including purified green tea catechin, GTC, have strong antioxidant activities on oxidative stress in vifrθ. The variation in polyphenol content and antioxidant activities among various types of green tea by the harvesting time may provide critical information for investigators and consumers using tea in purposes of nutrition and chemoprevention.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

녹차추출 물들의 활성비교에서는 큰 차이는 아니지만 우전, 세작, 중작 등에서 다소 높았고 엽차는 다소 낮은 편이었다. 본 실험은 ethyl linoleate를 사용하여 Fenton reaction에 의해 생성된 hydroxyl radical의 지질과산화작용에 대한 억제효과를 관찰하는 것으로서 EGCG GTC와 녹차추출물들은 강한 지질과산화 억제작용이 있는 것으로 판단되었다. 한편, 가장 이른 시기에 수확되는 고급 차인 우전, 세작, 중작을 비교할 때 활성은 비슷하였다.
본 연구논문은 2005년도 지역협력연구센터사업 (한림대 실 버생물산업기술연구센터 )와 과학기술부 나노바이오사업 바이오식품소재 기반기술개발사업 (한국식품연구원)의 지원으로 수행되었음을 밝히며 이에 감사드리는 바이다.
본 연구에서는 NIH/3T3 세포에 H2O2 처리에 의한 DNA single strand breakage를 comet assay로 평가하였다. Comet assay는 여러가지 작용기전의 유전독성물질에 의한 단일세포 에서 DNA 손상을 검출할 수 있는 예민한 방법으로 알려져 있다.
가장 이른 시기에 수확되는 고급 차인 우전, 세작, 중작을 비교할 때 함량은 우전 > 세작 > 중작 순이었다. 본 연구에서는 수확시기가 다른 시판녹차의 에탄올추출물, 녹차추출 물의 정제조성물인 녹차카테킨 (GTC)와 주성분인 EGCG의 프리라디칼 소거작용과 항산화작용 및 이에 의한 산화적 세포독성 억제효과 및 DNA 손상억제효과 등을 검토하였다. 총폴리 페놀함량 중 GTC는 Sephadex 컬럼크로마토그래피로 정제한 조성물이기 때문에 40%의 높은 함량을 나타내었다.
이에, 채취시기가 다른 여러가지 시판 녹차추출물들을 대상으로 in 에서의 free radical 소거능, antioxidant effect, 세포독성억제효과 및 산화적 DNA 손상억제효과를 규명하였기에 보고하는 바이다.
본 연구에서는 수확시기에 따라 다양하게 상품화 되어있는 여러가지 녹차들의 항산화 효능비교차원에서 우전, 세작, 중 작, 입하, 엽차 등 녹차들의 에탄올 추출물, 정제된 녹차카테 킨추출물 (GTC)과 주요 카테킨성분인 (-)-epigallocatechin gallate (EGCG)를 비교대상으로 하여 free radical 소거작용과 LDL oxidation 억제효과를 비교하였다. 한편, 포유류동물세포 에서 H2O2 유도 세포독성에 미치는 영향 및 산화적 DNA 손상에 미치는 영향을 연구하여 산화적 스트레스에 의한 항산화성 유전독성억제효과 (antioxidative antigenotoxic effect)를 입증하려고 시도하였다,

제안 방법

5)에 30분간 담가 중화시켰다. Tray에 걸어 말린 후 ethidium bromide (2μg/μℓ) 20μℓ를 각각의 slide에 떨어뜨린 후 cover slide를 덮어 515-560 nm 의 excitation filter와 590 nm 의 barrier filter를 이용하여 형광현미경으로 관찰하여 image analyzer인 KOMET 5.5 (Kinetic image, England)로 slide 당 25 cell을 분석하였다. 측정파라메터로서 tail length (TL)와 olive tail moment (OTM)를 사용하여 DNA 손상도를 분석하였다 (Olive et al.
본 연구에서는 수확시기에 따라 다양하게 상품화 되어있는 여러가지 녹차들의 항산화 효능비교차원에서 우전, 세작, 중 작, 입하, 엽차 등 녹차들의 에탄올 추출물, 정제된 녹차카테 킨추출물 (GTC)과 주요 카테킨성분인 (-)-epigallocatechin gallate (EGCG)를 비교대상으로 하여 free radical 소거작용과 LDL oxidation 억제효과를 비교하였다. 한편, 포유류동물세포 에서 H2O2 유도 세포독성에 미치는 영향 및 산화적 DNA 손상에 미치는 영향을 연구하여 산화적 스트레스에 의한 항산화성 유전독성억제효과 (antioxidative antigenotoxic effect)를 입증하려고 시도하였다,
이때 검체를 양성대조물질과 동시처리하거나 단독 투여하여 검체의 DNA 손상 억제효과를 평가하였다. 실험은 NIH/3T3 cell 15x10, 개를 6 well culture dish (35 mm)에 심고, 24시간 후에 양성개조물질인 H2O2 30μℓ와 DMSO 및 DMSO에 녹인 검체를 소정농도로 넣어 주었다. 45분 후에 배지를 모두 버리고 새 배지(DMEM)를 3mℓ 넣은 후 37℃ CO2 incubatore"] 한 시간 동안 배양하였다.
한편 H2O2의 세포독성에 대한 검체들의 효과도 검정하였다. 이때 NIH/3T3 celle well당 25,000개로 하고 배지 80μℓ 중에서 24시간 CO2 incubator에서 배양 후 검체 단독 또는 H2O2 10μℓ 및 검체 10μℓ를 가하고 20시간 더 배양한 후 MTT 시약을 15 μℓ를 가하고 4시간 배양 후 배지를 버리고 DMSO를 200μℓ 가하여 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
양성 대조 물질로는 H2O2를 사용하였다. 이때 검체를 양성대조물질과 동시처리하거나 단독 투여하여 검체의 DNA 손상 억제효과를 평가하였다. 실험은 NIH/3T3 cell 15x10, 개를 6 well culture dish (35 mm)에 심고, 24시간 후에 양성개조물질인 H2O2 30μℓ와 DMSO 및 DMSO에 녹인 검체를 소정농도로 넣어 주었다.
5 (Kinetic image, England)로 slide 당 25 cell을 분석하였다. 측정파라메터로서 tail length (TL)와 olive tail moment (OTM)를 사용하여 DNA 손상도를 분석하였다 (Olive et al., 1990).
, 2005). 한편 H2O2의 세포독성에 대한 검체들의 효과도 검정하였다. 이때 NIH/3T3 celle well당 25,000개로 하고 배지 80μℓ 중에서 24시간 CO2 incubator에서 배양 후 검체 단독 또는 H2O2 10μℓ 및 검체 10μℓ를 가하고 20시간 더 배양한 후 MTT 시약을 15 μℓ를 가하고 4시간 배양 후 배지를 버리고 DMSO를 200μℓ 가하여 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

EGCG[(-)-epigallocathechin gallate] 와 Trolox (6-Hydroxy- 2, 5, 7, 8-tetramethyl chroman-2-carboxyIic Acid)는 Sigma사로 부터 공급받았으며 녹차카테킨 (GTC)은 삼아약품(주)으로부터 제공받아 사용하였다. 녹차는 수확시기(2003년)에 따라 채취된 엽차(6월 30일경 채취), 입하 (6월 10일경 채취), 중작 (5월 30일경 채취), 세작 (5월 20일경 채취) (이상 대한다원 제, 전남 보성산), 우전 (5월 10일경 채취, 고려다원제, 경남 하동산) 각각 100 g에 에탄올 1 Z를 넣어 실온에서 3일간 침 출한 후 여과하고 여액을 증발농축하여 각각의 에탄올추출물 을 얻었다.
본 실험의 in vitro 연구에서 사용되는 cell linee ATCC로 부터 분양 받아 강원대 약대 액체질소탱크에 있는 NIH/3T3 cell을 사용하여 수시로 계대하여 실험목적에 맞게 배양하였다. 세포배양은 10% FBS (GIBCO), 1% L-glutamine (GIBCO), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO) 함유 DMEM (GIBCO) 배지를 사용하였다.
본 실험의 in vitro 연구에서 사용되는 cell linee ATCC로 부터 분양 받아 강원대 약대 액체질소탱크에 있는 NIH/3T3 cell을 사용하여 수시로 계대하여 실험목적에 맞게 배양하였다. 세포배양은 10% FBS (GIBCO), 1% L-glutamine (GIBCO), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO) 함유 DMEM (GIBCO) 배지를 사용하였다.
, 2005). 양성 대조 물질로는 H2O2를 사용하였다. 이때 검체를 양성대조물질과 동시처리하거나 단독 투여하여 검체의 DNA 손상 억제효과를 평가하였다.

데이터처리

실험은 대부분 3회 실험하였으며 얻어지는 data들은 Student's t-test를 사용하여 유의성 검정을 행하였다.

이론/모형

5. Cytoprotective effects of green tea extracts against H₂O₂ (5 × 10^-4M)-induced cytotoxicity by MTT method.
NIH/3T3 cell에서 녹차추출물들의 세포독성을 MTT법에 따라 microplate reader로 측정하였다 (Cole, 1986, Byun et al., 2005). 한편 H2O2의 세포독성에 대한 검체들의 효과도 검정하였다.
NIH/3T3 cell을 배양하여 comet assay를 실시하였다 (Sing et al., 1988, Jin et al., 2005). 양성 대조 물질로는 H2O2를 사용하였다.
녹차추출물 중의 총폴리페놀 분석은 Folin-Ciocalteu법에 따라서 실시하였으며 gallic acid의 양으로서 나타내었다 (Zheng et al., 2001).
지질과산화에 의해 생성된 산화 LDL (low density lipo- protein)의 산화억제작용을 TBA (Thiobarbituric acid) 법을 이용하여 측정하였다. 실험군은 소정농도의 검액 10μℓ에 2μg/μℓ LDL (Sigma사로부터 구입) 10μℓ, 150mM sodium chloride 470 lA, 100 p, M copper sulfate 10μℓ를 넣었다.

성능/효과

Fig. 3에서 나타낸 것처럼 LDL 산화에 대한 억제효과는 처리농도 200 fig/vaZ 에서 GTC, EGCQ Trolox 및 BHT는 각각 87.2%, 89.3%, 90.6%, 89.0%로서 높게 나타났으며 모든 녹 차추출물들도 90% 이상의 억제효과를 나타내었다. 녹차추출 물들의 활성비교에서는 큰 차이는 아니지만 우전, 세작, 중작 등에서 다소 높았고 엽차는 다소 낮은 편이었다.
LDL 산화억제효과에서는 큰 차이는 없었지만 녹차의 우전이나 세작 등 어린잎으로 제조된 녹차에서 활성이 컸다. GTC, EGCQ Trolox, BHT도 200 μg/mℓ 처리농도에서 90% 이상 억제효과가 나타났다. Zhu 등에 의하면 녹차 폴리페놀들이 기존의 항산화제들보다 LDL 산화에 더 강력하게 억제효과를 나타내었다고 보고 한 바 있다.
0μg/μℓ)에서 농도의존적으로 프리라디칼소거작용을 나타내었다. GTC와 EGCG는 프리라디칼소거능이 가장 높게 나타났으며, 합성항산화제인 Trolox와 BHT(data not shown)의 프라디칼소거능은 낮은 편이었다. 녹차추출물은 우전, 세작, 중작, 입하, 엽차의 순으로 활성이 나타났다.
6에 H2O2 유도 DNA 손상에 대한 억제효과를 나타내었다. H2O2 단독처리군에 비하여 모든 시험대상물질들은 tail length (TL) 및 olive tail moment (OTM)로 나타낸 DNA 손상을 억제시켰다. TL로서 비교하였을 때 GTC, EGCQ Trolox는 각각 46.
LDL 산화억제효과에서는 큰 차이는 없었지만 녹차의 우전이나 세작 등 어린잎으로 제조된 녹차에서 활성이 컸다. GTC, EGCQ Trolox, BHT도 200 μg/mℓ 처리농도에서 90% 이상 억제효과가 나타났다.
4%의 억제효과를 나타내었 으며 모든 녹차추출물들도 38% 이상의 억제효과를 나타내었다. OTM으로서 비교하였을 때 GTC, EGCG, Trolox는 각각 52.3%, 33.3%, 33.8%의 억제효과를 나타내었으며 모든 녹차추출물들도 39% 이상의 억제 효과를 나타내었다.
H2O2 단독처리군에 비하여 모든 시험대상물질들은 tail length (TL) 및 olive tail moment (OTM)로 나타낸 DNA 손상을 억제시켰다. TL로서 비교하였을 때 GTC, EGCQ Trolox는 각각 46.8%, 56.2%, 25.4%의 억제효과를 나타내었 으며 모든 녹차추출물들도 38% 이상의 억제효과를 나타내었다. OTM으로서 비교하였을 때 GTC, EGCG, Trolox는 각각 52.
4에 나타낸 것처럼 녹차추출물들의 처리농도 50μg/mℓ 및 100μg/mℓ 에서 거의 세포독성을 나타내지 않았다. Trolox, EGCG 및 GTC 등 대조물질들도 세포독성을 나타내지 않았으나 BHT는 다른 시험물질들보다 세포독성이 크게 나타났다. 녹차추출물들은 낮은 처리농도인 50μg/mℓ에서 오히려 세포증 식작용이 나타났다.
대부분의 폴리페놀 성분들은 각기 킬레이트생성능에는 차이가 있지만 Fe?+를 킬레이트하여 간접적인 항산화작용을 갖게 된다. Trolox나 BHT는 프리라디칼 소거능은 크지 않았고 LDL산화에 대한 억제 효과는 컸으며 GTC 및 EGCG와 녹차추출물들은 DPPH 라디 칼소거작용도 컸으며 LDL 산화에 대한 억제효과도 컸다. 따라서 녹차추줄물들은 redox potential과 chelating capacity에 기인한 프리라디칼 소거 및 항산화능을 모두 갖고 있는 것으로 판단된다.
3% 정도의 분포를 나타내었다. 가장 이른 시기에 수확되는 고급 차인 우전, 세작, 중작을 비교할 때 함량은 우전 > 세작 > 중작 순이었다. 본 연구에서는 수확시기가 다른 시판녹차의 에탄올추출물, 녹차추출 물의 정제조성물인 녹차카테킨 (GTC)와 주성분인 EGCG의 프리라디칼 소거작용과 항산화작용 및 이에 의한 산화적 세포독성 억제효과 및 DNA 손상억제효과 등을 검토하였다.
또한, 우전, 세작과 중작 같은 이른 시기에 수확되는 어린잎에서 다소 강한 프리라디칼 소거능이 나타나는 것으로 보인다. 가장 이른 시기에 수확되는 고급 차인 우전, 세작, 중작을 비교할 때 활성은 우전 > 세작 > 중작 순이었다.
녹차 추출물들의 활성 비교에서는 프리라디칼 소거 능이나 LDL 산화억제경향과는 다소 다르게 나타났다. 큰 차이는 아니지만 입하와 엽차에서 다소 높았으며 우전, 세작, 중작 등에서 다소 낮은 편이었다.
녹차추출물들은 200μg/mℓ 에서 거의 세포독성이 나타나지 않았으며 GTC, EGCG, Trolox등도 같은 조건에서 세포독성을 나타내지 않았다. 그러나 합성항산화제인 BHT는 세포독성을 크게 나타내었다.
그러나 BHT는 억제활성이 나타나지 않고 오히려 세포독성이 크게 나타났다. 녹차추출물들의 억제활성은 Trolox와 비슷하였으며 수 확시기별 녹차추출물들 사이의 특징적인 차이는 나타나지 않았다. 가장 이른 시기에 수확되는 고급 차인 우전, 세작, 중작을 비교할 때 활성은 우전 > 세작 > 중작 순이었다.
, 2004). 따라서 본 연구에 사용된 녹차들의 수확시기가 이른 고급차종들인 우전, 세작, 중작 등 에서는 어린잎들이 채취되기 때문에 Fig. 1에 나타낸 것처럼 총폴리페놀함량은 우전 > 세작 > 중작 순으로 낮아지다가 기온이 높아지는 입하 이후에 채취되는 입하나 8월까지 채취되는 엽차 중에는 다시 총폴리페놀함량이 높아지는 것 같다.
한편, 가장 이른 시기에 수확되는 고급 차인 우전, 세작, 중작을 비교할 때 활성은 비슷하였다. 따라서 입하 이전에 수확되는 첫물차들은 채취시기가 이를수록 총폴리페놀함량도 높고 이에 따른 항산화활성도 크다고 보여지며 기온이 상승하는 시기에 수확되는 두물차 이후 차들은 다시 총폴리페놀함량이 증가하고 이에 따른 항산화 활성이 커지는 biphasic한 함량 및 활성의 경시적 변화를 보일 수 있는 것으로 사료된다.
정 제된 녹차카테킨인 GTC의 함량이 40%로 가장 높았으며 우전, 세작, 입하, 중작, 엽차 순으로 감소되었다. 모든 녹차에탄올추 출물에서 약 25% 이상의 높은 총폴리페놀함량을 나타내었다. 우전이나 세작처럼 비교적 이른 시기에 채취되는 어린잎들에서 총폴리페놀함량이 높은 경향으로 나타났고 입하도 다소 높게 나타났으며 녹차추출물들은 24.
이 같은 활성의 순서는 총폴리페놀함량의 순서와 비슷한 경향을 나타내었다. 본 실험은 DPPH free radical의 소거능에 관한 실험으로서 DPPH radicale hydroxyl radical과 비슷한 거동을 하는 바 EGCG4- 다량 함유하고 있는 GTC와 녹차추출물들은 강한 프리라디칼 소거능이 있는 것으로 판단되었다. 또한, 우전, 세작과 중작 같은 이른 시기에 수확되는 어린잎에서 다소 강한 프리라디칼 소거능이 나타나는 것으로 보인다.
모든 녹차에탄올추 출물에서 약 25% 이상의 높은 총폴리페놀함량을 나타내었다. 우전이나 세작처럼 비교적 이른 시기에 채취되는 어린잎들에서 총폴리페놀함량이 높은 경향으로 나타났고 입하도 다소 높게 나타났으며 녹차추출물들은 24.7%-32.3% 정도의 분포를 나타내었다. 가장 이른 시기에 수확되는 고급 차인 우전, 세작, 중작을 비교할 때 함량은 우전 > 세작 > 중작 순이었다.
GTC는 녹차 (채취시기 미상, 전남 보성산) 350 g을 약 80℃의 열수로 추출하고 농축한 후 ethyl acetate로 추출하고 Sephadex LH-20 column을 사용하여 물과 아세톤으로 용출시켜 황색결정을 얻어 사용하였다(Yun, 1996). 이 녹 차카테킨 (GTC)은 HPLC분석 결과 (-)-epigallocathechin gallate (EGCG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin gallate (ECG)와 (-)-epicatechin (EC)을 다량 함유하고 있으며, 이 중에서 EGCG가 약 60% 정도로 가장 많이 함유되어 있었다 (Data not shown).
이런 결과들로 보아 녹차추출물들은 BHT와는 달리 자체세포 독성도 없으며 활성산소라디칼에 의한 세포독성을 경감시키는 작용이 있는 안전한 항산화물질로 판단되었다.
1에 나타내었다. 정 제된 녹차카테킨인 GTC의 함량이 40%로 가장 높았으며 우전, 세작, 입하, 중작, 엽차 순으로 감소되었다. 모든 녹차에탄올추 출물에서 약 25% 이상의 높은 총폴리페놀함량을 나타내었다.
본 연구에서는 수확시기가 다른 시판녹차의 에탄올추출물, 녹차추출 물의 정제조성물인 녹차카테킨 (GTC)와 주성분인 EGCG의 프리라디칼 소거작용과 항산화작용 및 이에 의한 산화적 세포독성 억제효과 및 DNA 손상억제효과 등을 검토하였다. 총폴리 페놀함량 중 GTC는 Sephadex 컬럼크로마토그래피로 정제한 조성물이기 때문에 40%의 높은 함량을 나타내었다. 녹차의 건조물 중의 총폴리페놀함량은 20-35% (Xiao, 1994)이며 녹차의 물추출물 중의 총폴리페놀함량는 50-70% (Caffin et al.
, 2005). 한편, 시판 녹차들에서는 우전이나 세작처럼 비교적 이른 시기에 채취되는 어린잎들에서 총폴리페놀함량이 대체로 높은 경향으로 나타났다 (Fig. 1). Bhatia 등에 의하면 녹차 flavanol함량에 있어서 싹(bud), 첫째 잎(first leaf), 둘째잎 (second leaf), 셋째잎 (third leaf), 윗줄기 (upper stem), 아랫줄기 (lower stem) 순으로 낮아졌으며 건조물로서 5.

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Yun YP, Kang WS, Lee MY (1996) The antithrombotic effects of green tea catechins. J. Fd. Hyg. Safty 11(2):77
Zhang A, Zhu QY, Luk YS, Fung KP, Chen ZY (1997) Inhibitory effects of jasmine green tea epicatechin isomers on free radical-induced lysis of red blood cells. Life Sci. 61:384
Zheng W, Wang SY (2001) Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. J. Agric. Food Chem. 49:5165-5170

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Zhu QY, Huang Y, Tsang D, Chen ZY (1999) Regeneration of a-tocopherol in human low-density lipoprotein by green tea catechin. J. Agric. Food Chem. 47(5):2020-2025

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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