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제안 방법
- 골수도말 표본의 관찰 - 마우스 1개체당 1000개의 적혈구에서 다염성적혈구(poly-chromatic erythrocyte, PCE)와 정염 성적 혈구(normochromatic erythrocyte, NCE)의 비를 구하고 다시 1000개의 다염성적혈구중에서 소핵을 갖는 다염성적혈구의 출현빈도를 구하였다. 소핵이라 생각되는 과립이 세포 내에 있는 경우 초점을 상하로 움직여 확인하며 이때 백색광을 나타내지 않는 것을 소핵으로 간주하였다.
- 골수세포표본의 제작 - 예비시험에 의해 얻어진 결과에 따라 시험적용 최고농도를 1/2씩 3단계의 농도를 설정 투여한 후 Schmid의 방법에 따라 골수세포 표본을 제작하였다. 즉, 마우스를 경추탈골에 의하여 도살시킨 후, 양쪽 대퇴골로부터 1 ml의 Calf serum을 주입시킨 주사기 (24 gauge침 사용 )를 이용하여 골수를 채취한 후 골수세포 부유액을 1000 rpm 에서 5분간 원침하였다.
- 군 분리 및 식별 -순화기간을 거친 모든 동물의 체중을 측정, 소정의 범위에 드는 동물을 무작위로 각 시험군에 6 마리씩 배분하였고, 각 시험군의 식별은 cage별 tag 표시법을 이용하였다.
- 따라서, 인체섭취를 위한 안전성의 확보가 시급한 형편으로 각종 독성시험의 필요성이 증대되고 있는 현실이다. 김 등은 GS95가 4주 아급성독성 시험에서 5g/kg/day의 용량까지 안전하다고 보고한 바 있어°, 본 연구에서는 급성독성 시험 자료를 바탕으로 하여, 국립독성연구원의 「의약품 등의 독성시험기준」및 「독성시험 표준작업지침서」의 유전 독성시험법에 따라 복귀돌연변이시험 , 염색체이상시 험 , 소핵시험을 실시하였다2).
- 대사활성 존재 하에서의 시험 -S-9 mixture(20%, v/v), 시험물질 및 양성대조물질이 포함된 배양액으로 6시간 배양한 후 보통의 배양액으로 교환하여 16시간 동안 더 배양한 후 colcemid를 처리하였다.
- 대조물질 -음성대조물질로는 시험물질의 용매로 사용한 증류수를 경구투여 하였고, 양성대조물질로는 Mitomycin C 를 증류수에 녹여 복강내 투여하였다.
- 또한 무처리 대조군, 용매대조군, 그리고 양성대조군을 두었으며, 대사활성부재 (without S-9 mixture) 및 존재 (with mixture)하로 구분하여 시험하였다.
- 2 wn filter를 통과시킨 후 사용하였다. 시험농도의 설정은 S. typhimurium TA100을 이용한 예비독성시험을 통하여 이루어졌다.
- 염색체이상시험 - 예비독성시험에서 결정된 50% 증식 억제농도를 최고 농도로 하고 공비 2로 3단계의 농도를 설정하였다. 또한 무처리 대조군, 용매대조군, 그리고 양성대조군을 두었으며, 대사활성부재 (without S-9 mixture) 및 존재 (with mixture)하로 구분하여 시험하였다.
- 염색체이상시험 결과의 판정 - 광학 현미경하에서 1000배의 배율로 각 시험군당 100개의 잘 펴진 분열 증기 상을 관찰한 다음 처리군에 대한 구조이상의 총 출현빈도를 다음과 같은 판정기준에 따라 판정하였다6).
- 이와 같이 처리한 plate 를 Inverted microscope로 관찰하여 50% 증식억제 농도를 추정하였다. 이상과 같은 방법으로 얻어진 약 50% 증식억제농도를 기준으로 공비 2로 3단계의 농도를 설정하여 본 실험을 하였다. 세포독성이 전혀 관찰되지 않은 경우에는 10 mM 또는 5mg/ml을 최고농도로 하였다.
- 고정이 끝나면 공기 중에서 완전히 건조시킨 후 5% Giemsa 염색액으로 15분간 염색한 후 증류수로 세척하고 건조시켰다. 이와 같이 처리한 plate 를 Inverted microscope로 관찰하여 50% 증식억제 농도를 추정하였다. 이상과 같은 방법으로 얻어진 약 50% 증식억제농도를 기준으로 공비 2로 3단계의 농도를 설정하여 본 실험을 하였다.
- 즉, 마우스를 경추탈골에 의하여 도살시킨 후, 양쪽 대퇴골로부터 1 ml의 Calf serum을 주입시킨 주사기 (24 gauge침 사용 )를 이용하여 골수를 채취한 후 골수세포 부유액을 1000 rpm 에서 5분간 원침하였다. 상층액을 제거하고 적당한 양으로 골수세포의 현탁액을 만들어 한 방울을 세척된 슬라이드에 적하시킨 후 도말하고 풍건시킨 후 메탄올에 5분간 고정하였다.
- 투여 량과 표본제작시기의 결정을 위한 예비시험 - 본 시험에서의 시험물질 투여 량은 GS95의 급성독성시험 결과를 근거로 설정하였으며 1 ml 용량의 일회용 주사기와 26gauge 주사침을 사용하여 10ml/kg으로 본 시험물질의 실제적인 투여경로에 맞추어 경구투여하고 채취시간을 24시간, 48시간으로 하여 골수도말 표본을 제작하고 광학현미경(X1000)하에서 1000개의 다염성적혈구에서 소핵출현 빈도수를 계수하여 소핵출현 빈도수가 가장 많은 시간을 표본 제작 시기로 하였다.
- 투여 후 24, 48시간에 소핵표본을 제작, 관찰한 결과 유의할 만한 차이를 나타내지 않아 본 시험에서의 표본 제작 시기는 투여 후 24시간으로 결정하였다.
- 상층액을 제거하고 적당한 양으로 골수세포의 현탁액을 만들어 한 방울을 세척된 슬라이드에 적하시킨 후 도말하고 풍건시킨 후 메탄올에 5분간 고정하였다. 표본은 각 동물당 2매씩 제작하였고 고정 건조시킨 후 4% Giemsa 염색시약에 슬라이드를 30분간 염색시켰다.
- 5 X105 cells/2ml이 되도록 파종하고 37°C에서 24시간 배양한 후 60~80%의 성장상태를 보이면 Dulbeco phosphate buffer saline(DPBS) 2 ml로 세척하였다. 한 농도당 4개의 well을 할당하여 시험물질을 5단계까지의 농도로 10배씩 희석한 후 배양액에 가하여 처리하고 6번째 well은 무처리 대조군으로 하였다. 37°C CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 DPBS 2 ml로 2회 세척하고 methanol 2 ml로 고정시켰다.
대상 데이터
- 대조물질 - 본 시험에 사용한 음성대조물질로는 시험물질의 용매로 사용한 인산완충액을, 양성대조물질로는 대사활성부재하의 시험계에서는 Sodium azide, 2-Nitrofluorene, 9-Aminoacridine, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)를 대사활성존재하의 시험계에서는 2-Aininofluorene, 2-AminoanthraceneS" 각각 사용하였다. Sodium azide의 경우는 증류수를, 그 외의 물질들에 대해서는 Dimethylsulf oxide (DMSO)를 용매로 사용하였다.
- 각각 사용하였다. Sodium azide의 경우는 증류수를, 그 외의 물질들에 대해서는 Dimethylsulf oxide (DMSO)를 용매로 사용하였다.
- 대조물질 - 음성제조물질로는 시험물질의 용매인 Phosphate buffered saline(pH 7.4)을, 양성대조물질로는 대사활성 조건하에서는 Benzo(a)pyrene을 Dimethylsulfoxide에 용해 시켜 사용하였으며, 대사활성 부재 하에서는 Mitomycin C를 멸균증류수에 용해시켜 사용하였다.
- 본 시험에 사용되는 Minimal agar plate는 Bacto agar 15 g을 증류수 930 ml에 가하여 autoclave한 것에 멸균된 Vogel-Bonner E 배지(1 liter당 MgSO4, 7H2O 10g, Citric acid monohydrate 100g, K2HPO4 500g, NaNH2PO4, 4H2O 175 g) 20 ml, 과 멸균된 40% Glucose 50 ml을 가하여 제조하였다. 또한 균주를 증층 배양하기 위하여 Top agar를 autoclave하여 제조한 후 시험 직전에 멸균된 0.
- 동물은 순화 및 시험 기간 중에 polycarbonate cage에 6마리씩 넣어 사육하였다. 사료는 삼양사의 고형사료를, 물은 수돗물을 자유로이 공급하였다.
- 시험균주 - 시험에 사용한 균주인 Salmonella typhimurium TA1535, TA1537, TA98, TA100은 서울대학교 약학대학에 서 계대 보존중인 것을 사용하였다.
- 실험동물 및 시험물질의 투여 -다물실업에서 분양받은 ICR 마우스를 사용하였으며, 동물 입수후 약 1주일간의 순화 기간을 거쳐 건강한 동물만을 시험에 사용하였다. 실험동물의 사육은 온도 25±1°C, 습도 55 ±5%, 조도 300〜500 Lux로 12시간 자동 점.
- 포유류 배양 세포주 - 본 시험에서 사용한 Chinese hamster lung fibroblast (CHL)는 서울대학교 약학대학에서 계대 보존중인 것을 사용하였다、
데이터처리
- 적용하여 결과를 분석하였다. 1단계에서는 Hayashi 등이 제시한 음성 및 양성대조군에 대한 배경 data와 비교해 보았고7), 2단계에서는 각 처리군의 MNPCE(micronucleated poly-chromatic erythrocyte) 출현빈도를 음성대조군의 비교자료로부터 추정하여 2항분포를 통하여 검정을 하였고 여기에서 유의한 차이를 나타내면 3단계로서 음성대 조군과 시험물질 처리군의 결과에 대해서 용량 반응 관계가 있는가를 Cochran Armitage 경향검정을 통하여 추정하였다 (유의수준 0.05).
이론/모형
- S-9 mixture의 제조 -Tw vitro 에서의 대사활성화를 위하여 Maron 및 Ames (1983)의 방법에 따라 S-9 fiaction을제조하여 사용하였다3).
- 복귀 변이시험 - S.typhimuriumi: 이용한 복귀변이시 험은 Maron 및 Ames (1983)의 방법에 따라 수행하였으며 비교적 감도가 좋은 pre-incubation법을 사용하였다. 즉, 균액 0.
- 통계학적 평가 一Hayashi 등의 방법에 따라 3단계의 통계처리법을 적용하여 결과를 분석하였다. 1단계에서는 Hayashi 등이 제시한 음성 및 양성대조군에 대한 배경 data와 비교해 보았고7), 2단계에서는 각 처리군의 MNPCE(micronucleated poly-chromatic erythrocyte) 출현빈도를 음성대조군의 비교자료로부터 추정하여 2항분포를 통하여 검정을 하였고 여기에서 유의한 차이를 나타내면 3단계로서 음성대 조군과 시험물질 처리군의 결과에 대해서 용량 반응 관계가 있는가를 Cochran Armitage 경향검정을 통하여 추정하였다 (유의수준 0.
- 형질확인 및 시험 균주의 보관 - 분양받은 균주는 Maron 및 Ames (1983)의 방법에 따라 Histidine요구성, Crystal violet감수성, UV감수성, Ampicillin내성, 자발 복귀 돌연변이 수 등의 유전자형을 확인하고 Nutrient broth에서 37°C, 14 시간 배양한 후 배양액 당 10%(v/v)의 비로 DMSO를 가한 후 cryo tube에 분주하여 -75°C 냉동고에 보존하였다V
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