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문제 정의
- 본 연구는 노화가 진행되는 있다고 판단되는 40주령의 생쥐에게 홍삼 사포닌 화합물을 투여하여 생쥐 간에 미치는 항산화효소 활성과 지질 과산화에 미치는 항산화효과를 알아보기 위하여 실시하였다.
제안 방법
- 1 mM EDTA를 함유한 0.1M 인산완충액 (pH 7.0) 500卩1에 10卯1의 측정시료, 0.24U의글루타치온 reductase 100卩1와 10mM GSH 100 卩1를 넣고 전체 반응액에서 농도가 ImM이 되도록 NaN3을 첨가한 후 37C에서 10분간 반응시킨 다음 파장 340nm에서 3분 동안 NADPH의 농도변화를 측정하였다. 전체 반응은 위 반응액에 1.
- 전체 반응은 위 반응액에 1.5mM 压。2용액 를 가한 후 위와 같은 조건에서 5분간 흡광도 감소를 측정하였다. 비효소적 반응은 위와 동일한 조건으로 측정 시료 대신에 인산 완충액을 넣고 흡광도 변화를 측정하였으며, 다음과 같은 식에 의해 효소 활성도를 구하였다.
- total 글루타치온의 정량은 0.3mM NADPH/0.125M phosphate buffer(contain 6.3mM EDTA, pH 7.5) 용액 700卩1, 6mM DTNB용액 100nl와 200 Hi의 측정 시료를 혼합한 반응액을 3(TC로 조절되는 큐벳 홀더에서 4분간 안정화시킨 다음 412 nm에서 흡광도 변화를 1분간 측정하였다. 산화형글루타치온의 정량은 환원형 글루타치온을 제거하기 위해 측정시료와 2-viny}pyrindine(2-VP) 를 혼합(50:1, v:v)하여 60분간 방치한 다음 total 글루타치온과 동일한 조건에서 글루타치온 reductase(200kU/L) 용액을 2이11로 증가하여 반응 시켜 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 간 조직액의 10% 균질액 0.询1, 8.1% s odium dodecyl sulfate 용액 0.2ml, 20% 아세트산 용액(pH 3.5) 1.5祖와 0.8% TBA 용액 1.5ml 를 혼합하여 95X: 에서 1시간 동안 반응시킨 후, 즉시 냉각시키고, 力-butanol과 pyridine 혼합용액 (15 : 1, v:v)을 가하여 격렬하게 흔든 다음 원심분리(4, 000rpm. 10분)하여 얻은 상등액(유기층) 의 흡광도를 532的에서 측정하였으며’ 표준 검량선을 얻기 위하여 1, 1, 3, 3-tetra-methoxypropan e(TMP)을 사용하였다.
- 1ml /day, TS 분획과 PD, PT, G-Rd와 G-Re, C-K 는 생쥐 체중(kg)당 5mg을 5일간 경구투여 하였다. 경구투여 후 24시간 절식시킨 생쥐를 경추 탈구시킨 후, 간 조직을 적출하여 차가운 생리식염수로 세척한 다음 무게를 달고 간 조직은 얼음 결정상태의 생리식염수에 넣고 세절한 다음, 3회 수세하여 혈액을 제거하였으며, sucrose/EDTA (0.25M/lmM) 용액을 넣고 마쇄기로 분쇄하여 10% 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리 (20, 000xg, 20분)후 상등액을 시료로 하여, SOD, GPx 활성과 글루타치온 및 산화형 글루타치온, MDA 함량 측정시료로 사용하였다.
- 분류하였다. 대조군은 생리식염수만을 0.1ml /day, TS 분획과 PD, PT, G-Rd와 G-Re, C-K 는 생쥐 체중(kg)당 5mg을 5일간 경구투여 하였다. 경구투여 후 24시간 절식시킨 생쥐를 경추 탈구시킨 후, 간 조직을 적출하여 차가운 생리식염수로 세척한 다음 무게를 달고 간 조직은 얼음 결정상태의 생리식염수에 넣고 세절한 다음, 3회 수세하여 혈액을 제거하였으며, sucrose/EDTA (0.
- 따라서 본 연구에서는 생쥐의 연령이 증가함에 따라 생체내 항산화작용이 감소한다는 연구보고 24)에 주목하여 생쥐 스스로 항산화효소 활성이 감소되 면서 항산화 방어능력 을 상실 될 것으로 판단되는 연령을 10개월(40주)로 정하여, 흥 삼의 주요 활성성분인 total saponins (TS), ProtopanaxadioKPD), ProtopanaxatrioKPT), ginsenoside-Rd(G-Rd), ginsenoside-Re(G-Re), 그리고 장내세균에 의한 생물 전환된 대사산물인 compound K(C-K)를 경구에 투여한 다음 SOD, CAT, GPx 등의 항산화 효소 활성과 환원형 글루타치온 함량, 산화형 글루타치온 함량, 지질과산화 최종산물인 malondialdehyde(MDA) 수준의 변화 간 조직에서 항산화 활성능력을 조사하였다.
- 5mM 压。2용액 를 가한 후 위와 같은 조건에서 5분간 흡광도 감소를 측정하였다. 비효소적 반응은 위와 동일한 조건으로 측정 시료 대신에 인산 완충액을 넣고 흡광도 변화를 측정하였으며, 다음과 같은 식에 의해 효소 활성도를 구하였다. 단위는 분당 산화된 NADPH nmole을 효소 활성으로 하였다.
- 5) 용액 700卩1, 6mM DTNB용액 100nl와 200 Hi의 측정 시료를 혼합한 반응액을 3(TC로 조절되는 큐벳 홀더에서 4분간 안정화시킨 다음 412 nm에서 흡광도 변화를 1분간 측정하였다. 산화형글루타치온의 정량은 환원형 글루타치온을 제거하기 위해 측정시료와 2-viny}pyrindine(2-VP) 를 혼합(50:1, v:v)하여 60분간 방치한 다음 total 글루타치온과 동일한 조건에서 글루타치온 reductase(200kU/L) 용액을 2이11로 증가하여 반응 시켜 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 생쥐 7마리를 1군으로 하여 대조군, TS, PD, PT, G-Rd, G-Re 및 C-K 투여군 등 총 7개 군으로 분류하였다. 대조군은 생리식염수만을 0.
- 측정하였다. 시험관에 50mM 인산 완충액 (containing O.lmMEDTA, pH=7.8) 990% 증류수 17山 시료 17此 5比M xanthine 17卩1를 넣은 후 1加의 xanthine oxidase(시료를 가하지 않은 반응에서 흡광도 증가가 550師에서 분당 0.025 이상이 되도록 조절한 후)를 가한 다음 25t, 550啲에서흡광도를 측정하여 SOD 활성도를 구하였다. SOD 활성도는 위의 조건에서 cytochrome c의 환원 속도를 50% 억제하는 효소의 양을 1 unit로 표시하였다.
- 25M/lmM) 용액을 넣고 마쇄기로 분쇄하여 10% 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리 (20, 000xg, 20분)후 상등액을 시료로 하여, SOD, GPx 활성과 글루타치온 및 산화형 글루타치온, MDA 함량 측정시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 용한 cytochrome c, glutathione reductase, sodium dodecyl sulfate(SDS), 5, 5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), pyridine 등은 Sigma 특급을 사용하였으며 sucrose 및 H2SO4 등 기타 시약은 일반 특급시약을 사용하였다. 또한 실험에 사용한 사포닌 시료인 총사포닌, PD계 및 PT계 사포닌, 진세노사이드 및 사포닌 대사체인 C-K 는 한국인삼연초연구원으로부터제공받아 사용하였다.
- 실험동물은 40주령의 ICR계 수컷 생쥐이고, 24±4°C로 유지된 사육실에서 상품화된 생쥐용 사료와 물을 자유롭게 먹이면서 적응시킨 체중 30〜35g의 생쥐를 선별하여 사용하였다. 실험에시.
데이터처리
- 모든 실험결과의 통계처리는 SPSS 7.5.2의 대웅표본 T검정 (Paired samples t-test)을 사용하여 상호 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Flohe와 Otting%>의 방법에 준하여 측정하였다. 시험관에 50mM 인산 완충액 (containing O.
- GPx 활성은 Flohe 둥26)의 방법에 따라 측정하였다. 1 mM EDTA를 함유한 0.
- 간 조직에서의 total 글루타치온(GSH+2GSSG) 과 산화형 글루타치온 함량은 Tietze의 방법을 변형한 Griffith”>의 방법에 의해 측정하였다. total 글루타치온의 정량은 0.
- 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 사용한 Lowry 등烈)의 방법에 따라 측정하였다.
- 지질과산화 수준은 Ohkawa 등狗의 방법을 사용하여, thiobarbituric acid(TBA)법에 의해 즉정하였다. 간 조직액의 10% 균질액 0.
성능/효과
- 40주령 생쥐에 TS, PD, PT, G-Rd, G-Re 및 C-K를 투여한 다음 SOD 활성을 측정한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 대조군에서의 SOD 활성도는 74.09土8.54 U/mg protein 이었으며, 모든 홍삼 사포닌 투여군에서 증가하였다. 이 중 PD 투여군에서는 대조군의 활성에 비하여 18.
- GPx 의 활성은 PD에서 가장 큰 활성을 보였으나 유의성은 없었으며, PT, G-Rd 및 C-K에서 유의성 있는 활성의 증가를 나타냈다. 글루타치온 함량은 TS, PD 및 G-Rd 투여군에서 유의성 있는 증가를 보였다.
- GPx 활성도를 측정한 결과는 Fig. 2와 같이 대조군에서의 활성은 L99±0.08 U/mg protein이었으며, 홍삼 분획물 투여군의 GPx의 활성는 대조군에 비하여 전반적으로 증가시키고 있다. 홍삼 분획물 중 PD 투여군은 대조군에 비하여 18.
- GPx 활성은 홍삼 분획물 PD 투여군이 PT 투여군보다 대조군의 활성에 대하여 6.53% 증가하였고, G-Rd는 G-Re 투여군보다 6.03% 증가하였다. 그러나 대조군에 대하여 모든 투여 군에서 유의성(pO.
- 활성도는 모두 증가하였다. SOD 활성은 PD 투여군에서 유의성 있는 증가를 보였고, GPx 활성도는 PD>G-Rd>PT>G-Re>C-K>TS 순으로 감소하였으며, PT 투여군을 제외한 모든 투여군에서 유의성(p<0.01)이 인정되었다. 글루타치온 함량은 모든 투여군에서 증가하였으며, G-Rd 와 PD, TS 투여군에서 유의성 있게 증가하였다.
- GPx 의 활성은 PD에서 가장 큰 활성을 보였으나 유의성은 없었으며, PT, G-Rd 및 C-K에서 유의성 있는 활성의 증가를 나타냈다. 글루타치온 함량은 TS, PD 및 G-Rd 투여군에서 유의성 있는 증가를 보였다. 홍삼 분획물의 투여가 분획물의 종류에 따라서 항산화 효소의 활성 변화와 비효 소계 항산화 물질인 글루타치온 함량 변화 및 지질 과산화 최종 산물인 MDA 함량의 변화를 가져온 것은, 사포닌에 함유되어 있는 여러 성분들의 조화를 통한 정상화 효과와 아울러 G-Rd, G-Re와 같은 단일 성분이 직접적으로 효소를 활성화하고, 유리기 소거제인 항산화물질의 증가를 유도하여 나타난 결과라고 생각된다.
- 01)이 인정되었다. 글루타치온 함량은 모든 투여군에서 증가하였으며, G-Rd 와 PD, TS 투여군에서 유의성 있게 증가하였다. 지질과산화의 최종산물인 MDA 수준은 홍삼 사포닌의 투여로 감소되었으며, G-Rd 투여군에서만 유의성(P<0.
- 대조군에서 산화형 글루타치온의 함량은 0.49±0.02 nmol/g liver이었으며, PD와 G~Rd 투여군은 대조군의 함량에 비하여 각각 10.20% 감소하였으며, 모든 홍삼 사포닌 투여군에서는 대조군의 함량에 대하여 통계적으로 유의성 있는 감소를 나타냈다.
- 대조군에서 환원형 글루타치온 함량은 Fig. 3에서 보는 바와 같이 4.55±0.31umol/g liver이었으며, 홍삼 사포닌 투여군 모두 증가하였다.
- Ol) 있는 변화가 인정되었으나, TS 투여군에서는 인정되지 않았다. 또한 PD와 G-Rd 투여군이 PT와 G-Re 투여군보다 GPx 활성도는 다소 증가한 것으로 나타났으나 상호간에 유의성은 인정할 수 없었다.
- 갖고 있음을 알 수 있었다. 또한 내인성 항산화 물질인 글루타치온의 생성을 촉진시켜 지질 과산화를 억제하는 기능도 가지고 있음을 알 수 있었다. 홍삼 사포닌 화합물은 40주령의 생쥐 간에서 생성되는 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 생체를 보호하는 효과가 있고, 특히 홍삼 사포닌 중에서도 PD와 G-Rd는 생쥐의 간에서 항산화 효소 활성을 더욱 증가시켰고, 지질과산화억제 효과를 더욱 증진시키는 것으로 확인되었다.
- 또한 이러한 홍삼 분획물의 항산화 작용으로 인하여 활성산소에 의한 생체의 방어력의 향상과 더불어 지질과산화 억제력이 일시적으로 증가한 것으로 판단되었다.
- 증가되었다. 사포닌 분획물의 종류별로 SOD 활성을 비교해 보면, PD 투여군은 PT 투여군보다, G-Rd 투여군은 G-Re 투여군보다 SOD 활성이 비교적 높게 나타났다. 이것은 PD 투여군이 TS, PT 투여군과는 달리 Cu, Zn-SOD 함량을 증가시킨다는 보고, ", 4。)산화적 스트레스에 대항하여 G-Rd 투여군이 SOD 활성을 증가한다는 보고, 12, 39)와도 일치하는 결과를 보였다.
- 산화형 글루타치온의 함량은 Fig. 4에서 보는 바와 같이 흥삼 분획물의 투여로 산화형 글루타치온의 함량은 환원형 글루타치온 함량과 상반되는 경향으로 감소하였다.
- 11% 높은 SOD 활성도를 나타냈다. 상호 유의성을 검정한 결과, SOD 활성이 가장 높은 PD 투여군 만이 유일하게 유의성(p<0.01) 있는 증가를 나타냈고, 그 이외의 투여군에서는 유의성을 보이지 않았다.
- 성 둥은 4주령의 생쥐에 홍삼 분획물 PD, PT 를 투여하여 대조군에 비하여 SOD 활성을 유의성 있게 증가한다고 보고物하였는데, 본 연구에서 40주령의 생쥐에게 5일 동안 사포닌 분획물을 투여한 결과, SOD 활성은 PD 투여에서만 유의성 있게 증가되었다. 사포닌 분획물의 종류별로 SOD 활성을 비교해 보면, PD 투여군은 PT 투여군보다, G-Rd 투여군은 G-Re 투여군보다 SOD 활성이 비교적 높게 나타났다.
- 이상의 결과로부터 40주령의 생쥐 간에서 홍삼 사포닌 화합물은 항산화효소의 활성을 증가 또는 촉매하여 활성산소들을 효율적으로 제거하는 기능을 갖고 있음을 알 수 있었다. 또한 내인성 항산화 물질인 글루타치온의 생성을 촉진시켜 지질 과산화를 억제하는 기능도 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 홍삼 분획물은 40주령의 생쥐의 간에서 항산화효소의 합성 증가를 유도하거나 항산화효소의 활성을 촉매하여 생체 내에서 생성하는 활성산소를 효율적으로 소거하는 소거제로서의 기능을 갖고 있을 뿐 아니라, 지질과산화작용을 효과적으로 억제한 것으로 보아 비효소적 항산화작용을 나타내는 글루타치은이나 알부민과 같은 내인성 항산화 물질의 합성능력을 강화하는 작용을 하고 있는 것으로 생각되었다. 또한 이러한 홍삼 분획물의 항산화 작용으로 인하여 활성산소에 의한 생체의 방어력의 향상과 더불어 지질과산화 억제력이 일시적으로 증가한 것으로 판단되었다.
- 지질과산화물인 MDA 수준을 즉정한 결과는 Fig. 5에서 보는 바와 같이 대조군에서의 MDA 함량은 77.52±6.44 nmol/g wet liver이었으며, 각 홍삼 사포닌 투여군에서 MDA 수준은 대조군에 비하여 감소함을 나타냈다. 홍삼 사포닌 PD 투여군은 대조군의 함량에 비하여 23.
- 글루타치온 함량은 모든 투여군에서 증가하였으며, G-Rd 와 PD, TS 투여군에서 유의성 있게 증가하였다. 지질과산화의 최종산물인 MDA 수준은 홍삼 사포닌의 투여로 감소되었으며, G-Rd 투여군에서만 유의성(P<0.05) 있게 감소하였다.
- 한편 PD와 PT 투여시 SOD 활성도를 비교해보면 PD 투여군이 PT 투여군보다 11.18% 차이만큼 증가하였고, G-Rd와 G-Re투여군에서는 G-Rd가 G-Re 투여군에 비하여 7.11% 높은 SOD 활성도를 나타냈다. 상호 유의성을 검정한 결과, SOD 활성이 가장 높은 PD 투여군 만이 유일하게 유의성(p<0.
- 홍삼 분획물 G-Rd 투여군에서는 대조군의 함량과 비교하여 약 11.87% 증가하였으며, TS와 PD 투여군에서는 각각 9.67%와 10.55% 증가하여 모두 유의성 (p<0.01) 있게 증가하였다. 홍삼 분획물 PD 투여군에서 PT 투여군 보다 환원형글루타치온 함량을 6.
- 01) 있게 증가하였다. 홍삼 분획물 PD 투여군에서 PT 투여군 보다 환원형글루타치온 함량을 6.15% 증가하였고, G-Rd 투여군에서은 G-Re 투여군에 비하여 7.47%의 증가함을 나타냈다.
- 08 U/mg protein이었으며, 홍삼 분획물 투여군의 GPx의 활성는 대조군에 비하여 전반적으로 증가시키고 있다. 홍삼 분획물 중 PD 투여군은 대조군에 비하여 18.09% 로 가장 높은 효소활성을 나타내었다.
- 44 nmol/g wet liver이었으며, 각 홍삼 사포닌 투여군에서 MDA 수준은 대조군에 비하여 감소함을 나타냈다. 홍삼 사포닌 PD 투여군은 대조군의 함량에 비하여 23.29%, G-Rd 와 TS 투여군에서는 각각 20.98%와 15.95% 감소하였고, C-K, PT, G-Re 투여군에서도 각각 11.86%, 10.57%, 6.74% 감소하는 경향을 나타냈다.
- 홍삼 사포닌 투여군에서 항산화 효소 SOD, GPx 활성도는 모두 증가하였다. SOD 활성은 PD 투여군에서 유의성 있는 증가를 보였고, GPx 활성도는 PD>G-Rd>PT>G-Re>C-K>TS 순으로 감소하였으며, PT 투여군을 제외한 모든 투여군에서 유의성(p<0.
- 또한 내인성 항산화 물질인 글루타치온의 생성을 촉진시켜 지질 과산화를 억제하는 기능도 가지고 있음을 알 수 있었다. 홍삼 사포닌 화합물은 40주령의 생쥐 간에서 생성되는 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 생체를 보호하는 효과가 있고, 특히 홍삼 사포닌 중에서도 PD와 G-Rd는 생쥐의 간에서 항산화 효소 활성을 더욱 증가시켰고, 지질과산화억제 효과를 더욱 증진시키는 것으로 확인되었다.
- 홍삼 사포닌의 종류에 따라서 산화형 글루타치온 함량의 변화 폭에 큰 차이를 보이지 않았지만, PD 투여군은 PT 투여군에 비하여, G-Rd 투여군은 G-Re 투여군에 비하여 산화형 글루타치온 함량을 감소함을 나타냈다.
- 05) 있게 감소하였고, 그 이외의 투여군에서는 유의성을 나타내지 않았다. 흥삼 사포닌 PD는 PT 투여군보다 MDA 수준을 12.72%, G-Rd 투여군은 G-Re 투여군보다 14.24% 감소함을 나타냈다.
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