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문제 정의
- 본 연구에서는 토양 분리균과 균주은행으로부터 분양받은 Rhodococcus 균 중에서 Fig. 1과 같이 4-chloro-3-hydroxy butyronitrile(CHBN)을 가수분해하여 4-chloro-3-hydroxy butyric acid(CHBAc)를 생성할 수 있는 균을 선별흐卜고 해당니트릴 분해효소의 특성을 조사하였다.
제안 방법
- 분당 20。(2의 속도로 증가시킨 후, 2분 동안 최종온도에서 유지하는 조건으로 GC분석을 수행하였다.
- CHBN 기질의 분해 정도를 정량적 으로 측정 하기 위 해 서기체 크로마토그래프] (GC) 분석을 수행하였다. 분리균 No.
- 방법으로 측정 하였다. CHBN 분해반응을 수행하고 원심분리하여 얻은 상등액 20 卩1를 실리카 유리판에 첨가하고 혼합용매 (hexane : ethyl acetate : acetic acid = 2:3: 0.5)를 이용하여 물질을 전개하였다. 전개된 유리판에 발색시약(9.
- 균주은행으로부터 분。J받은 균주 11개와 토양^서 분리된 균주 8개를 e-카프로락탐이 첨가된 LB배지에서 48시간 동안 배양하여 균체를 얻고, 이들 균체가 지닌 CHBN 분해 활성을 조사하였다(Table 1). 균체를 이용한 호소반응을 30。。에서 24시간 동안 수행하고 박막크로마토그래피를 이용해서 물질분석을 수행한 결과, 총 19개의 균주 중에서 3개가 CHBN 기질을 분해하여 (CHBAc)을 생성하는 것으로 밝혀졌다(Table 1, Fig.
- 수행하였다. PCR 반응을 다음 조건에서 수행하였다 (열변성, 95℃, 1분; 냉각, 43℃, 1분; 합성반응, 72℃, 2분). 합성된 DNA 조각의 아가로스 전기영동을 수행하고 젤로부터 예상하는 크기 (a-, 0서브유니트, 약 0.
- PCR 반응을 다음 조건에서 수행하였다(열 변성, 95℃, 1 분; 냉각, 50℃, 1분; 합성반응, 72℃, 1분). 반응액의 아가로스 전기영동을 수행하고 젤로부터 예상 크기 (약 1.
- R. erythropolis No. 5와 R. erythropolis No. 7 균이 CHBN 기질의 분해에 관여하는 것으로 예상되는 니트릴 히드라타아제와 아미다아제 유전자를 지니고 있는지를 확인하고 이들 유전자의 염기서열을 확인하기 위해서 PCR 클로닝을 수행하였다.
- R. erythropolis 균으로부터 이미 보고된 니트릴 히드라타아제 a-서브유니트와 0서브유니트 및 아미다아제 유전자를비교분석하여 [4, 8, 11] PCR 반응을 수행하기 위한 프리머를제작하고 분리균의 염색체에 대한 PCR 반응을 수행한 결과, 예상된 크기의 DNA 조각을 얻게 되었다. 확보된 DNA 조각의 염기서열을 분석하고 기존의 효소와 비교해 본 결과, 분리균 No.
- Rhodococcus 속의 세균이 생산하는 니트릴 히드라타아제 a■서브유니트, [3■서브유니트과 아미다아제의 서열을[4, 8, 11] 비교분석하여 얻어진 공통의 염기서열을 이용하여 디자인한프리머(니트릴 히드라타아제 a-서브유니트, F-5'-GATCCA- TATGTCAGTAACGATCGAC-3', R-5'-GATCGAATTCGA- CGGTGGGGACCTG-3'; 니트릴 히드라타아제 伊서브유니트, F-5'-GATCCATATGGATGGAGTACACGAT-3', R-5'-GAT- CGAATTCGGCCGCAGGCTCGAG-3'; 아미다아제, F-5'- GATCCATATGGCGACAATCCGACCT-3', R-5'-GATGAA- TTCAAGGCGGGGCTGAGTTG-3'X 이용흐]■여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응을 다음 조건에서 수행하였다 (열변성, 95℃, 1분; 냉각, 43℃, 1분; 합성반응, 72℃, 2분).
- 균 현탁액에 CHBN 기질 10 piL를 첨가하고 30℃에서 24시간 동안 반응시킨 후, 박막크로마토그래피 (TLC) 방법을 통해 CHBN 기질과 분해산물을 분석하였다. TLC 결과로부터 CHBN 기질을 분해하여 산(CHBAc)를 생성하는 균주를 선발하였다.
- 5)에 현탁하고, 초음파로 분쇄하여 세포추출액을 제조하였다. 각 세포추출액의 단백질 농도를 Bradford 방법으로 정량한 후, 세포추출액 0.1 mL와 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 0.1 mL를 섞고 CHBN 기질 20 皿 를 첨가한 후, 3UC에서 회전시키며 반응을 수행하였다. 일정한 시간동안(0, 0.
- 4 mL 부피의 10 mM 인산칼륨 완충용액 (pH 15)으로현탁하였다. 균 현탁액에 CHBN 기질 10 piL를 첨가하고 30℃에서 24시간 동안 반응시킨 후, 박막크로마토그래피 (TLC) 방법을 통해 CHBN 기질과 분해산물을 분석하였다. TLC 결과로부터 CHBN 기질을 분해하여 산(CHBAc)를 생성하는 균주를 선발하였다.
- 분리균의 CHBN 분해효소는 £-카프로락탐에 의해서 발현이 유도되었으며, 균체와 세포 추출액에서 모두 기질 분해활성을 나타났다. 기존에 보고된 효소의 유전자 염기서열로부터 프리머를 제조하고 PCR을 수행함으로써 분리균.으로부터 니트릴 히드라타아제와 아미다아제 유전자를 확보하게 되었다.
- 또한, GC 분석을 통해서 수용성 분획의 CHBN 기질 분해 정도를 정량적으로 측정하였다(Fig. 6). 분리균 No.
- 예상되는 니트.릴 히드라타아제와 아미다아제 효소 유전자를 클로닝하여 확보하였다. 앞으로 추가적인 연구를 통해 재조합 효소의 대량생산과 효소개량을 수행하면, 고지혈증 치료제인 Atorvastatin 생산에 필요한 ethyl (S)-4-chloro- 3-hydroxybuyrate의 산업적 생산을 달성할 수 있을 것으로 생각된다.
- 냉각, 50℃, 1분; 합성반응, 72℃, 1분). 반응액의 아가로스 전기영동을 수행하고 젤로부터 예상 크기 (약 1.0 kb)의 DNA 조각을 추출하여 염 기서열을 분석 하였다. BLAST Search 프로그램을 이용하여 분석된 염기서열과 가장 유사한 DNA 염기서열을 찾음으로써 선발된 분리균의 동정을 수행하였다.
- 반응을 수행하였다. 분리균의 배양액 50 mL을 원심분리하여 균체를 모은 후 염색체 DNA를 분리하고 이것을 주형 DNA로 사용하여 PCR을 수행하였다. 또한, 514F(5'- CGTGCCAGCAGCCGCGGT-3, )와 1492R (5'-TACGGY- TACCTTGTTACGACTT-3') 프리머를 사용하였다.
- 분리균주의 균체를 초음파분쇄기로 깨고 원심분리하여 수용성 분획과 불용성 분획으로 나눈 후, 각각의 분획에 대한 CHBN 분해활성을 조사하였다. 균체를 이용한 경우와 마찬가지로 두 분획에서 모두 CHBN 분해활성이 관찰되었으며, 특히, 불용성 분획에서는 CHBAm가 뚜렷이 관찰되었다(Fig.
- 분리균주의 배양시간에 따른 효소 생산량을 확인하기 위해서 £-카프로락탐이 첨가된 LB배지에서 48시간동안 배양하면서 6시간 간격으로 샘플링하여 미생물 균체의 CHBN 기질 분해활성을 측정하였다. 그 결과, 18시간 이상 배양하면 배양된 균체(4 mL 배양액에 해당되는 균체)가 반응에 사용한 기질(10 卩L)을 모두 산으로 전환하는 것이 확인되었다 (자료 미제시).
- 분리균주의 유도물질에 따른 효소 발현 정도를 조사하기 위해서 벤조니트릴과 £-카프로락탐을 첨가하여 분리균을 배양하였다. 분리균을 3(TC에서 48시간 동안 배양하고 미생물 균체의 CHBN 분해활성을 측정해본 결과, e-카프로락탐을 첨가한 경우에는 분해 활성이 나타났으나, 벤조니트릴만 첨가하였거나, 둘 다 배제한 배지에서 배양한 경우에는 분해 활성이 전혀 나타나지 않았다(Fig.
- 선발된 분리균의 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위해서 PCR 반응을 수행하였다. 분리균의 배양액 50 mL을 원심분리하여 균체를 모은 후 염색체 DNA를 분리하고 이것을 주형 DNA로 사용하여 PCR을 수행하였다.
- 1 mL를 섞고 CHBN 기질 20 皿 를 첨가한 후, 3UC에서 회전시키며 반응을 수행하였다. 일정한 시간동안(0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6 시간) 반응을 수행하고 1 N 염산 0.1 mL를 넣어줌으로써 반응을 중지시켰다.
- 5)를 이용하여 물질을 전개하였다. 전개된 유리판에 발색시약(9.2 mL /^-anisaldehyde, 3.75 mL acetic acid, 338 mL 95% ethanol, 12.5 mL sulfuric acid)을 적시고 가열하면서 발색반점을 관찰하였다.
- 5 kb)의 PCR 산물을 추출하여 pGEM-T 벡터 시스템을 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 각 샘플들의 염기서열을 분석하고, 염기서 열로부터 아미노산 서 열을 읽고 Meg- Alignment 프로그램을 이용하여 기존에 보고된 효소의 아미노산 서열과 비교하였다.
- PCR 반응을 다음 조건에서 수행하였다 (열변성, 95℃, 1분; 냉각, 43℃, 1분; 합성반응, 72℃, 2분). 합성된 DNA 조각의 아가로스 전기영동을 수행하고 젤로부터 예상하는 크기 (a-, 0서브유니트, 약 0.6 kb; 아미다아제, 약 1.5 kb)의 PCR 산물을 추출하여 pGEM-T 벡터 시스템을 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 각 샘플들의 염기서열을 분석하고, 염기서 열로부터 아미노산 서 열을 읽고 Meg- Alignment 프로그램을 이용하여 기존에 보고된 효소의 아미노산 서열과 비교하였다.
대상 데이터
- 분리균의 배양액 50 mL을 원심분리하여 균체를 모은 후 염색체 DNA를 분리하고 이것을 주형 DNA로 사용하여 PCR을 수행하였다. 또한, 514F(5'- CGTGCCAGCAGCCGCGGT-3, )와 1492R (5'-TACGGY- TACCTTGTTACGACTT-3') 프리머를 사용하였다.
- 한국생명공학연구원으로부터 제공받았다 . 반응 기질인 4- chloro-3-hydroxy butyronitrile(CHBN)과 표준물질로 사용된 4-chloro-3-hydroxy butyTamide(CHBAm)와 4-chloro-3-hydroxy butyric acid(CHBAc)는 (주)이큐스팜으로부터 제공받았다. 그 밖의 시 약은 일반 시약급으로 사용하였다.
- 중간체이다. 본 연구에서는 토양 분리균 중에서 4- chloro-3-hydroxy butyronitrile(CHBN)기질로부터 고지혈증치료제인 Atorvastatin을 합성호}는 데에 필요한 4-chloro-3- hydroxy butyric acid(CHBAc)를 생성하는 균주 2종류를 선발하였다. 16S rRNA 분석을 통해서 균 동정을 수행한 결과, 모두 Rhodococcus erythropolis에 속하는 것으로 밝혀졌으며, TLC 분석 결과로부터 CHBN 기질을 분해하는 효소는 니트릴 히드라타아제 (NHase)와 아미다아제 (amidase)인것으로 추정되었다.
- 실험에 사용된 분양균주와 토양 분리균주는 (주)이큐스팜과 한국생명공학연구원으로부터 제공받았다 . 반응 기질인 4- chloro-3-hydroxy butyronitrile(CHBN)과 표준물질로 사용된 4-chloro-3-hydroxy butyTamide(CHBAm)와 4-chloro-3-hydroxy butyric acid(CHBAc)는 (주)이큐스팜으로부터 제공받았다.
- 기존에 보고된 효소의 유전자 염기서열로부터 프리머를 제조하고 PCR을 수행함으로써 분리균.으로부터 니트릴 히드라타아제와 아미다아제 유전자를 확보하게 되었다. 발굴된 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 이미 보고된 Rhodococcus erythropolis^ 니트릴 히드라타아제 a-서브유니트과 0-서브유니트 및 아미다아제와 96% 이상의 상동성을 보였다.
데이터처리
- 0 kb)의 DNA 조각을 추출하여 염 기서열을 분석 하였다. BLAST Search 프로그램을 이용하여 분석된 염기서열과 가장 유사한 DNA 염기서열을 찾음으로써 선발된 분리균의 동정을 수행하였다.
이론/모형
- 균체와 세포추출물의 CHBN 기질에 대한 분해활성을 박막 크로마토그래피 방법으로 측정 하였다. CHBN 분해반응을 수행하고 원심분리하여 얻은 상등액 20 卩1를 실리카 유리판에 첨가하고 혼합용매 (hexane : ethyl acetate : acetic acid = 2:3: 0.
성능/효과
- erythropolis 균으로부터 이미 보고된 니트릴 히드라타아제 a-서브유니트와 0서브유니트 및 아미다아제 유전자를비교분석하여 [4, 8, 11] PCR 반응을 수행하기 위한 프리머를제작하고 분리균의 염색체에 대한 PCR 반응을 수행한 결과, 예상된 크기의 DNA 조각을 얻게 되었다. 확보된 DNA 조각의 염기서열을 분석하고 기존의 효소와 비교해 본 결과, 분리균 No. 5의 니트릴 히드라타아제("서브유니트와 件서브유니트 및 아미다아제는 기존 효소(AAP57640, P22984) 와 각각 아미노산이 2개 , 1개 , 17개씩 차이를 보여서 99.0%, 99.5%, 96.7%의 상동성을 지녔다. 분리균 No.
- 본 연구에서는 토양 분리균 중에서 4- chloro-3-hydroxy butyronitrile(CHBN)기질로부터 고지혈증치료제인 Atorvastatin을 합성호}는 데에 필요한 4-chloro-3- hydroxy butyric acid(CHBAc)를 생성하는 균주 2종류를 선발하였다. 16S rRNA 분석을 통해서 균 동정을 수행한 결과, 모두 Rhodococcus erythropolis에 속하는 것으로 밝혀졌으며, TLC 분석 결과로부터 CHBN 기질을 분해하는 효소는 니트릴 히드라타아제 (NHase)와 아미다아제 (amidase)인것으로 추정되었다. 분리균의 CHBN 분해효소는 £-카프로락탐에 의해서 발현이 유도되었으며, 균체와 세포 추출액에서 모두 기질 분해활성을 나타났다.
- erythropolis (AAP57640). C. Amidases of Rhodococcus No. 5 and No. 7 were compared with that of R. erythropolis (P22984).
- 30。。에서 24시간 동안 수행하고 박막크로마토그래피를 이용해서 물질분석을 수행한 결과, 총 19개의 균주 중에서 3개가 CHBN 기질을 분해하여 (CHBAc)을 생성하는 것으로 밝혀졌다(Table 1, Fig. 2). 이 중에서 기질 분해활성이 크고 재현성이 있는 분리 균주 No.
- 결론적으로 본 연구에서는 균주은행에서 분양받은 균과 토양 분리균으로부터 CHBN 분해활성을 지닌 균을 두 종류 찾아내었으며, 이들 균에서 CHBN의 분해과정에 관여하는 것으로 예상되는 니트.릴 히드라타아제와 아미다아제 효소 유전자를 클로닝하여 확보하였다.
- 분해활성을 조사하였다. 균체를 이용한 경우와 마찬가지로 두 분획에서 모두 CHBN 분해활성이 관찰되었으며, 특히, 불용성 분획에서는 CHBAm가 뚜렷이 관찰되었다(Fig. 5, lane 4 and 8). 이것은 R.
- 분해활성을 측정하였다. 그 결과, 18시간 이상 배양하면 배양된 균체(4 mL 배양액에 해당되는 균체)가 반응에 사용한 기질(10 卩L)을 모두 산으로 전환하는 것이 확인되었다 (자료 미제시).
- 발굴된 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 이미 보고된 Rhodococcus erythropolis^ 니트릴 히드라타아제 a-서브유니트과 0-서브유니트 및 아미다아제와 96% 이상의 상동성을 보였다. 따라서 CHBN기질은 분리 균의 니트릴 히드라타아제와 아미다아제 효소에 의해서 아미 (CHBAm)를 거쳐 산(CHBAc)으로 전환되는 것을 알게 되었다.
- 7의 경우에도 니트릴 히드라타아제와 아미다아제에 의해서 니트릴 기질이 분해되어짐을 보여주었다. 또한, 이러한 결과는 아미다아제가 불용성 분획보다는 수용성 분획에 많이 포함되어 있음을 의미하였다.
- 으로부터 니트릴 히드라타아제와 아미다아제 유전자를 확보하게 되었다. 발굴된 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 이미 보고된 Rhodococcus erythropolis^ 니트릴 히드라타아제 a-서브유니트과 0-서브유니트 및 아미다아제와 96% 이상의 상동성을 보였다. 따라서 CHBN기질은 분리 균의 니트릴 히드라타아제와 아미다아제 효소에 의해서 아미 (CHBAm)를 거쳐 산(CHBAc)으로 전환되는 것을 알게 되었다.
- 벤조니트릴과 £-카프로락탐을 첨가하여 분리균을 배양하였다. 분리균을 3(TC에서 48시간 동안 배양하고 미생물 균체의 CHBN 분해활성을 측정해본 결과, e-카프로락탐을 첨가한 경우에는 분해 활성이 나타났으나, 벤조니트릴만 첨가하였거나, 둘 다 배제한 배지에서 배양한 경우에는 분해 활성이 전혀 나타나지 않았다(Fig. 4). 이것은 £-카프로락탐에 의해서 CHBN 기질 분해 효소의 발현이 유도되어진다는것을 보여주었다.
- 16S rRNA 분석을 통해서 균 동정을 수행한 결과, 모두 Rhodococcus erythropolis에 속하는 것으로 밝혀졌으며, TLC 분석 결과로부터 CHBN 기질을 분해하는 효소는 니트릴 히드라타아제 (NHase)와 아미다아제 (amidase)인것으로 추정되었다. 분리균의 CHBN 분해효소는 £-카프로락탐에 의해서 발현이 유도되었으며, 균체와 세포 추출액에서 모두 기질 분해활성을 나타났다. 기존에 보고된 효소의 유전자 염기서열로부터 프리머를 제조하고 PCR을 수행함으로써 분리균.
- 분리균주 No. 5와 No. 7의 16S rRNA에 대한 염기서열 (-920 bp)을 분석한 결과, 둘 다 Rhodococcus 균의 16S rRNA와 매우 높은 상동성을 나타냈으며, 특히, R. erythropolis EPW十의 16S rRNA와 각각 99.9%, 100%의 상동성을 보였다(Fig. 3). 이 결과로부터 분리균주를 각각 Rhodococcus erythropolis No.
- 3). 이 결과로부터 분리균주를 각각 Rhodococcus erythropolis No. 5오} Rhodococcus erythropolis No. 7로 명명하였다.
후속연구
- 릴 히드라타아제와 아미다아제 효소 유전자를 클로닝하여 확보하였다. 앞으로 추가적인 연구를 통해 재조합 효소의 대량생산과 효소개량을 수행하면, 고지혈증 치료제인 Atorvastatin 생산에 필요한 ethyl (S)-4-chloro- 3-hydroxybuyrate의 산업적 생산을 달성할 수 있을 것으로 생각된다.
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