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문제 정의
- 본 연구에서는 *H NMR spectroscopy를 이용하여 식물세포 내 GABA의 정량분석체계를 확립하고 이를 활용하여여 러 식물세포주로부터 GABA 함량이 높은 세포주를 선발하고 현탁배양세포의 배양환경조건 규명을 통해 고수의 현탁 배양세포로부터 GABA의 대량생산에 미치는 영향을 규명하였다.
제안 방법
- 005% w/v TSP-t/4: sodium salt of trimethylsilyl- propionic acid 첨가) 를 첨가하여 잘 혼합하였다. Eppendorf tube를 50℃ 수조에 넣고 10분간 반응시 킨 후 whole cell extract를 13, 000 rpm에서 5분간 상온에서 원심분리한 다음 상층액 750 ㎕를 5 mm NMR tube로 옮겨 각각 NMR 스펙트럼을 조사하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Unity 500 NMR spectrometer를 사용하여 조사하였으며 수분 peak는 presaturation pulse를 통해 제거하였다.
- GABA의 NMR 스펙트럼 데이터 (Figure 1)로부터 정량분석 모델을 확립하기위하여 순수 GABA standard의 농도별 스펙트럼데이터로부터 calibration curve를 조사하였다. 먼저 순수 GABA standard의 *H NMR 스펙트럼을 조사한 결과 GABA의 ]H NMR상에서 주요 proton signale chemical shift 1.
- GABA의 정량분석 모델 확립를 위해 GABA (Sigma Co) standard를 1 ml/] DQCDsOD (80:20, 0.005% w/v TSP/4: sodium salt of trimethylsilylpropionic acid 첨 가) 혼합 용액 에 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 5 mg/mL 농도로 첨가한 다음 5 mm NMR tube로 옮겨 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다. 순수 GABA standaTd의 NMR 스펙트럼 조사 및 데이터 가공은 상기의 식물세포 주로부터 NMR 스펙트럼 데이터 가공방법과 동일한 방법을 사용하였으며 각 시료당 3개의 반복구를 준비하여 *H NMR 스펙트럼을 조사하였다.
- 동일한 배양조건에서 배양을 유지하였으며 배양 초기에는 GABA의 양적변동이 미미하므로 배양 2주, 3주 4주 경과된 배양세포를 수거하였다. 현탁배양세포의 배양, 동결 및 분말 준비과정 그리고 whole cell extract 제조과정은 상기 단계와 동일한 방법으로 준비하였다 ‘H NMR 스펙트럼 조사 및 스펙트럼 데이터 가공 및 GABA 정량분석 역시 상기한 바와 동일한 방법으로 조사하였다.
- Eppendorf tube를 50℃ 수조에 넣고 10분간 반응시 킨 후 whole cell extract를 13, 000 rpm에서 5분간 상온에서 원심분리한 다음 상층액 750 ㎕를 5 mm NMR tube로 옮겨 각각 NMR 스펙트럼을 조사하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Unity 500 NMR spectrometer를 사용하여 조사하였으며 수분 peak는 presaturation pulse를 통해 제거하였다. 각 스펙트럼은 60회 반복 측정하여 평균 스펙트럼을 확보하였으며 시료에 첨가된 TSP-d4를 이용하여 'H NMR 아icmical shifts를 0.
- NMR 스펙트럼은 Varian Unity 500 NMR spectrometer를 사용하여 조사하였으며 수분 peak는 presaturation pulse를 통해 제거하였다. 각 스펙트럼은 60회 반복 측정하여 평균 스펙트럼을 확보하였으며 시료에 첨가된 TSP-d4를 이용하여 'H NMR 아icmical shifts를 0.00 ppm으로 조정하였다. 각 시료당 3개의 반복구를 준비하여 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다.
- 00 ppm으로 조정하였다. 각 시료당 3개의 반복구를 준비하여 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다.
- 각 식물세포주로부터 얻어진 'H NMR 스펙트럼 데이터의 processing 및 normalizatione ADVASP Lite (short version of ADVASP package, Umatek Inc.)를 이용하여 ASCII 파일로 전환하였으며 각 스페트럼의 세기는 internal standard로 첨가한 TSP/4의 peak 세기를 기준으로 각 시료의 peak scale 을 조정하였다. 각각의 *H NMR 스펙트럼의 data 간격은 12.
- 각각의 식물세포주는 생장조절제의 영향을 제거하기 위하0 모두 동일한 1 mg/L 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 MS (Murashige and Skoog 1962) 액체배지에서 100 rpm으로 25℃ 항온기에서 암배양하였다. 또한 계대배양 시기의 차이에 따른 생장상태의 효과를 최소화시키기위하여 각각의 식물세포주별로 2-3회 계대배양을 통해 활발한 증식이 이루어지도록 조정한 후 GABA를 분석하였다 GABA 분석을 위해 활발한 증식이 이루어지고 있는 각각의 세포주 (생중량 약 2 g)를 동일한 배지 (1 m&L 2, 4-D가 첨가된 MS 액체배지)가 50 mL씩 첨가한 Erlenmeyer flask에 옮긴 다음 100 rpm으로 25℃ 항온기에서 2주간 암배양하였다.
- 유지하였다. 계대배양 개시후 각각 3, 7, 10, 14, 21, 28일째 배양세포를 수거하였으며 각 처리구당 3개의 반복 구를 준비하였다. 이후 현탁배양세포의 동결 및 분말 준비과정 그리고 whole cell extract 제조과정은 상기 단계와 동일한방법으로 준비하였다.
- 계대배양후 2주 경과된 현탁배양세포를 수거하여 배양세포 약 2 g (생중량)을 상기와 동일한 액체배지로 옮겼으며 배지내 2, 4-D 농도는 각각 0, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3, 10 mg/L로 조정하였다. 동일한 배양조건에서 배양을 유지하였으며 배양 초기에는 GABA의 양적변동이 미미하므로 배양 2주, 3주 4주 경과된 배양세포를 수거하였다.
- 고수 현탁배양세포로부터 배지내 2, 4-D 농도가 세포 내 GABA의 함량변화에 미치는 영향을 조사하였다. 계대배양후 2주 경과된 현탁배양세포를 수거하여 배양세포 약 2 g (생중량)을 상기와 동일한 액체배지로 옮겼으며 배지내 2, 4-D 농도는 각각 0, 0.
- 5, 1, 3, 10 mg/L로 조정하였다. 동일한 배양조건에서 배양을 유지하였으며 배양 초기에는 GABA의 양적변동이 미미하므로 배양 2주, 3주 4주 경과된 배양세포를 수거하였다. 현탁배양세포의 배양, 동결 및 분말 준비과정 그리고 whole cell extract 제조과정은 상기 단계와 동일한 방법으로 준비하였다 ‘H NMR 스펙트럼 조사 및 스펙트럼 데이터 가공 및 GABA 정량분석 역시 상기한 바와 동일한 방법으로 조사하였다.
- (Figure 4). 따라서 9개의 식물세포주 가운데서 고수 세포주를 선발하였으며 이후 고수 배양세포로부터 GABA 함량분석을 실시하였다.
- 각각의 식물세포주는 생장조절제의 영향을 제거하기 위하0 모두 동일한 1 mg/L 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 MS (Murashige and Skoog 1962) 액체배지에서 100 rpm으로 25℃ 항온기에서 암배양하였다. 또한 계대배양 시기의 차이에 따른 생장상태의 효과를 최소화시키기위하여 각각의 식물세포주별로 2-3회 계대배양을 통해 활발한 증식이 이루어지도록 조정한 후 GABA를 분석하였다 GABA 분석을 위해 활발한 증식이 이루어지고 있는 각각의 세포주 (생중량 약 2 g)를 동일한 배지 (1 m&L 2, 4-D가 첨가된 MS 액체배지)가 50 mL씩 첨가한 Erlenmeyer flask에 옮긴 다음 100 rpm으로 25℃ 항온기에서 2주간 암배양하였다. 배양 후 각각의 현탁배양세포를 수거하여 멸균수로 수세한 다음 액체질소에 넣고 급속 냉동하였으며 막자사발을 이용하여 분쇄하였다.
- 또한 고수 배양세포를 이용하여 배양기간에 따른 세포 내 GABA의 함량변화를 조사하기 위하여 계대배양후 2주경과된 현탁배양세포를 수거하여 배양세포 약 2 g (생중량) 을 상기의 동일한 액체배지로 옮겨 동일한 배양조건에서 배양을 유지하였다. 계대배양 개시후 각각 3, 7, 10, 14, 21, 28일째 배양세포를 수거하였으며 각 처리구당 3개의 반복 구를 준비하였다.
- 먼저 순수 GABA standard의 *H NMR 스펙트럼을 조사한 결과 GABA의 ]H NMR상에서 주요 proton signale chemical shift 1.89, 2.29, 3.01 ppm에서 peaks를 나타냈으며 고유 chemical shift 1.89, 2.29, 3.01 ppm에서 peak intensity를 적분흐卜여 실제 GABA 농도와 선형회귀 모델을 제작하였다 (Figure 2). 이는 NMR 스펙트럼상의 1.
- 본 연구를 통하여 식물 현탁배양세포의 whole cell extract 로부터 'HNMR 스펙트럼 데이터의 통계분석기법을 이용하여 간단하고 신속하게 GABA를 정량적으로 분석할 수 있는 모델을 확립하였으며 고수 현탁배양세포로부터 GABA의 생산성 변화에 미치는 배지내 생장조절제 (2.4-D) 및 배양 기간의 영향을 규명하였다. 본 분석방법으로 다양한 식물자원으로부터 GABA의 생산성을 초고속탐색 (high-throughput sc- reenig)할 수 있을 것이며 고수 현탁세포배양법으로 GABA의 상업적 대량생산이 가능할 것으로 전망된다.
- 5, 1, 5 mg/mL 농도로 첨가한 다음 5 mm NMR tube로 옮겨 'H NMR 스펙트럼을 조사하였다. 순수 GABA standaTd의 NMR 스펙트럼 조사 및 데이터 가공은 상기의 식물세포 주로부터 NMR 스펙트럼 데이터 가공방법과 동일한 방법을 사용하였으며 각 시료당 3개의 반복구를 준비하여 *H NMR 스펙트럼을 조사하였다. 순수 GABA의 'H NMR 스펙트럼 조사 결과 1.
- 순수 GABA standaTd의 NMR 스펙트럼 조사 및 데이터 가공은 상기의 식물세포 주로부터 NMR 스펙트럼 데이터 가공방법과 동일한 방법을 사용하였으며 각 시료당 3개의 반복구를 준비하여 *H NMR 스펙트럼을 조사하였다. 순수 GABA의 'H NMR 스펙트럼 조사 결과 1.89, 2.29, 3.01 ppm에서 GABA의 고유한 chemical shift 값을 알 수 있었으며 이를 통해 GABA 의 'H NMR 스펙트럼 데이터로부터 정량분석을 위한 stan- dard의 calibration curve를 조사하였다.
- 식물 현탁배양세포로부터 NMR 분석을 위해 동결 건조된 각각의 세포주 분말 15 mg을 취하여 Eppendorf tube (1.5 mL)로 옮긴 다음 1 mL의 DQCDaOD (80:20, 0.005% w/v TSP-t/4: sodium salt of trimethylsilyl- propionic acid 첨가) 를 첨가하여 잘 혼합하였다. Eppendorf tube를 50℃ 수조에 넣고 10분간 반응시 킨 후 whole cell extract를 13, 000 rpm에서 5분간 상온에서 원심분리한 다음 상층액 750 ㎕를 5 mm NMR tube로 옮겨 각각 NMR 스펙트럼을 조사하였다.
- 식물현탁배양세포의 whole cell extract의 'H NMR 스펙트럼 데이터로부터 통계분석기법을 활용하여 GABA의 간단하고 신속한 정량분석방법을 확립하였다. 이 기술을 활용하여 고등식물 8종의 9개 세포주를 MS 배지에 1 mg/L 의 2, 4-D를 첨가한 배지에 유지하였을 때 고수 (Coriandrum sativum L.
- 신속한 정량분석방법을 확립하였다. 이 기술을 활용하여 고등식물 8종의 9개 세포주를 MS 배지에 1 mg/L 의 2, 4-D를 첨가한 배지에 유지하였을 때 고수 (Coriandrum sativum L.)가 가장 많은 양의 GABA를 생산하였다. 고수 현탁 배양세포로부터 2, 4-D농도 및 배양기간에 따른 GABA의 생산성 변화를 조사한 결과 현탁배양세포를 0.
이론/모형
- 0 에서 0 ppm으로 조정하였다. 이와 같이 가공된 NMR 스펙트럼 데이터는 Matlab (version 6.5)에 도입하여 GABA의 정량분석을 수행하였다.
성능/효과
- 9 mg으로 가장 높았으며 다음으로 1 mg/L 2, 4-D 처리구 3주 배양세포에서 14 mg 이 었다 (Figure 5). 3 mg/L 이상의 고농도 2, 4-D 처리구에서는 배양기간이 지속될수록 GABA 함량이 감소가 보다 빠른 속도로 진행되었다. 반대로 0.
- )가 가장 많은 양의 GABA를 생산하였다. 고수 현탁 배양세포로부터 2, 4-D농도 및 배양기간에 따른 GABA의 생산성 변화를 조사한 결과 현탁배양세포를 0.5 mg/L 2, 4-D 가 첨가된 배지에서 3주간 배양된 현탁배양세포를 이용할 경우 GABA 함량이 건중량 1 g 당 16.9 mg으로 가장 높게 생산되었다. 본 연구에서 확립된 간단하고 신속한 분석법으로 다양한 식물자원으로부터 GABA의 생산성을 초고속탐색 (high-throughput screenig)할 수 있을 것이며 고수 현탁 세포배양법으로 GABA의 상업적 대량생산이 가능할 것으로 전망된다.
- 9 mg으로 가장 높게 생산됨을 알 수 있었다. 고수 현탁배양세포로부터 GABA 의 함량은 본 연구그룹에서 발아 현미내 GABA의 함량를동일 분석방법으로 비교분석한 결과 약 7.4배 정도 증가한 것이다(데이터 미제시). 따라서 고수 배양세포로부터 배양환경 조건 개선을 통해 GABA의 대량생산을 통한 상업화가 가능할 것으로 예상된다.
- 고수 현탁배양세포의 배양기간에 따른 *H NMR 스펙트럼 조사 결과 계대배양 초기에는 GABA의 양적 변동이 거의 이루어지지 않는 상태로 약 2주간 유지되지만 배양 3주부터 GABA의 함량이 건중량 1 g 당 9.3 mg으로 약 2 배가량 증가된다. (Figure 5).
- 1986) 등이 일반적으로 이용되고 있다. 그러나 이들 분석방법은 사전 준비과정이 복잡하고 시간이 많이 소요될 뿐 아니라 측정 시료간의 재현성이 높지 않다 본 연구에서는 GABA 함량 분석을 위해 whole cell extract로부터 얻어진 'H NMR 스펙트럼 데이터의 통계분석 기법을 활용함으로써 여러 식물세포주로부터 간편하며 재현성과 정확성이 높은 GABA 정량분석법을 확립할 수 있었다.
- 일반적으로 식물배양 세포에서 배양 3주는 배지내에서 세포의 증식이 극에 달하여 더 이상의 세포 증식이 이루어지지 않는 정체기 단계로 사료된다. 따라서 배양 3주 세포에서 GABA의 함량증가는 세포 밀도증가에 따른 양분 결핍이 주요한 스트레스원으로 작용하여 GABA 함량 증가에 관여하였고 고수 현탁배양에서 GABA 의 함량이 최대가 되는 시기는 정체기인 것으로 추측된다.
- 3 mg/L 이하의 저농도 2, 4-D 처리구에서는 배양 3주에서 GABA 함량이 최대가 되며 이후 4주까지 GABA 함량이 유지되었다. 따라서 본 연구를 통하여 고수의 현탁배양세포를 0.5 mg/L 2, 4-D가 첨가된 배지에서 3주간 배양된 현탁배양세포를 이용할 경우 GABA 함량이 건중량 1 g 당 16.9 mg으로 가장 높게 생산됨을 알 수 있었다. 고수 현탁배양세포로부터 GABA 의 함량은 본 연구그룹에서 발아 현미내 GABA의 함량를동일 분석방법으로 비교분석한 결과 약 7.
- 3 mg/L 이상의 고농도 2, 4-D 처리구에서는 배양기간이 지속될수록 GABA 함량이 감소가 보다 빠른 속도로 진행되었다. 반대로 0.3 mg/L 이하의 저농도 2, 4-D 처리구에서는 배양 3주에서 GABA 함량이 최대가 되며 이후 4주까지 GABA 함량이 유지되었다. 따라서 본 연구를 통하여 고수의 현탁배양세포를 0.
- 배지내 2, 4-D 농도가 고수 배양세포 내 GABA 함량변화에 미치는 영향을 조사한 결과 0.5 mg/L 2, 4-D가 첨가된 배지에서 3주간 배양된 세포에서 GABA의 함량이 건중량 1 g 당 16.9 mg으로 가장 높았으며 다음으로 1 mg/L 2, 4-D 처리구 3주 배양세포에서 14 mg 이 었다 (Figure 5). 3 mg/L 이상의 고농도 2, 4-D 처리구에서는 배양기간이 지속될수록 GABA 함량이 감소가 보다 빠른 속도로 진행되었다.
- 식물 현탁배양세포로부터 'H NMR 스펙트럼을 조사한 결과 9개의 식물세포주의 전체적인 대사물질의 패턴은 상이하였으며 특히 GABA의 proton signale 큰 차이를 보였다 (Figure 3). NMR 스펙트럼상의 peak intensity7]- 화합물의 양적 변화와 상관관계가 높으므로 NMR 스펙트럼만으로도 GABA의 정성적 정량적 분석이 가능하다.
- 식물 현탁배양세포로부터 GABA의 정량분석을 위해 상기의 GABA standard의 NMR 스펙트럼 데이터 processing 과 동일한 방법으로 데이터 가공 후 상기 단계에서 확립한 GABA 정량모델을 이용하여 각 세포주 별 정량분석 결과 고수가 건중량 약 1 g 당 13 mg 으로 가장 높았으며 다음으로 가시오갈피 였고 고구마가 9개의 식물세포주중에서 가장 낮았다 (Figure 4). 따라서 9개의 식물세포주 가운데서 고수 세포주를 선발하였으며 이후 고수 배양세포로부터 GABA 함량분석을 실시하였다.
후속연구
- 4배 정도 증가한 것이다(데이터 미제시). 따라서 고수 배양세포로부터 배양환경 조건 개선을 통해 GABA의 대량생산을 통한 상업화가 가능할 것으로 예상된다.
- 그러나 이들 분석방법은 사전 준비과정이 복잡하고 시간이 많이 소요될 뿐 아니라 측정 시료간의 재현성이 높지 않다. 따라서 보다 신속하고 재현성이 높은 GAB A 의 정량 분석 방법이 확립된다면 GABA의 대량생산 연구에 효율적인 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 4-D) 및 배양 기간의 영향을 규명하였다. 본 분석방법으로 다양한 식물자원으로부터 GABA의 생산성을 초고속탐색 (high-throughput sc- reenig)할 수 있을 것이며 고수 현탁세포배양법으로 GABA의 상업적 대량생산이 가능할 것으로 전망된다.
- 9 mg으로 가장 높게 생산되었다. 본 연구에서 확립된 간단하고 신속한 분석법으로 다양한 식물자원으로부터 GABA의 생산성을 초고속탐색 (high-throughput screenig)할 수 있을 것이며 고수 현탁 세포배양법으로 GABA의 상업적 대량생산이 가능할 것으로 전망된다.
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