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문제 정의
- 본 연구는 곤충에 대한 저항성을 가지는 유전자로 cry1A(c) 를 이용하여 낙동벼에 형질전환을 유도, 혹명나방에 대한 저항성을 가지는 낙동벼를 이용하여 안전성 GM 작물과 non-GM 작물간의 housekeeping gene 에 대한 발현을알아보고자 하였다. 혹명나방에 대한 저항성 유전자를 이입한 벼의 GM 작물에 대한 안전성 평가의 일환으로 GM 작물과 non-GM작물간의 housekeeping gene 의 발현 패 턴을 RT-PCR을 이용하여 확인해 보았다.
- 본 연구에서는 곤충 저항성 유전자를 이입한 벼에서의 housekeeping gene 의 변화를 알아보았으며, 이를 섭취한 마우스에서 주요 장기를 중심으로 housekeeping gene 의 발현을 알아보았다.
제안 방법
- 혹명나방에 대한 저항성 유전자를 이입한 벼의 GM 작물에 대한 안전성 평가의 일환으로 GM 작물과 non-GM작물간의 housekeeping gene 의 발현 패 턴을 RT-PCR을 이용하여 확인해 보았다. GM 작물과 non-GM 작물은 동일한 지역 및 동일한 조건 하에서 재배하였으며, 각기 다른 개체 3종을 무작위로 선별하여 실시하였다. housekeeping gene 은 외부 세포내에서 항상 발현을 하는 유전자로 외부 환경에 크게 영향을 받지 않는 것으로 알려져 있으며, 많은 경우 특이유전자의 발현 등에 대조군으로 쓰이는 유전자이다.
- GM작물과 non-GM 작물을 30일간 먹인 마우스에서 위, 소장, 대장, 신장, 간 등을 절취하여 housekeeping gene 의 발현을 확인해 보았다. 간에서의 housekeeping gene 의 발현패턴은 10 종의 유전자 중 6종에서 큰 차이를 보이지 않았다.
- RT-PCR 을 통하여 10종의 housekeeping gene 의 발현 정도를 non-GM 작물과 GM작물 간에 비교하여 보았으며, 안전성 검사의한 측면에서 이를 30일간 섭취한 마우스의 간, 위, 소장, 대장, 신장, 비장에서 유전자의 발현을 비교하여보았다. 많은 경우 유전자의 발현은 비슷한 경향을 나타내었다.
- The mice were administered to GM and non-GM rice every 2days/cage (A), or every 4 days/body for 30 days.
- 이후 Tri-Reagent 를 이용하여 RNA 추출 과정을 거쳤다. 각 장기별로 housekeeping gene 의 변화정도를 알기 위하여 마우스에서 장기를 적출하였다. 장기 적출은 마취 후 복강을 절개 후 간, 위, 소장, 대장, 신장, 비장의 순으로 적출 하였다 적출된 장기는 액체질소를 이용하여 급속 동결을 하였으며, 동결 후 -70 ℃ 에보관 후 실험 하였다.
- 장기 적출은 마취 후 복강을 절개 후 간, 위, 소장, 대장, 신장, 비장의 순으로 적출 하였다 적출된 장기는 액체질소를 이용하여 급속 동결을 하였으며, 동결 후 -70 ℃ 에보관 후 실험 하였다. 동결된 조직을 막자사발을 이용하여 미세하게 분쇄 후 Tri-Reagent (MRC, USA)를 이용하여 RNA 를 획득 하였다. 획득된 RNA는 RT kit (Intron, korea) 을이 용하여 reverse transcription 반응을 실시하였으며, PCR 반응 조건은 94℃ (30 sec), 55℃ (30 sec), 72℃ (30 sec) 의조건으로 32 cycle 을 실시하였다.
- 마우스(3 mouse/cage)는 BALB/c 5-6 주령을 사용 하였으며, 경북대학교 농과대학 마우스 사육시설에서 사육을 하였다. 쌀을 이용하여 만든 사료는 일반사료와 구별하여 마우스에 섭취도록 하였으며, 30일간 사육하며 2일 간격으로 사료의 섭취량을 측정 하였고, 4일 간격으로 체중 변화를 측정하였다.
- 유전자 이입한 벼와 그렇지 않은 낙동벼를 각각 3개체를 실험실 운반 해 와서 이들의 잎을 각각 액체질소를 이용하여 냉동상태에서 분쇄 하였다. 이후 Tri-Reagent 를 이용하여 RNA 추출 과정을 거쳤다.
- 각 장기별로 housekeeping gene 의 변화정도를 알기 위하여 마우스에서 장기를 적출하였다. 장기 적출은 마취 후 복강을 절개 후 간, 위, 소장, 대장, 신장, 비장의 순으로 적출 하였다 적출된 장기는 액체질소를 이용하여 급속 동결을 하였으며, 동결 후 -70 ℃ 에보관 후 실험 하였다. 동결된 조직을 막자사발을 이용하여 미세하게 분쇄 후 Tri-Reagent (MRC, USA)를 이용하여 RNA 를 획득 하였다.
- non-GM 작물간의 housekeeping gene 에 대한 발현을알아보고자 하였다. 혹명나방에 대한 저항성 유전자를 이입한 벼의 GM 작물에 대한 안전성 평가의 일환으로 GM 작물과 non-GM작물간의 housekeeping gene 의 발현 패 턴을 RT-PCR을 이용하여 확인해 보았다. GM 작물과 non-GM 작물은 동일한 지역 및 동일한 조건 하에서 재배하였으며, 각기 다른 개체 3종을 무작위로 선별하여 실시하였다.
- 동결된 조직을 막자사발을 이용하여 미세하게 분쇄 후 Tri-Reagent (MRC, USA)를 이용하여 RNA 를 획득 하였다. 획득된 RNA는 RT kit (Intron, korea) 을이 용하여 reverse transcription 반응을 실시하였으며, PCR 반응 조건은 94℃ (30 sec), 55℃ (30 sec), 72℃ (30 sec) 의조건으로 32 cycle 을 실시하였다. PCR primer 로는 housekeeping gene 으로 벼의 경우 18S rRNA, 25S rRNA, eEF-1a, GAPDH, UBQ 5, Q-TUB, eIF-4a, UBQ10, UBQ5, ACT 11 등 10 종이며 (Table 1), 마우스의 경우는 Beta-actin, B2m, G6pd2, GAPDH, Gyk, Gus, Hprt, Cyclophlin A, Tbp, Tfrc, Tubulin alpha, RPL13A 등 11 종을 이용하였다 (Table 2).
대상 데이터
- 획득된 RNA는 RT kit (Intron, korea) 을이 용하여 reverse transcription 반응을 실시하였으며, PCR 반응 조건은 94℃ (30 sec), 55℃ (30 sec), 72℃ (30 sec) 의조건으로 32 cycle 을 실시하였다. PCR primer 로는 housekeeping gene 으로 벼의 경우 18S rRNA, 25S rRNA, eEF-1a, GAPDH, UBQ 5, Q-TUB, eIF-4a, UBQ10, UBQ5, ACT 11 등 10 종이며 (Table 1), 마우스의 경우는 Beta-actin, B2m, G6pd2, GAPDH, Gyk, Gus, Hprt, Cyclophlin A, Tbp, Tfrc, Tubulin alpha, RPL13A 등 11 종을 이용하였다 (Table 2). 유전자 발현 정도의 차이는 gel-doc program (Bio-rad, Italy) 을 이용하여 band density 를 측정하였으며, 이를 엑셀 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- 만들었다. 마우스(3 mouse/cage)는 BALB/c 5-6 주령을 사용 하였으며, 경북대학교 농과대학 마우스 사육시설에서 사육을 하였다. 쌀을 이용하여 만든 사료는 일반사료와 구별하여 마우스에 섭취도록 하였으며, 30일간 사육하며 2일 간격으로 사료의 섭취량을 측정 하였고, 4일 간격으로 체중 변화를 측정하였다.
- 실험에 사용된 형질전환 된 벼는 곤충저항성 유전자인 cry1A 가 형질전환 되어 있는 낙동벼와 이 유전자가 삽입되지 않은 벼를 농촌진흥청 생물안전성센터에서 분양받아 사용하였다.
데이터처리
- PCR primer 로는 housekeeping gene 으로 벼의 경우 18S rRNA, 25S rRNA, eEF-1a, GAPDH, UBQ 5, Q-TUB, eIF-4a, UBQ10, UBQ5, ACT 11 등 10 종이며 (Table 1), 마우스의 경우는 Beta-actin, B2m, G6pd2, GAPDH, Gyk, Gus, Hprt, Cyclophlin A, Tbp, Tfrc, Tubulin alpha, RPL13A 등 11 종을 이용하였다 (Table 2). 유전자 발현 정도의 차이는 gel-doc program (Bio-rad, Italy) 을 이용하여 band density 를 측정하였으며, 이를 엑셀 프로그램을 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- Cry1Aa toxin에 대한 마우스를 이용한 사이토카인의 profle을 확인한 결과 mouse spleen cell 에서 매우 낮은 레벨의 Th1 (IFN-y, IL-12p70) 과 Th2 (IL-10, IL-4) 의 발현 양상을 나타내었다. 반면 Cry1Aa 에 immunization 된 마우스에서 이들의 spleen cell 을 다시 Cry1Aa 로 자극하면 IL-12p70 의 활성이 증가하는 것으로 나타났다(14).
- 각종 호르몬의 영향이라든지(10), 성장 정도(11) 등에 의해 차이가 나는 만큼 보다 적절한 조직에 적절한 마커의 housekeeping gene 을 찾고자 하고 있다(12). GM 작물과 non-GM 작물 간에 house keeping gene 인 18S rRNA, 25S rRNA, eEF-1a, GAPDH, UBQ 5, ©TUB, eIF-4a, UBQ10, UBQ5, ACT 11 등의 발현차이를 RT-PCR 을 통하여 확인해 본 결과 눈에 띄는 큰 차이는 보이지 않았다. Fig.
- GM 작물과 non-GM 작물에서 나온 수확물인 쌀을 이용하여 일반 마우스 사료와 1:1로 썩어 Balb/c (5~6 주령)에 30일간 먹인 다음 2일마다 사료 섭취량을 조사한 결과 일반사료와 비교하여 볼 때 큰 차이를 나타내지 않았다. 마리당 약 2 ~ 3 g 정도를 매일 섭취하는 것으로 나타났으며, 쌀을 이용하여 만든 사료의 처음 2일 동안 섭취량이 다소 줄어든 것을 알 수 있었는데, 이는 사료의 변화로 인한 적응 기간으로 판단된다.
- 소장의 경우에는 a-tubulin 의 경우 non-GM 작물을 섭취한 마우스에서 다소 높은 발현을 보이며 다른 유전자에 대해서는 큰 차이를 보이지 않았다. 대장의 경우에는 Gus 와 Trfc 의 발현 패턴이 상대적으로 크게 차이가 나는 것으로 나타났으며, 신장과 비장에서는 G6pd2, B2m, Gus gene 에서 non-GM 작물을 섭취한 마우스에서 발현이 높게 나타나는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3).
- 마리당 약 2 ~ 3 g 정도를 매일 섭취하는 것으로 나타났으며, 쌀을 이용하여 만든 사료의 처음 2일 동안 섭취량이 다소 줄어든 것을 알 수 있었는데, 이는 사료의 변화로 인한 적응 기간으로 판단된다. 이후 사료 섭취량의 변화는 일반사료와 비교하여 볼 때 큰 차이를 보이지 않았다.
- 1). 벼의 housekeeping gene 의 발현은 성장에 따른 차이를 보여 주는데 10종의 housekeeping gene 의 발현 양상을 비교한 결과 성장과 각개 체간의 차이에 따른 가장 안정적인 housekeeping gene 은 UBQ5 와 eEF-1a 로 알려져 있는데(11) 본 실험 결과에서는 GM 작물에서 다소 증가하는 것으로 나타났다.
- GM 작물은 생산량 증대라는 목적을 달성하면서 미래 식량문제를 해결할 수 있는 가장 유력한 대안 중의 하나로 알려져있지만 한편으로는 안전성 문제에 있어 많은 부분에서 취약함을 보이고 있다. 첫째, 기본적으로 원래 없던 유전자의 도입으로 유전적 패턴의 변화가 일어난다. 이는 유전자에서 발현하는 단백질 발현의 변화를 가져 오는데 원하지 않는 유전자의 발현을 그 예로 들 수 있다.
후속연구
- 하지만 원래 가지고 있지 않은 새로운 유전자가 이입된다는 관점에서 볼 때 이와 같은 작물을 섭취하는 생물의 안전성 측면은 아직 밝혀지지 않은 부분이 많이 있는 것으로 판단된다(15). GM 작물에 대한 안전성을 확보하기 위한 연구의한 방법으로 RNA 의 발현 패턴을 작물과 마우스를 이용하여 확인해 본 결과, housekeeping gene 의 발현에 있어서 많은 부분이 큰 차이를 보이지 않으나, 일부 유전자의 발현에 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다 이에 대한 생물개체의 안전성 연구는 보다 장기적으로 접근하는 것이 유전자변형생물체의 안전성을 이해하는데 도움이 되리라 판단된다.
- 많은 경우 유전자의 발현은 비슷한 경향을 나타내었다. 하지만 몇몇 장기에서 몇 종의 housekeeping gene 의 발현이 차이가 나는 것을 알 수 있었는데 이에 대한 연구는 보다 장기적인 관점에서 실시되어야 할 것으로 사료된다. GM 작물을 먹었을 경우 혹은 이를 이용하는 사료를 먹은 가축들의 경우 이입된 유전자에 의하여 다른 유전자의 발현을 유도 혹은 감소시키는 등의 영향을 주게 되면 세포나 조직에 많은 영향을 주게 된다.
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